CN112924665A - 一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗体辣根过氧化物酶标记物，是由氨基修饰后的抗体(NH2‑Ab)与巯基修饰后的辣根过氧化物酶(SH‑HRP)交联构成，其中所述抗体可以是任意适于抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒的抗体；本发明还公开了所述标记物在制备抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒中的应用。实验证实，将本发明的抗体辣根过氧化物酶标记物与酶稳定剂、稀释液结合使用，能显著提高抗体酶标记物的灵敏度和稳定性、大大降低了检测的背景值，使特异性更好，具有很大的应用前景。

Description

一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用，属于酶免疫技术领域。
背景技术
ELISA(酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
抗原或抗体酶标记物对免疫分析的灵敏度及特异性具有重要的作用，是酶免疫分析检测中的关键试剂。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，是目前最常用的蛋白酶标记物的制备原料。传统的辣根过氧化物酶标抗体，是应用酶和抗体上氨基、巯基或糖蛋白上的羟基作为交联的基团，通过过碘酸钠或戊二醛法将抗体与酶直接连接在一起。由于分子大小不同，一般一个抗体分子上仅能联接1～2个HRP分子，使检测灵敏度受到限制。同时此方法制备的抗体辣根过氧化物酶标记物再后续应用中存在检测本底较高，质量不易控制的缺点，影响ELISA类检测试剂盒的质量。
申请人研究发现利用两种化学交联剂分别与抗体、HRP进行交联，并利用交联剂上基团(NH2-、SH-)自发反应进行连接，可大大提高连接效率，并且易于进行基团配比控制。制备出的抗体辣根过氧化物酶标记物应用于抗原检测试剂盒ELISA法中活性及实验本底均优于过碘酸钠法标记的抗体辣根过氧化物酶标记物。经检索，有关此方法制备的抗体辣根过氧化物酶标记物及其应用目前还鲜见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的问题是提供一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用。
本发明所述抗体辣根过氧化物酶标记物，是由氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)与巯基修饰后的辣根过氧化物酶(SH-HRP)交联构成；其特征在于：所述氨基修饰后的抗体是以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂配制浓度为0.1mg/ml的丁二酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)溶液，取100ul并加入1ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的抗体，37℃反应30分钟制得；所述巯基修饰后的辣根过氧化物酶是以DMF为溶剂配制浓度为33.6mg/ml的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶液，取500ul并加入10ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的辣根过氧化物酶(HRP)，37℃反应30分钟后，再加入终浓度的0.1M甘氨酸和0.1M二硫苏糖醇(DTT)制得；其中，所述抗体辣根过氧化物酶标记物是将氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，加入终浓度的0.1M碘代乙酰胺交联制得。
上述的抗体辣根过氧化物酶标记物中：所述抗体可以是任意适于抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒的抗体，优选的是丙肝抗体、乙肝抗体、抗gCD59的单克隆抗体、猪瘟抗体、小鹅瘟抗体、牛或羊口蹄疫抗体、羊痘抗体或狂犬病抗体。
为长期有效的保存制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物，本发明还公开了一种配套上述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的酶稳定剂，其特征在于：所述酶稳定剂是以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质，加入牛血清白蛋白(BSA)并使其终浓度为10mg/ml，加入kathon并使其终浓度为10ul/ml，加入基质体积量三分之一的甘油制得；酶稳定剂的使用量是抗体辣根过氧化物酶标记物体积量的2～3倍。
实验证实，制备的抗体辣根过氧化物酶标记物若加入此配套酶稳定剂后，可长期稳定至少二年。
本发明还公开了一种配套所述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的稀释液，其特征在于：所述稀释液是以pH7.2、0.1M的PBS为基质，以体积比计，加入20％的新生牛血清，万分之五的Procin300，以重量体积比计，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)，万分之五的氨基比林、千分之五的葡聚糖T2000、2％的蔗糖、1％的甘氨酸制得。
本发明所述抗体辣根过氧化物酶标记物的制备方法，步骤是：
(1)HRP的巯基修饰：
1)辣根过氧化物酶(HRP)100mg用pH7.2、0.1M的PBS 10mL溶解，避光轻轻颠倒混匀2min，避免产生泡沫；
2)SPDP 16.8mg(0.1mM)在1.5mL离心管中用DMF 0.5mL溶解；
3)将2)配制的溶液全部加入1)的溶液中，放置在培养箱中37℃混匀30min；
