JP3247147B2 - 抗体酵素複合体およびそれを用いた酵素免疫測定法 - Google Patents
抗体酵素複合体およびそれを用いた酵素免疫測定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮＫＹ１３抗体または
ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体が酵素と架橋試薬により結合し、
該酵素が該酵素に対する抗体により結合している抗体酵
素複合体からなる測定感度が上昇した酵素免疫測定試薬
および該試薬を用いた酵素免疫測定法に関する。
ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体が酵素と架橋試薬により結合し、
該酵素が該酵素に対する抗体により結合している抗体酵
素複合体からなる測定感度が上昇した酵素免疫測定試薬
および該試薬を用いた酵素免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素免疫測定法(Enzyme Immunoassay;
ＥＩＡ)とは、少量でもその活性が検出できる高感度の
酵素をマ−カ−として、抗原あるいは抗体、さらには特
異的に反応する物質、レクチン、Ｃｌｑなどと化学的に
結合せしめ、抗原あるいは抗体などを測定する方法であ
る。ＥＩＡはラジオイムノアッセイ(Radioimmunoassey;
ＲＩＡ)とは異なり、被曝、放射性物質の廃棄の制限な
どがなく、またＲＩＡと同程度の感度が得られることか
ら、広く用いられている(織田ら、免疫学用語辞典：最
新医学社)。ＥＩＡにおいて抗原あるいは抗体を酵素標
識する方法としては、グルタルアルデヒド法(Avrameas,
S., Immunochemistry 6, 43-52, 1969)、過ヨ−ソ酸法
(Nakane, P. K., J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1
091, 1974)、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法
(Carlsson, J., Biochem. J. 173, 723-737, 1987)など
が知られている。このうち、重合体の形成が無く、抗
原、抗体および酵素の活性維持が良好であり、標識効率
の高い方法は、マレイミド法とピリジル・ジスルフィド
法である。
ＥＩＡ)とは、少量でもその活性が検出できる高感度の
酵素をマ−カ−として、抗原あるいは抗体、さらには特
異的に反応する物質、レクチン、Ｃｌｑなどと化学的に
結合せしめ、抗原あるいは抗体などを測定する方法であ
る。ＥＩＡはラジオイムノアッセイ(Radioimmunoassey;
ＲＩＡ)とは異なり、被曝、放射性物質の廃棄の制限な
どがなく、またＲＩＡと同程度の感度が得られることか
ら、広く用いられている(織田ら、免疫学用語辞典：最
新医学社)。ＥＩＡにおいて抗原あるいは抗体を酵素標
識する方法としては、グルタルアルデヒド法(Avrameas,
S., Immunochemistry 6, 43-52, 1969)、過ヨ−ソ酸法
(Nakane, P. K., J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1
091, 1974)、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法
(Carlsson, J., Biochem. J. 173, 723-737, 1987)など
が知られている。このうち、重合体の形成が無く、抗
原、抗体および酵素の活性維持が良好であり、標識効率
の高い方法は、マレイミド法とピリジル・ジスルフィド
法である。
【０００３】マレイミド法とは、マレイミド基とチオ−
ル基が温和な条件下で効率良く反応して安定な架橋を形
成することを利用した方法で、架橋試薬としてマレイミ
ド化合物を用いて酵素にマレイミド基を導入し、抗体や
抗原にチオ−ル基を導入して両者を反応させて酵素標識
抗体(抗原)を得る方法である。一方、ピリジル・ジスル
フィド法とは、ピリジル・ジスルフィド結合がチオ−ル
基と交換反応を起こすことを利用した方法で、架橋試薬
としてピリジル・ジスルフィド化合物を用いて酵素にピ
リジル・ジスルフィド基を導入し、抗体や抗原にチオ−
ル基を導入して両者を反応させると容易に酵素標識を行
なうことができる。
ル基が温和な条件下で効率良く反応して安定な架橋を形
成することを利用した方法で、架橋試薬としてマレイミ
ド化合物を用いて酵素にマレイミド基を導入し、抗体や
抗原にチオ−ル基を導入して両者を反応させて酵素標識
抗体(抗原)を得る方法である。一方、ピリジル・ジスル
フィド法とは、ピリジル・ジスルフィド結合がチオ−ル
基と交換反応を起こすことを利用した方法で、架橋試薬
としてピリジル・ジスルフィド化合物を用いて酵素にピ
リジル・ジスルフィド基を導入し、抗体や抗原にチオ−
ル基を導入して両者を反応させると容易に酵素標識を行
なうことができる。
【０００４】これらの方法は、抗体を酵素標識する際、
抗体のヒンジ部のジスルフィド結合を還元して生成する
チオ−ル基をそのまま用いることができる。さらに、抗
体のＦａｂ’のヒンジ部のチオ−ル基を利用した酵素標
識であるヒンジ酵素標識法(ヒンジ法)を行なうと、抗体
活性を損なうことがないので、非特異的吸着が少なく、
利用価値の高い酵素標識Ｆａｂ’を調製することができ
る(石川ら、酵素免疫測定法 第３版：医学書院)ことか
ら、現在最も良く使われている。
抗体のヒンジ部のジスルフィド結合を還元して生成する
チオ−ル基をそのまま用いることができる。さらに、抗
体のＦａｂ’のヒンジ部のチオ−ル基を利用した酵素標
識であるヒンジ酵素標識法(ヒンジ法)を行なうと、抗体
活性を損なうことがないので、非特異的吸着が少なく、
利用価値の高い酵素標識Ｆａｂ’を調製することができ
る(石川ら、酵素免疫測定法 第３版：医学書院)ことか
ら、現在最も良く使われている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、現在
ＥＩＡの酵素標識において最も優れている方法はヒンジ
法である。しかし、この方法は抗体をＦａｂ’とした後
に標識するので、本来２価である抗体を１価にすること
になり、その結果、抗原が多価抗原である場合抗原との
結合力は低下してしまうことがある。そこで、本発明者
らは、ヒンジ法によって低下した抗体の結合力を回復さ
せ、酵素免疫測定法における測定感度を上昇させること
を目的として実験を行い、本発明を完成した。
ＥＩＡの酵素標識において最も優れている方法はヒンジ
法である。しかし、この方法は抗体をＦａｂ’とした後
に標識するので、本来２価である抗体を１価にすること
になり、その結果、抗原が多価抗原である場合抗原との
結合力は低下してしまうことがある。そこで、本発明者
らは、ヒンジ法によって低下した抗体の結合力を回復さ
せ、酵素免疫測定法における測定感度を上昇させること
を目的として実験を行い、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究につとめた結果、酵素標識
抗体を標識酵素に対する抗体で結合させることにより、
すなわち、抗体が酵素と架橋試薬により結合し、該酵素
が該酵素に対する抗体により結合している抗体酵素複合
体を生成させることにより標識抗体を多価とし、その結
合力を著しく回復させることに成功した。すなわち、本
発明は、第一の抗体がＮＫＹ１３またはＫＹ−ＡＮＰ−
Ｉであって、酵素と架橋試薬により結合し、該酵素が該
酵素に対する第二の抗体により結合している抗体酵素複
合体からなる免疫測定試薬に関するものである。該第一
抗体であるＮＫＹ１３抗体（特開平１−７１４９６）は
ヒト腸癌細胞由来の糖たん白質を認識するモノクローナ
ル抗体であり、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体（特開平１−６１
５００）はヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮ
Ｐ）を認識するモノクローナル抗体である。ＮＫＹ１３
抗体は、１９８７年５月２６日からPHLS CAMR、Porton D
own、Salis bury、Wilts、United KingdomのECACC（Euro
pean Collection of Animal Cell Cultures）にブタペ
スト条約に基づき受託番号８７０５２６０１として寄託
されているハイブリドーマ「ＮＫＹ１３」を用いて、特
開平１−７１４９６に記載の方法で作製することができ
る。また、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体も、同様に、１９８７
年８月２０日からECACCにブタペスト条約に基づき受託
番号８７０８２００１として寄託されているハイブリド
ーマ「ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ」を用いて、特開平１−６１５
００に記載の方法で作製することができる。該第一抗体
は酵素標識可能な抗体フラグメントでもよく、その代表
例としてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ
およびＦｄなどが挙げられるが、好ましくはＦａｂ’を
用いる。
的を達成するために鋭意研究につとめた結果、酵素標識
抗体を標識酵素に対する抗体で結合させることにより、
すなわち、抗体が酵素と架橋試薬により結合し、該酵素
が該酵素に対する抗体により結合している抗体酵素複合
体を生成させることにより標識抗体を多価とし、その結
合力を著しく回復させることに成功した。すなわち、本
発明は、第一の抗体がＮＫＹ１３またはＫＹ−ＡＮＰ−
Ｉであって、酵素と架橋試薬により結合し、該酵素が該
酵素に対する第二の抗体により結合している抗体酵素複
合体からなる免疫測定試薬に関するものである。該第一
抗体であるＮＫＹ１３抗体（特開平１−７１４９６）は
ヒト腸癌細胞由来の糖たん白質を認識するモノクローナ
ル抗体であり、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体（特開平１−６１
５００）はヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮ
Ｐ）を認識するモノクローナル抗体である。ＮＫＹ１３
抗体は、１９８７年５月２６日からPHLS CAMR、Porton D
own、Salis bury、Wilts、United KingdomのECACC（Euro
pean Collection of Animal Cell Cultures）にブタペ
スト条約に基づき受託番号８７０５２６０１として寄託
されているハイブリドーマ「ＮＫＹ１３」を用いて、特
開平１−７１４９６に記載の方法で作製することができ
る。また、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体も、同様に、１９８７
年８月２０日からECACCにブタペスト条約に基づき受託
番号８７０８２００１として寄託されているハイブリド
ーマ「ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ」を用いて、特開平１−６１５
００に記載の方法で作製することができる。該第一抗体
は酵素標識可能な抗体フラグメントでもよく、その代表
例としてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ
およびＦｄなどが挙げられるが、好ましくはＦａｂ’を
用いる。
【０００７】該酵素としては、ＥＩＡに用いられる酵
素、例えば西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、β−ガラクト
シダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ、アルカリフォスフ
ァタ−ゼ、リゾチ−ム、グルコ−ス−６−リン酸デヒド
ロゲナ−ゼなどは全て用いることができるが、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼを用いるのが好ましい。架橋法とし
ては、ＥＩＡの酵素標識に用いられる架橋試薬を用いる
方法、例えばグルタルアルデヒド、マレイミド化合物、
ピリジル・ジスルフィド化合物などを用いる方法、ある
いは過ヨ−ソ酸酸化によるNakaue法などを用いることが
できるが、その中でもマレイミド化合物を用いる方法が
好ましい。マレイミド化合物には、例えば、Ｎ−(ε−
マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(N-(ε-Ma
leimidocaproyloxy)succinimide; ＥＭＣＳ)、Ｎ−スク
シンイミジル−４−マレイミドブチル酸(N-succinimidy
l-4-maleimidobutyrate)、Ｎ−スクシンイミジル−６−
マレイミドヘキサノ酸(N-succinimidyl-6-maleimidohex
anoate)およびＮ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイ
ミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキン酸(N-su
ccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-car
bonate)などが挙げられるが、好ましくはＥＭＣＳを用
いる。これらの架橋試薬は常法に従って第一抗体と酵素
の結合に使用する。該第二抗体としては、該酵素を認識
するポリクロ−ナル抗体およびモノクロ−ナル抗体が用
いられる。これらの抗体は市販品としても入手可能であ
るが、通常用いられる方法によって作製することもでき
る。
素、例えば西洋ワサビペルオキシダ−ゼ、β−ガラクト
シダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ、アルカリフォスフ
ァタ−ゼ、リゾチ−ム、グルコ−ス−６−リン酸デヒド
ロゲナ−ゼなどは全て用いることができるが、西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼを用いるのが好ましい。架橋法とし
ては、ＥＩＡの酵素標識に用いられる架橋試薬を用いる