4)加入1M的DTT溶液230ul，继续放置在培养箱中37℃混匀30min；
5)用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.15M、pH6.0的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液，于2～8℃保存备用；
(2)氨基修饰抗体：
1)以DMF为溶剂配制浓度为0.1mM的SMPB溶液，按此溶液与抗体溶液体积比1:9的量加入浓度为5～30mg/mL抗体溶液，37℃反应30分钟；
2)将步骤1)制得的溶液用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.1M、pH6.8的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到氨基修饰的抗体溶液；
(3)氨基修饰抗体与巯基修饰HRP的交联：
将氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，放置在培养箱中37℃混匀60min，加入终浓度为0.1M碘代乙酰胺，放置在培养箱中37℃混匀30min，交联制得抗体辣根过氧化物酶标记物。
上述P6-DG脱盐柱的预处理方法是：
1)A柱处理：
用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH6.0)冲洗，流速3.0mL/min，使用后冲洗2小时(尽量时间长)；使用前冲洗1小时(尽量时间长)。
2)B柱处理：
用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，流速3.0mL/min；使用后先用0.1M PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗30min,再用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，2小时(尽量时间长)；使用前用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，流速3.0mL/min，冲洗1小时(尽量时间长)。
本发明所述抗体辣根过氧化物酶标记物在制备抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒中的应用。
其中，所述抗体辣根过氧化物酶标记物的应用方法是：以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质加入配套其使用的上述酶稳定剂，再用配套其使用的稀释液进行1:1000±100稀释后用于抗原酶联免疫检测或化学发光检测。
本发明与现有技术比所具有的突出的特点和显著效果是：
1.用氨基修饰抗体，用巯基修饰辣根过氧化物酶；以SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPB(丁二酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯)为化学骨架进行交联。
2.氨基修饰抗体和巯基修饰辣根过氧化物酶在37℃会自发发生NHS反应。
3.研制了一种配套所述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的酶稳定剂，实现了使抗体酶标记物能长期有效保存，至少2年。
4.研制了一种配套所述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的稀释液，实验证实制备的抗体酶标记物经稀释后灵敏度更高，背景值更低。
5.本发明将抗体辣根过氧化物酶标记物与酶稳定剂、稀释液的结合使用，显著提高了抗体酶标记物的灵敏度和稳定性、大大降低了检测的背景值，使特异性更好，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1：P6-DG脱盐柱的预处理
1)A柱处理：
用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH6.0)冲洗，流速3.0mL/min，使用后冲洗2小时(尽量时间长)；使用前冲洗1小时(尽量时间长)。
2)B柱处理：
用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，流速3.0mL/min；使用后先用0.1M PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗30min,再用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，2小时(尽量时间长)；使用前用1*PBS(0.15mM氯化钠、pH7.2)冲洗，流速3.0mL/min，冲洗1小时(尽量时间长)。
实施例2：抗体辣根过氧化物酶标记物的制备
(1)HRP的巯基修饰：
1)辣根过氧化物酶(HRP)100mg用pH7.2、0.1M的PBS 10mL溶解，避光轻轻颠倒混匀2min，避免产生泡沫；
2)SPDP 16.8mg在1.5mL离心管中用DMF 0.5mL溶解；
3)将2)配制的溶液全部加入1)的溶液中，放置在培养箱中37℃混匀30min；
4)加入1M的DTT溶液230ul，继续放置在培养箱中37℃混匀30min；
5)用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.15M、pH6.0的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液，于4℃保存备用；
(2)氨基修饰抗体：
1)以DMF为溶剂配制浓度为0.1mM的SMPB溶液，按此溶液与抗体溶液体积比1:9的量加入浓度为5～30mg/mL抗体溶液，37℃反应30分钟；
其中，上述抗体溶液是丙肝抗体、乙肝抗体、抗gCD59的单克隆抗体、猪瘟抗体、小鹅瘟抗体、牛或羊口蹄疫抗体、羊痘抗体或狂犬病抗体的溶液；
2)将步骤1)制得的溶液用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.1M、pH6.8的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到氨基修饰的抗体溶液；
(3)氨基修饰抗体与巯基修饰HRP的交联：
将氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，放置在培养箱中37℃混匀60min，加入终浓度为0.1M碘代乙酰胺，放置在培养箱中37℃混匀30min，交联制得抗体辣根过氧化物酶标记物。
将制得纯化好的抗体辣根过氧化物酶标记物加入2倍体积量的酶稳定剂置于2～8℃可保存4周以上。
实施例3：配套抗体辣根过氧化物酶标记物使用的酶稳定剂制备
以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质，加入牛血清白蛋白(BSA)并使其终浓度为10mg/ml，加入kathon并使其终浓度为10ul/ml，加入基质体积量三分之一的甘油制得酶稳定剂。酶稳定剂的使用量是抗体辣根过氧化物酶标记物体积量的2～3倍。
实施例4：配套抗体辣根过氧化物酶标记物使用的稀释液制备
以pH7.2、0.1M的PBS为基质，以体积比计，加入20％的新生牛血清，万分之五的Procin300，以重量体积比计，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)，万分之五的氨基比林、千分之五的葡聚糖T2000、2％的蔗糖、1％的甘氨酸即制得所述稀释液。
以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质加入配套其使用的酶稳定剂，再用配套其使用的稀释液进行1:1000±100稀释后即可用于抗原酶联免疫检测或化学发光检测。
实施例5：不同标记物的效果验证
抗体选择丙肝抗体，采用实施例2的制备方法得到丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物，将该标记物与比普通酶标记方式(过碘酸钠法)标记的丙肝抗体的酶标记物进行效果验证，其使用及验证方法如下：
以实施例4中的稀释液对不加酶稳定剂的按实施例2标记的丙肝抗体酶标记物的进行1:1000稀释，对加了实施例3中酶稳定剂的丙肝抗体酶标记物进行1:1000稀释，与比普通酶标记方式(过碘酸钠法)标记的丙肝抗体酶标记物在酶联免疫检测试剂盒中进行对比检测，记录其OD值，计算P均值/N均值，结果见表1。
A、普通酶标记，原试剂盒中所用酶稀释液，1:500稀释；
B、本发明方法标记的酶标记物，不加酶稳定剂，用原试剂盒中的酶稀释液，1:1000稀释；
C、本发明方法标记的酶标记物，不加酶稳定剂，用本发明实施例4中的稀释液，1:1000稀释；
D、本发明方法标记的酶标记物，加本发明实施例3中的酶稳定剂，用本发明实施例4中的稀释液，1:1000稀释；
表1：丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物不同使用方法与丙肝普通酶标记的对比
P1 P2 P3 P4 P5 N1 N2 N3 N4 N5 P均值/N均值
A 0.345 0.451 0.265 0.198 0.377 0.056 0.076 0.045 0.055 0.049 5.82
B 0.417 0.652 0.354 0.256 0.498 0.034 0.035 0.033 0.045 0.036 11.90
C 0.453 0.666 0.387 0.254 0.491 0.021 0.022 0.023 0.021 0.019 21.24
D 0.455 0.656 0.392 0.263 0.489 0.013 0.015 0.016 0.012 0.013 32.68
经实验检测，用相同的原试剂盒中的稀释液，B组稀释倍数是A组的2倍，说明本发明的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物灵敏度比普通过碘酸钠法标记的酶标记物灵敏度更高。
C组稀释倍数是A组的两倍，检测效果反而是A组的3.65倍，D组是其加了酶稳定剂，是A组稀释倍数的2倍，检测效果是A组的5.62倍。说明采用了本发明中的酶稳定剂和稀释液，能进一步提高灵敏底，降低背景值。
酶稳定剂稳定效果监测实验证实，对加了本发明的酶稳定剂的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物，分别于0月、3月、6月、12月、18月、24月，用本发明的稀释液稀释，1:1000稀释后进行监测，对比酶稳定剂长期稳定效果。结果见表2。
表2：酶稳定剂稳定效果监测
P1 P2 P3 P4 P5 N1 N2 N3 N4 N5 P均值/N均值
0个月 0.455 0.656 0.392 0.263 0.489 0.013 0.015 0.016 0.012 0.013 32.68
3个月 0.454 0.655 0.391 0.262 0.488 0.011 0.013 0.014 0.010 0.011 38.04
6个月 0.455 0.657 0.392 0.263 0.489 0.013 0.015 0.016 0.012 0.013 32.68
12个月 0.453 0.654 0.390 0.261 0.487 0.010 0.012 0.013 0.009 0.010 41.46
18个月 0.453 0.652 0.391 0.263 0.487 0.016 0.018 0.019 0.015 0.016 26.98
24个月 0.451 0.650 0.389 0.261 0.485 0.014 0.016 0.017 0.013 0.014 30.52
实验结果表明，加本发明的酶稳定剂，2年后检测结果与第0月时无明显区别，24个月后的实验未进行监测，但可证明加本发明的酶稳定剂可令本发明的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物稳定效果至少24个月。
实施例6：本发明的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物在丙型肝炎核心抗原检测试剂盒(化学发法)上的应用及效果测试：