方法、例えばグルタルアルデヒド、マレイミド化合物、
ピリジル・ジスルフィド化合物などを用いる方法、ある
いは過ヨ−ソ酸酸化によるNakaue法などを用いることが
できるが、その中でもマレイミド化合物を用いる方法が
好ましい。マレイミド化合物には、例えば、Ｎ−(ε−
マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(N-(ε-Ma
leimidocaproyloxy)succinimide; ＥＭＣＳ)、Ｎ−スク
シンイミジル−４−マレイミドブチル酸(N-succinimidy
l-4-maleimidobutyrate)、Ｎ−スクシンイミジル−６−
マレイミドヘキサノ酸(N-succinimidyl-6-maleimidohex
anoate)およびＮ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイ
ミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキン酸(N-su
ccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-car
bonate)などが挙げられるが、好ましくはＥＭＣＳを用
いる。これらの架橋試薬は常法に従って第一抗体と酵素
の結合に使用する。該第二抗体としては、該酵素を認識
するポリクロ−ナル抗体およびモノクロ−ナル抗体が用
いられる。これらの抗体は市販品としても入手可能であ
るが、通常用いられる方法によって作製することもでき
る。
【０００８】本発明はさらに、上記の抗体酵素複合体か
らなる酵素免疫測定試薬を用いた酵素免疫測定法を提供
する。この酵素免疫測定法は、競合法、サンドイッチ法
など通常の免疫測定法を含むものであり、方法の選択は
測定すべき抗原の性質により多様である。例えば酵素標
識抗体として、ヒンジ法により作成した標識Ｆａｂ’の
代わりに本発明の抗体酵素複合体を用いると、標識Ｆａ
ｂ’の抗体価が１価であるのに対し、抗体酵素複合体は
抗体価が多価であることから、抗原に対する結合力が標
識Ｆａｂ’を用いた場合に比べてはるかに強く、その結
果アッセイ感度を大幅に上昇させることができる。
らなる酵素免疫測定試薬を用いた酵素免疫測定法を提供
する。この酵素免疫測定法は、競合法、サンドイッチ法
など通常の免疫測定法を含むものであり、方法の選択は
測定すべき抗原の性質により多様である。例えば酵素標
識抗体として、ヒンジ法により作成した標識Ｆａｂ’の
代わりに本発明の抗体酵素複合体を用いると、標識Ｆａ
ｂ’の抗体価が１価であるのに対し、抗体酵素複合体は
抗体価が多価であることから、抗原に対する結合力が標
識Ｆａｂ’を用いた場合に比べてはるかに強く、その結
果アッセイ感度を大幅に上昇させることができる。
【０００９】以下に本発明の抗体酵素複合体の作製工程
およびそれを用いた酵素免疫測定法について、第一抗体
としてＦａｂ’を用いた場合を示す。 １．抗体酵素複合体の作製 (1)抗体の精製 適当な緩衝液で平衡化したカラム(プロテイン−Ａセフ
ァロ−スカラムなど)に、測定したい抗原に対する抗体
溶液を付し、十分に洗浄した後、吸着画分を溶出し、精
製抗体とする。
およびそれを用いた酵素免疫測定法について、第一抗体
としてＦａｂ’を用いた場合を示す。 １．抗体酵素複合体の作製 (1)抗体の精製 適当な緩衝液で平衡化したカラム(プロテイン−Ａセフ
ァロ−スカラムなど)に、測定したい抗原に対する抗体
溶液を付し、十分に洗浄した後、吸着画分を溶出し、精
製抗体とする。
【００１０】(2)酵素標識 石川らの方法(Ishikawa, E. et al., J. Immunoassay
4, 209-327, 1983)に従って、酵素標識抗体を調製す
る。酵素消化条件、およびＦ(ａｂ’)2の還元条件は用
いる抗体について新たに設定する。上記(1)で精製した
抗体溶液を適当な緩衝液で平衡化したカラムを用いたゲ
ルクロマトグラフィ−でバッファ−交換した後、濃縮し
て濃度を調整する。同緩衝液で調製したペプシン溶液
を、ペプシン量が抗体の数百分の一(重量比)となるよう
に添加し、静置状態で水浴中０〜５０℃で数十分間〜数
時間反応させる。反応後、アルカリ、好ましくはトリス
を添加してｐＨを上昇させ反応を停止し、反応液を適当
な緩衝液で平衡化したカラムに付し、同緩衝液を用いて
ゲル濾過を行なう。溶出液数百μｌ毎に吸光度を測定
し、吸光値からタンパク量を求め、メインピ−クをＦ
(ａｂ’)2画分とする。得られたＦ(ａｂ’)2を濃縮して
濃度を調整し、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)を含
むリン酸緩衝液(Phosphate Buffer; ＰＢ)で調製した２
−メルカプトエチルアミン(2-mercaptoethylamine; ２
−ＭＥＡ)をジスルフィド結合を還元するに十分量添加
して、静置状態で水浴中０〜５０℃で数十分間〜数時間
反応させる。反応後、反応液を同リン酸緩衝液で平衡化
したカラムに付し、ゲル濾過を行なう。溶出液数百μｌ
毎の吸光度からタンパク量を求め、メインピ−クをＦａ
ｂ’画分とする。得られたＦａｂ’画分を濃縮し、濃度
を調整する。Ｆａｂ’１分子あたりのＳＨ基の数を石川
らの方法(Ishikawa, E. et al.,前掲)で測定する。
4, 209-327, 1983)に従って、酵素標識抗体を調製す
る。酵素消化条件、およびＦ(ａｂ’)2の還元条件は用
いる抗体について新たに設定する。上記(1)で精製した
抗体溶液を適当な緩衝液で平衡化したカラムを用いたゲ
ルクロマトグラフィ−でバッファ−交換した後、濃縮し
て濃度を調整する。同緩衝液で調製したペプシン溶液
を、ペプシン量が抗体の数百分の一(重量比)となるよう
に添加し、静置状態で水浴中０〜５０℃で数十分間〜数
時間反応させる。反応後、アルカリ、好ましくはトリス
を添加してｐＨを上昇させ反応を停止し、反応液を適当
な緩衝液で平衡化したカラムに付し、同緩衝液を用いて
ゲル濾過を行なう。溶出液数百μｌ毎に吸光度を測定
し、吸光値からタンパク量を求め、メインピ−クをＦ
(ａｂ’)2画分とする。得られたＦ(ａｂ’)2を濃縮して
濃度を調整し、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)を含
むリン酸緩衝液(Phosphate Buffer; ＰＢ)で調製した２
−メルカプトエチルアミン(2-mercaptoethylamine; ２
−ＭＥＡ)をジスルフィド結合を還元するに十分量添加
して、静置状態で水浴中０〜５０℃で数十分間〜数時間
反応させる。反応後、反応液を同リン酸緩衝液で平衡化
したカラムに付し、ゲル濾過を行なう。溶出液数百μｌ
毎の吸光度からタンパク量を求め、メインピ−クをＦａ
ｂ’画分とする。得られたＦａｂ’画分を濃縮し、濃度
を調整する。Ｆａｂ’１分子あたりのＳＨ基の数を石川
らの方法(Ishikawa, E. et al.,前掲)で測定する。
【００１１】一方、抗体に標識する酵素溶液に適当な架
橋試薬を添加し、０〜５０℃で数十分間〜数時間撹拌し
ながら反応させた。反応後遠心し、その上清をゲル濾過
し、ボイド(void)画分を回収する。これと先に調製した
Ｆａｂ’画分とを等量混合して、静置状態で０〜５０℃