本发明的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物用本发明的酶稳剂后，再用本发明的稀释液进行1:1000稀释与普通酶标记方式(过碘酸钠法)标记的丙肝抗体的酶标记物在化学发光检测系统上进行对比：结果见表3。
A、普通酶标记，原试剂盒中所用酶稀释液，1:500稀释。
D、本发明方法标记获得的酶标记物，加本发明的酶稳定剂，再用本发明的稀释液，1:1000稀释。
表3：本发明的抗体酶标记物在化学发光检测系统上的应用比较
S/Co P1 P2 P3 P4 P5 N1 N2 N3 N4 N5 P均值/N均值
A 4.75 6.12 3.13 2.35 4.55 0.65 0.61 0.74 0.63 0.56 6.55
D 7.02 10.36 3.98 2.97 6.43 0.25 0.21 0.26 0.26 0.17 26.75
实验结果表明，本发明的丙肝抗体辣根过氧化物酶标记物在化学发光检测系统上应用比普通酶标记物要高4倍以上。

Claims (7)

1.一种抗体辣根过氧化物酶标记物，是由氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)与巯基修饰后的辣根过氧化物酶(SH-HRP)交联构成；其特征在于：所述氨基修饰后的抗体是以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂配制浓度为0.1mg/ml的丁二酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)溶液，取100ul并加入1ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的抗体，37℃反应30分钟制得；所述巯基修饰后的辣根过氧化物酶是以DMF为溶剂配制浓度为33.6mg/ml的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶液，取500ul并加入10ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的辣根过氧化物酶(HRP)，37℃反应30分钟后，再加入终浓度的0.1M甘氨酸和0.1M二硫苏糖醇(DTT)制得；其中，所述抗体辣根过氧化物酶标记物是将氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，加入终浓度的0.1M碘代乙酰胺交联制得。
2.根据权利要求1所述的抗体辣根过氧化物酶标记物，其特征在于：所述抗体是丙肝抗体、乙肝抗体、抗gCD59的单克隆抗体、猪瘟抗体、小鹅瘟抗体、牛或羊口蹄疫抗体、羊痘抗体或狂犬病抗体。
3.一种配套权利要求1所述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的酶稳定剂，其特征在于：所述酶稳定剂是以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质，加入牛血清白蛋白(BSA)并使其终浓度为10mg/ml，加入kathon并使其终浓度为10ul/ml，加入基质体积量三分之一的甘油制得；酶稳定剂的使用量是抗体辣根过氧化物酶标记物体积量的2～3倍。
4.一种配套权利要求1所述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的稀释液，其特征在于：所述稀释液是以pH7.2、0.1M的PBS为基质，以体积比计，加入20％的新生牛血清，万分之五的Procin300，以重量体积比计，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)，万分之五的氨基比林、千分之五的葡聚糖T2000、2％的蔗糖、1％的甘氨酸制得。
5.权利要求1所述抗体辣根过氧化物酶标记物的制备方法，步骤是：
(1)HRP的巯基修饰：
1)辣根过氧化物酶(HRP)100mg用pH7.2、0.1M的PBS 10mL溶解，避光轻轻颠倒混匀2min，避免产生泡沫；
2)SPDP 16.8mg在1.5mL离心管中用DMF 0.5mL溶解；
3)将2)配制的溶液全部加入1)的溶液中，放置在培养箱中37℃混匀30min；
4)加入1M的DTT溶液230ul，继续放置在培养箱中37℃混匀30min；
5)用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.15M、pH6.0的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液，于2～8℃保存备用；
(2)氨基修饰抗体：
1)以DMF为溶剂配制浓度为0.1mM的SMPB溶液，按此溶液与抗体溶液体积比1:9的量加入浓度为5～30mg/mL抗体溶液，37℃反应30分钟；
2)将步骤1)制得的溶液用预处理后的P6-DG脱盐柱以0.1M、pH6.8的PBS进行脱盐，收集第一峰的液体，即得到氨基修饰的抗体溶液；
(3)氨基修饰抗体与巯基修饰HRP的交联：
将氨基修饰后的抗体(NH2-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，放置在培养箱中37℃混匀60min，加入终浓度为0.1M碘代乙酰胺，放置在培养箱中37℃混匀30min，交联制得抗体辣根过氧化物酶标记物。
6.权利要求1所述抗体辣根过氧化物酶标记物在制备抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗体辣根过氧化物酶标记物的使用方法是：以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质加入配套其使用的权利要求3所述的酶稳定剂，再用配套其使用的权利要求4所述稀释液进行1:1000±100稀释后用于抗原酶联免疫检测或化学发光检测。
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