で数時間〜数十時間反応させ、反応液をゲル濾過する。
溶出液数百μｌ毎の吸光度を測定して、その第一ピ−ク
を粗酵素標識抗体画分とし、これを精製して酵素標識抗
体とする。なお、フラグメント化していない抗体やその
他の抗体フラグメントの酵素標識も、公知の方法で同様
に行なうことができる。
橋試薬を添加し、０〜５０℃で数十分間〜数時間撹拌し
ながら反応させた。反応後遠心し、その上清をゲル濾過
し、ボイド(void)画分を回収する。これと先に調製した
Ｆａｂ’画分とを等量混合して、静置状態で０〜５０℃
で数時間〜数十時間反応させ、反応液をゲル濾過する。
溶出液数百μｌ毎の吸光度を測定して、その第一ピ−ク
を粗酵素標識抗体画分とし、これを精製して酵素標識抗
体とする。なお、フラグメント化していない抗体やその
他の抗体フラグメントの酵素標識も、公知の方法で同様
に行なうことができる。
【００１２】(3)抗体酵素複合体の調製 上記(2)で調製した酵素標識抗体溶液と標識酵素に対す
る抗体溶液を反応させて、抗体酵素複合体とする。反応
は、両者を酵素免疫測定開始時に同時に添加し測定系中
において複合体を形成させることもできるし、要すれ
ば、事前に両者を混合して０〜５０℃で数分〜数時間反
応させて形成しても良い。
る抗体溶液を反応させて、抗体酵素複合体とする。反応
は、両者を酵素免疫測定開始時に同時に添加し測定系中
において複合体を形成させることもできるし、要すれ
ば、事前に両者を混合して０〜５０℃で数分〜数時間反
応させて形成しても良い。
【００１３】２．酵素免疫測定法抗原固相プレ−トを用いたＥＬＩＳＡ(Enzime-linked i
mmunosorbent assay) (1)抗原固相プレ−トの調製 抗原固相プレ−トは特開昭62-212568に記載の方法で調
製することができる。すなわち、抗原溶液をマイクロタ
イタ−プレ−トに添加し、室温で数時間放置する。その
後好ましくはＬ−ポリリジン(L-polylysine)を添加して
混和し、４℃で十数時間以上放置し、抗原固相プレ−ト
とする。
mmunosorbent assay) (1)抗原固相プレ−トの調製 抗原固相プレ−トは特開昭62-212568に記載の方法で調
製することができる。すなわち、抗原溶液をマイクロタ
イタ−プレ−トに添加し、室温で数時間放置する。その
後好ましくはＬ−ポリリジン(L-polylysine)を添加して
混和し、４℃で十数時間以上放置し、抗原固相プレ−ト
とする。
【００１４】(2)ＥＬＩＳＡ 上記(1)で作成した抗原固相プレ−トを、ブロッキング
溶液(例えば、ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Album
in; ＢＳＡ)およびＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生
食水(Phosphate Buffered Saline; ＰＢＳ)で洗浄後、
同溶液を添加し、室温で数時間インキュベ−トしてブロ
ッキングする。ブロッキング溶液を吸引除去した後、上
記１で調製した抗体酵素複合体溶液を添加し、静置状態
で０〜５０℃で数時間反応させ、反応後、ウエルを洗浄
する。酵素反応基質発色液｛例えば、過酸化水素(H
2O2)、ＡＢＴＳ[2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoli
ne-6-sulufonic acid)の商品名]のクエン酸緩衝液(Citr
ate Buffer; ＣＢ)溶液｝を添加して、室温で数十分間
〜数時間反応させ、反応停止液(例えば、アジ化ナトリ
ウム(NaN3)のＣＢ溶液)を添加する。反応液の一部を別
のポリスチレン製マイクロタイタ−プレ−トに取り吸光
度を測定する。また、抗原を固相していないマイクロタ
イタ−プレ−トを用いて同様の操作を行ない、ブランク
とする。
溶液(例えば、ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Album
in; ＢＳＡ)およびＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生
食水(Phosphate Buffered Saline; ＰＢＳ)で洗浄後、
同溶液を添加し、室温で数時間インキュベ−トしてブロ
ッキングする。ブロッキング溶液を吸引除去した後、上
記１で調製した抗体酵素複合体溶液を添加し、静置状態
で０〜５０℃で数時間反応させ、反応後、ウエルを洗浄
する。酵素反応基質発色液｛例えば、過酸化水素(H
2O2)、ＡＢＴＳ[2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoli
ne-6-sulufonic acid)の商品名]のクエン酸緩衝液(Citr
ate Buffer; ＣＢ)溶液｝を添加して、室温で数十分間
〜数時間反応させ、反応停止液(例えば、アジ化ナトリ
ウム(NaN3)のＣＢ溶液)を添加する。反応液の一部を別
のポリスチレン製マイクロタイタ−プレ−トに取り吸光
度を測定する。また、抗原を固相していないマイクロタ
イタ−プレ−トを用いて同様の操作を行ない、ブランク
とする。
【００１５】抗体結合ビ−ズを用いたサンドイッチＥＩ
Ａ (1)抗体結合ビ−ズの調製 ビ−ズにエタノ−ルを添加し、数分間〜数十分間浸漬し
た後、適当な緩衝液(例えばＰＢＳ)で洗浄する。次いで
同緩衝液を添加して数十分間脱気した後、０〜５０℃の
水浴で数十分間温置する。別に、抗体溶液を適当な濃度
に調製し、同様に脱気して、０〜５０℃の水浴で数十分
間温置する。ビ−ズを浸している緩衝液を吸引除去して
抗体溶液を添加し、混和して、０〜５０℃の水浴に温置
する。混和する操作を数回繰り返し、０〜５０℃のイン
キュベ−タに移して、数時間〜数十時間温置する。抗体
溶液を吸引除去した後、洗浄し、ブロッキング溶液(例
えば、ＢＳＡのＰＢＳ溶液)を添加して０〜５０℃の水
浴で数時間静置してブロッキングする。ブロッキング溶
液を吸引除去した後、洗浄し、同溶液を添加して４℃に
保存する。
Ａ (1)抗体結合ビ−ズの調製 ビ−ズにエタノ−ルを添加し、数分間〜数十分間浸漬し
た後、適当な緩衝液(例えばＰＢＳ)で洗浄する。次いで
同緩衝液を添加して数十分間脱気した後、０〜５０℃の
水浴で数十分間温置する。別に、抗体溶液を適当な濃度
に調製し、同様に脱気して、０〜５０℃の水浴で数十分
間温置する。ビ−ズを浸している緩衝液を吸引除去して
抗体溶液を添加し、混和して、０〜５０℃の水浴に温置
する。混和する操作を数回繰り返し、０〜５０℃のイン
キュベ−タに移して、数時間〜数十時間温置する。抗体
溶液を吸引除去した後、洗浄し、ブロッキング溶液(例
えば、ＢＳＡのＰＢＳ溶液)を添加して０〜５０℃の水
浴で数時間静置してブロッキングする。ブロッキング溶
液を吸引除去した後、洗浄し、同溶液を添加して４℃に
保存する。
【００１６】(2)ビ−ズ法サンドイッチＥＩＡ 適当な緩衝液(例えば、カゼインのＰＢＳ溶液)で調製し
た抗原溶液、同緩衝液、および上記１で調製した抗体酵
素複合体溶液をチュ−ブに取り、撹拌後、上記(1)で調
製した抗体結合ビ−ズを１個添加する。室温で十数時間
反応させた後、洗浄する。ビ−ズを新しいチュ−ブに移
し変え、酵素反応基質発色液(例えば、過酸化水素(H
2O2)、ＡＢＴＳのＣＢ溶液)を添加し、０〜５０℃で数
十分間反応させる。反応停止液(例えば、アジ化ナトリ
ウム(NaN3)のＣＢ溶液)を添加して反応を止め、反応液
の４１５ｎｍでの吸光度を測定する。
た抗原溶液、同緩衝液、および上記１で調製した抗体酵
素複合体溶液をチュ−ブに取り、撹拌後、上記(1)で調
製した抗体結合ビ−ズを１個添加する。室温で十数時間
反応させた後、洗浄する。ビ−ズを新しいチュ−ブに移
し変え、酵素反応基質発色液(例えば、過酸化水素(H
2O2)、ＡＢＴＳのＣＢ溶液)を添加し、０〜５０℃で数
十分間反応させる。反応停止液(例えば、アジ化ナトリ
ウム(NaN3)のＣＢ溶液)を添加して反応を止め、反応液
の４１５ｎｍでの吸光度を測定する。
【００１７】以下に実施例によって本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定される
ものではない。
するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定される
ものではない。
【実施例】実施例１ １．実験材料 ＮＫＹ１３抗体は、１９８７年５月２６日からPHLS CAM
R、 Porton Down、 Salisbury、 Wilts、 United Kingdomn
のECACC(European Collection of Animal Cell Cultur
es)にブダペスト条約に基づき受託番号８７０５２６０
１として寄託されているハイブリド−マ「ＮＫＹ１３」
を用いて、特開平１−７１４９６に記載の方法で作製し
た。標準抗原であるＬＳ１８０細胞由来糖ペプチド(Ｌ
Ｓ１８０Ｇ５０Ｉ)はバイオチバ社から購入した。ＢＳ
Ａ(結晶)、ペプシン、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ(Hor
seradish Peroxidase; ＨＲＰ)、２−メルカプトエチル
アミン(2-mercaptoethylamine; ２−ＭＥＡ)、α−メチ
ルマンノサイド(α-methylmannoside)、およびＬ−ポリ
リジン(L-polylysine)はSigma社から、ＡＢＴＳ、カゼ
インはBoehringer Mannheim社から購入した。Ｎ−(ε-
マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド( N-(ε-M
aleimidocaproyloxy)succinimide; ＥＭＣＳ)は同人化
学から、ジメチルスルホキサイド(Dimethyl Sulfoxide;
ＤＭＳＯ)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、Ｔ
ｗｅｅｎ２０はナカライテスクから購入した。
R、 Porton Down、 Salisbury、 Wilts、 United Kingdomn
のECACC(European Collection of Animal Cell Cultur
es)にブダペスト条約に基づき受託番号８７０５２６０
１として寄託されているハイブリド−マ「ＮＫＹ１３」
を用いて、特開平１−７１４９６に記載の方法で作製し
た。標準抗原であるＬＳ１８０細胞由来糖ペプチド(Ｌ
Ｓ１８０Ｇ５０Ｉ)はバイオチバ社から購入した。ＢＳ
Ａ(結晶)、ペプシン、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ(Hor
seradish Peroxidase; ＨＲＰ)、２−メルカプトエチル
アミン(2-mercaptoethylamine; ２−ＭＥＡ)、α−メチ
ルマンノサイド(α-methylmannoside)、およびＬ−ポリ
リジン(L-polylysine)はSigma社から、ＡＢＴＳ、カゼ
インはBoehringer Mannheim社から購入した。Ｎ−(ε-
マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド( N-(ε-M
aleimidocaproyloxy)succinimide; ＥＭＣＳ)は同人化
学から、ジメチルスルホキサイド(Dimethyl Sulfoxide;
ＤＭＳＯ)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、Ｔ
ｗｅｅｎ２０はナカライテスクから購入した。
【００１８】プロテイン−Ａ セファロ−ス ＣＬ−４Ｂ
(Protein-A Sepharose CL-4B)カラム、Ｃｏｎ−Ａ セフ
ァロ−ス (Con-A Sepharose)カラム、シアン化臭素−活
性化セファロ−ス ４Ｂ(CNBr-activated Sepharose 4B)
カラム、ＰＤ−１０カラムはPharmacia社から購入し
た。セントリコン１０、３０(Centricon10, 30)はAmico
n社から、ポリビニルクロライドマイクロタイタ−プレ
−ト(polyvinyl chloride microtiter plate)はFalcon
社から購入した。１／４インチ径ポリスチレンビ−ズは
イムノケミカル社、バックス社から購入した。抗ＨＲＰ
モノクロ−ナル抗体(抗ＨＲＰ ＭｃＡｂ)はZymet社か
ら、ヒト血清はMiles社から購入した。Superose１２ カ
ラムクロマトグラフィ−はＦＰＬＣシステム(ポンプＰ-
５００(２台)、コントロ−ラＬＣＣ-５００、ＵＶモニ
タ−ＵＶ-１、フラクションコレクタ−ＦＲＡＣ-１０
０) (Pharmacia)上で行なった。吸光度の測定には紫外
−可視分光光度計ＵＶ−２６５(島津製作所)、イムノリ
−ダ−ＮＪ-2000(Intermed)を用いた。
(Protein-A Sepharose CL-4B)カラム、Ｃｏｎ−Ａ セフ
ァロ−ス (Con-A Sepharose)カラム、シアン化臭素−活
性化セファロ−ス ４Ｂ(CNBr-activated Sepharose 4B)
カラム、ＰＤ−１０カラムはPharmacia社から購入し
た。セントリコン１０、３０(Centricon10, 30)はAmico
n社から、ポリビニルクロライドマイクロタイタ−プレ
−ト(polyvinyl chloride microtiter plate)はFalcon
社から購入した。１／４インチ径ポリスチレンビ−ズは
イムノケミカル社、バックス社から購入した。抗ＨＲＰ
モノクロ−ナル抗体(抗ＨＲＰ ＭｃＡｂ)はZymet社か
ら、ヒト血清はMiles社から購入した。Superose１２ カ
ラムクロマトグラフィ−はＦＰＬＣシステム(ポンプＰ-
５００(２台)、コントロ−ラＬＣＣ-５００、ＵＶモニ
タ−ＵＶ-１、フラクションコレクタ−ＦＲＡＣ-１０
０) (Pharmacia)上で行なった。吸光度の測定には紫外
−可視分光光度計ＵＶ−２６５(島津製作所)、イムノリ
−ダ−ＮＪ-2000(Intermed)を用いた。
【００１９】２．抗体酵素複合体の調製 (1)ＮＫＹ１３抗体の精製 ０.０１Ｍボレイト緩衝生食水(Borate Buffered Salin
e; ＢＢＳ)(ｐＨ８.５)で平衡化したプロテイン−Ａ セ
ファロ−ス ＣＬ−４Ｂカラム(１.５ｃｍ×１０ｃｍ)
に、ＮＫＹ１３抗体(Ｌｏｔ． ＢＣＳ−１)１００ｍｇ
／１７.５ｍｌ(ＢＣＳ−１に０.０１Ｍ ＢＢＳ(ｐＨ８.
５)を等量混合して、ｐＨを８.５に調製したもの)を付
し、０.０１Ｍ ＢＢＳ(ｐＨ８.５)、続いて０.０１Ｍ
ＰＢＳ(ｐＨ６.０)で十分に洗浄した後、０.０１Ｍ ク
エン酸緩衝生食水(Citrate Buffered Saline; ＣＢＳ)
(ｐＨ４.０)で吸着画分を溶出した。フラクションチュ
−ブには、あらかじめ１Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ８.５)を
添加しておき、溶出画分のｐＨをただちに上昇させた。
このｐＨ４.０溶出画分を精製ＮＫＹ１３抗体とした。
e; ＢＢＳ)(ｐＨ８.５)で平衡化したプロテイン−Ａ セ
ファロ−ス ＣＬ−４Ｂカラム(１.５ｃｍ×１０ｃｍ)
に、ＮＫＹ１３抗体(Ｌｏｔ． ＢＣＳ−１)１００ｍｇ
／１７.５ｍｌ(ＢＣＳ−１に０.０１Ｍ ＢＢＳ(ｐＨ８.
５)を等量混合して、ｐＨを８.５に調製したもの)を付
し、０.０１Ｍ ＢＢＳ(ｐＨ８.５)、続いて０.０１Ｍ
ＰＢＳ(ｐＨ６.０)で十分に洗浄した後、０.０１Ｍ ク
エン酸緩衝生食水(Citrate Buffered Saline; ＣＢＳ)
(ｐＨ４.０)で吸着画分を溶出した。フラクションチュ
−ブには、あらかじめ１Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ８.５)を
添加しておき、溶出画分のｐＨをただちに上昇させた。
このｐＨ４.０溶出画分を精製ＮＫＹ１３抗体とした。
【００２０】(2)酵素標識抗体の調製 石川らの方法(Ishikawa, E. et al., J. Immunoassay
4, 209-327, 1983)に従って、酵素標識抗体を調製し
た。酵素消化条件、およびＦ(ａｂ’)2の還元条件はＮ
ＫＹ１３抗体について新たに設定した。上記(1)でプロ
テイン−Ａ精製したＮＫＹ１３抗体溶液を０.１Ｍ ＣＢ
(ｐＨ４.８)で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いたゲ
ルクロマトグラフィ−でバッファ−交換し、セントリコ
ン３０(Centricon 30)で濃縮して５.５ｍｇ／ｍｌの濃
度に調製した。同緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに調製したペプ
シン溶液を、ペプシン量が抗体の１／４００(重量比)と
なるように添加し、静置状態で水浴中３７℃で３０分間
反応させた。反応後、１Ｍ トリスを添加してｐＨを上
昇させ反応を停止し、反応液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０.１ＭＰＢ(ｐＨ６.０)で平衡化したSuperose１２(１
６／５０)に付し、同緩衝液を用いて１.５ｍｌ／分の流
速で溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎に２８０ｎｍの吸
光度を測定し、吸光度からタンパク量を求め、メインピ
−クをＦ(ａｂ’)2画分とした。
4, 209-327, 1983)に従って、酵素標識抗体を調製し
た。酵素消化条件、およびＦ(ａｂ’)2の還元条件はＮ
ＫＹ１３抗体について新たに設定した。上記(1)でプロ
テイン−Ａ精製したＮＫＹ１３抗体溶液を０.１Ｍ ＣＢ
(ｐＨ４.８)で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いたゲ
ルクロマトグラフィ−でバッファ−交換し、セントリコ
ン３０(Centricon 30)で濃縮して５.５ｍｇ／ｍｌの濃
度に調製した。同緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに調製したペプ
シン溶液を、ペプシン量が抗体の１／４００(重量比)と
なるように添加し、静置状態で水浴中３７℃で３０分間
反応させた。反応後、１Ｍ トリスを添加してｐＨを上
昇させ反応を停止し、反応液を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０.１ＭＰＢ(ｐＨ６.０)で平衡化したSuperose１２(１
６／５０)に付し、同緩衝液を用いて１.５ｍｌ／分の流
速で溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎に２８０ｎｍの吸
光度を測定し、吸光度からタンパク量を求め、メインピ
−クをＦ(ａｂ’)2画分とした。
【００２１】得られたＦ(ａｂ’)2をセントリコン３０
(Centricon 30)で濃縮して５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製
し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)で
２５ｍＭに調製した２−ＭＥＡを１／９容量添加して
(２−ＭＥＡ終濃度２.５ｍＭ)、静置状態で水浴中２５
℃で６０分間反応させた。反応後、反応液を５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)で平衡化したSup
erose１２(１６／５０)に付し、１.５ｍｌ／分の流速で
溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎の２８０ｎｍの吸光度
からタンパク量を求め、メインピ−クをＦａｂ’画分と
した。得られたＦａｂ’画分をセントリコン１０(Centr
icon 10)で濃縮し、４.０ｍｇ／ｍｌに調製した。Ｆａ
ｂ’１分子あたりのＳＨ基の数を石川らの方法(Ishikaw
a, E. et al.,前掲)で測定した。
(Centricon 30)で濃縮して５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製
し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)で
２５ｍＭに調製した２−ＭＥＡを１／９容量添加して
(２−ＭＥＡ終濃度２.５ｍＭ)、静置状態で水浴中２５
℃で６０分間反応させた。反応後、反応液を５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)で平衡化したSup
erose１２(１６／５０)に付し、１.５ｍｌ／分の流速で
溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎の２８０ｎｍの吸光度
からタンパク量を求め、メインピ−クをＦａｂ’画分と
した。得られたＦａｂ’画分をセントリコン１０(Centr
icon 10)で濃縮し、４.０ｍｇ／ｍｌに調製した。Ｆａ
ｂ’１分子あたりのＳＨ基の数を石川らの方法(Ishikaw
a, E. et al.,前掲)で測定した。
【００２２】一方、ＨＲＰを０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.０)
を用いて１１ｍｇ／１.６５ｍｌに調製し、ＥＭＣＳ
８.８ｍｇ／１１０μｌ ＤＭＳＯを添加し、０℃で１時
間撹拌しながら反応させた。反応後、３０００ｒｐｍで
１０分間遠心し、その上清を０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)
で平衡化したＰＤ−１０カラムに付し、ボイド(void)画
分をマレイミド化ＨＲＰとした。３.６ｍｇ／ｍｌのマ
レイミド化ＨＲＰを調製し、先に調製したＦａｂ’画分
と等量混合して、静置状態で４℃で２０時間反応させ
た。反応液を０.２Ｍ 塩化ナトリウム(NaCl)を含む０.
０５Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ７.２)で平衡化したSuperose
１２(１６／５０)に付し、同緩衝液で１.５ｍｌ／分の
流速で溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎の２８０ｎｍで
の吸収を測定し、その第一ピ−クを粗酵素標識抗体画分
とした。粗コンジュゲ−ト画分に塩化カルシウム(CaC
l2)および塩化マンガン(MnCl2)をそれぞれ１ｍＭとなる
ように添加して、０.２Ｍ 塩化ナトリウム(NaCl)および
１ｍＭ ＣａＣｌ2，ＭｎＣｌ2を含む０.０５Ｍ トリス
−塩酸(ｐＨ７.２)で平衡化したＣｏｎ Ａ セファロ−
ス カラム(１.０×１.５ｃｍ)に添加し、同緩衝液で洗
浄後、０.５Ｍ α−メチルマンノサイド(α-methylmann
oside)を含む同緩衝液で溶出し、吸着画分を精製酵素標
識抗体とした。
を用いて１１ｍｇ／１.６５ｍｌに調製し、ＥＭＣＳ
８.８ｍｇ／１１０μｌ ＤＭＳＯを添加し、０℃で１時
間撹拌しながら反応させた。反応後、３０００ｒｐｍで
１０分間遠心し、その上清を０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ６.０)
で平衡化したＰＤ−１０カラムに付し、ボイド(void)画
分をマレイミド化ＨＲＰとした。３.６ｍｇ／ｍｌのマ
レイミド化ＨＲＰを調製し、先に調製したＦａｂ’画分
と等量混合して、静置状態で４℃で２０時間反応させ
た。反応液を０.２Ｍ 塩化ナトリウム(NaCl)を含む０.
０５Ｍ トリス−塩酸(ｐＨ７.２)で平衡化したSuperose
１２(１６／５０)に付し、同緩衝液で１.５ｍｌ／分の
流速で溶出した。溶出液０.７５ｍｌ毎の２８０ｎｍで
の吸収を測定し、その第一ピ−クを粗酵素標識抗体画分
とした。粗コンジュゲ−ト画分に塩化カルシウム(CaC
l2)および塩化マンガン(MnCl2)をそれぞれ１ｍＭとなる
ように添加して、０.２Ｍ 塩化ナトリウム(NaCl)および
１ｍＭ ＣａＣｌ2，ＭｎＣｌ2を含む０.０５Ｍ トリス
−塩酸(ｐＨ７.２)で平衡化したＣｏｎ Ａ セファロ−
ス カラム(１.０×１.５ｃｍ)に添加し、同緩衝液で洗
浄後、０.５Ｍ α−メチルマンノサイド(α-methylmann
oside)を含む同緩衝液で溶出し、吸着画分を精製酵素標
識抗体とした。
【００２３】(3)抗体酵素複合体溶液の調製 上記(2)で調製した酵素標識抗体を１０μｇ／ｍｌ(終濃
度)に、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂを１、３、１０、３０μｇ／
ｍｌ(終濃度)になるように０.１％カゼインのＰＢＳ溶
液を用いて調製し、室温で２時間反応させて、抗体酵素
複合体溶液とした。また、上記(2)で調製した酵素標識
抗体を０.１％カゼインのＰＢＳ溶液を用いて１０μｇ
／ｍｌの濃度に調製したものを陰性対照として用いた。
度)に、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂを１、３、１０、３０μｇ／
ｍｌ(終濃度)になるように０.１％カゼインのＰＢＳ溶
液を用いて調製し、室温で２時間反応させて、抗体酵素
複合体溶液とした。また、上記(2)で調製した酵素標識
抗体を０.１％カゼインのＰＢＳ溶液を用いて１０μｇ
／ｍｌの濃度に調製したものを陰性対照として用いた。
【００２４】３．サンドイッチＥＩＡ系の感度上昇抗原固相プレ−トを用いた抗原固相ＥＬＩＳＡ (1)抗原固相プレ−トの調製 ＬＳ１８０Ｇ５０Ｉ １００μｇ／１００μｌ、０.０１
Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)１.９ｍｌ、０.２５％ グルタル
アルデヒド(gulutaraldehyde)のＰＢＳ溶液３０μｌを
混和して、ポリビニルクロライドマイクロタイタ−プレ
−ト(polyvinylchloride microtiter plate)に２０μｌ
／ウェル添加し、室温で１時間放置する。０.０１Ｍ Ｐ
ＢＳで０.２５ｍｇ／ｍｌに調製したＬ−ポリリジン(L-
polylysine)を１０μｌ／ウェル添加して混和し、４℃
で１８時間以上放置して抗原固相プレ−トとした。
Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)１.９ｍｌ、０.２５％ グルタル
アルデヒド(gulutaraldehyde)のＰＢＳ溶液３０μｌを
混和して、ポリビニルクロライドマイクロタイタ−プレ
−ト(polyvinylchloride microtiter plate)に２０μｌ
／ウェル添加し、室温で１時間放置する。０.０１Ｍ Ｐ
ＢＳで０.２５ｍｇ／ｍｌに調製したＬ−ポリリジン(L-
polylysine)を１０μｌ／ウェル添加して混和し、４℃
で１８時間以上放置して抗原固相プレ−トとした。
【００２５】(2)ＥＬＩＳＡ 上記(1)で作成した抗原固相プレ−トを、１％ ＢＳＡお
よび０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０.０１Ｍ ＰＢＳ
(ｐＨ７.４)(以下、Ｔｗｅｅｎ緩衝液と略す。)２００
μｌ／ウェルで３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ緩衝液２００μ
ｌ／ウェルを添加し、室温で１時間インキュベ−トして
ブロッキングした。緩衝液を吸引除去した後、上記２．
(3)で調製した抗体酵素複合体溶液および陰性対照液を
２０μｌ添加し、静置状態で２５℃で４時間反応させ、
反応後、Ｔｗｅｅｎ緩衝液２００μｌ／ウェルで３回洗
浄した。洗浄後、酵素反応基質発色液(２ｍＭ 過酸化水
素(H2O2)，４.３ｍＭ ＡＢＴＳの０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.
５)溶液)を１００μｌ／ウェル添加して、室温で３０分
間反応させ、反応停止液(０.７６ｍＭ アジ化ナトリウ
ム(NaN3)の０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)１００μｌ／
ウェルを添加した。反応液１５０μｌを別のポリスチレ
ン製マイクロタイタ−プレ−トに取り、４１５ｎｍ(吸
光値が高い場合は４５０ｎｍ)での吸光度を測定した。
その結果、図１に示したように、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂの
添加濃度に従い得られる吸光度は上昇し(図中、 -○-の
グラフ)、１０μｇ／ｍｌの濃度で反応性は約４倍に上
昇した。ただし、抗原を固相していないマイクロタイタ
−プレ−トを用いて同様の操作を行ない、ブランクとし
た(図中、-□-のグラフ)。
よび０.０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０.０１Ｍ ＰＢＳ
(ｐＨ７.４)(以下、Ｔｗｅｅｎ緩衝液と略す。)２００
μｌ／ウェルで３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ緩衝液２００μ
ｌ／ウェルを添加し、室温で１時間インキュベ−トして
ブロッキングした。緩衝液を吸引除去した後、上記２．
(3)で調製した抗体酵素複合体溶液および陰性対照液を
２０μｌ添加し、静置状態で２５℃で４時間反応させ、
反応後、Ｔｗｅｅｎ緩衝液２００μｌ／ウェルで３回洗
浄した。洗浄後、酵素反応基質発色液(２ｍＭ 過酸化水
素(H2O2)，４.３ｍＭ ＡＢＴＳの０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.
５)溶液)を１００μｌ／ウェル添加して、室温で３０分
間反応させ、反応停止液(０.７６ｍＭ アジ化ナトリウ
ム(NaN3)の０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)１００μｌ／
ウェルを添加した。反応液１５０μｌを別のポリスチレ
ン製マイクロタイタ−プレ−トに取り、４１５ｎｍ(吸
光値が高い場合は４５０ｎｍ)での吸光度を測定した。
その結果、図１に示したように、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂの
添加濃度に従い得られる吸光度は上昇し(図中、 -○-の
グラフ)、１０μｇ／ｍｌの濃度で反応性は約４倍に上
昇した。ただし、抗原を固相していないマイクロタイタ
−プレ−トを用いて同様の操作を行ない、ブランクとし
た(図中、-□-のグラフ)。
【００２６】ビ−ズ法サンドイッチＥＩＡ (1)ＮＫＹ１３抗体結合ビ−ズの調製 １／４インチ径のポリスチレンビ−ズに０.１５ｍｌ／
個のエタノ−ルを添加し、１０分間浸漬した後、１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)０.２ｍｌ／個で３回洗浄した。
次いでＰＢＳ ０.２ｍｌ／個を添加して３０分間脱気し
た後、３７℃の水浴で３０分間温置した。別に、抗体溶
液を２０μｇ／ｍｌに１０ｍＭ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で調
製し、同様に脱気して、３７℃の水浴で３０分間温置し
た。ビ−ズを浸しているＰＢＳを吸引除去して抗体溶液
０.２ｍｌ／個添加し、混和して、３７℃の水浴に温置
した。１５分間毎に混和する操作を４回繰り返し、３７
℃のインキュベ−タに移して、１９.５時間温置した。
抗体溶液を吸引除去した後、１０ｍＭ ＰＢＳ(ｐＨ７.
４)で３回洗浄し、０.１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液０.２ｍ
ｌ／個を添加して３７℃の水浴で２時間静置してブロッ
キングした。ブロッキング溶液を吸引除去した後、０.
０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で５回、続いて、Ｐ
ＢＳで３回洗浄した後、０.１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液０.
２ｍｌ／個を添加して４℃に保存し、少なくとも、１日
保存後に使用した。
個のエタノ−ルを添加し、１０分間浸漬した後、１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)０.２ｍｌ／個で３回洗浄した。
次いでＰＢＳ ０.２ｍｌ／個を添加して３０分間脱気し
た後、３７℃の水浴で３０分間温置した。別に、抗体溶
液を２０μｇ／ｍｌに１０ｍＭ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で調
製し、同様に脱気して、３７℃の水浴で３０分間温置し
た。ビ−ズを浸しているＰＢＳを吸引除去して抗体溶液
０.２ｍｌ／個添加し、混和して、３７℃の水浴に温置
した。１５分間毎に混和する操作を４回繰り返し、３７
℃のインキュベ−タに移して、１９.５時間温置した。
抗体溶液を吸引除去した後、１０ｍＭ ＰＢＳ(ｐＨ７.
４)で３回洗浄し、０.１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液０.２ｍ
ｌ／個を添加して３７℃の水浴で２時間静置してブロッ
キングした。ブロッキング溶液を吸引除去した後、０.
０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で５回、続いて、Ｐ
ＢＳで３回洗浄した後、０.１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液０.
２ｍｌ／個を添加して４℃に保存し、少なくとも、１日
保存後に使用した。
【００２７】(2)抗原の存在しないヒト血清の調製 ０.１Ｍ重炭酸塩緩衝液(bicarbonate buffer)(ｐＨ８.
３)を用いて調製したＮＫＹ１３抗体５０ｍｇ／２０ｍ
ｌと１ｍＭ 塩酸で膨潤させたシアン化臭素−活性化セ
ファロ−ス ４Ｂ(CNBr-activated Sepharose 4B)１０ｍ
ｌを混和し、撹拌しながら室温で２時間反応させた。グ
ラスフィルタ−でゲルを濾取し、１Ｍ エタノ−ルアミ
ン(ｐＨ８.０)で２時間ブロッキングして、ＮＫＹ１３
抗体固相セファロ−ス４Ｂを調製した。ヒト血清３０ｍ
ｌを、０.０１Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で平衡化したＮＫ
Ｙ１３抗体固相セファロ−ス４Ｂカラム(１.０ｃｍ×
８.０ｃｍ)に０.３ｍｌ／分の流速で付し、最初の溶出
液１０ｍｌを捨て、残りを１８時間リサイクルし抗原を
吸収した。
３)を用いて調製したＮＫＹ１３抗体５０ｍｇ／２０ｍ
ｌと１ｍＭ 塩酸で膨潤させたシアン化臭素−活性化セ
ファロ−ス ４Ｂ(CNBr-activated Sepharose 4B)１０ｍ
ｌを混和し、撹拌しながら室温で２時間反応させた。グ
ラスフィルタ−でゲルを濾取し、１Ｍ エタノ−ルアミ
ン(ｐＨ８.０)で２時間ブロッキングして、ＮＫＹ１３
抗体固相セファロ−ス４Ｂを調製した。ヒト血清３０ｍ
ｌを、０.０１Ｍ ＰＢＳ(ｐＨ７.４)で平衡化したＮＫ
Ｙ１３抗体固相セファロ−ス４Ｂカラム(１.０ｃｍ×
８.０ｃｍ)に０.３ｍｌ／分の流速で付し、最初の溶出
液１０ｍｌを捨て、残りを１８時間リサイクルし抗原を
吸収した。
【００２８】(3)標準溶液の調製 ＬＳ１８０Ｇ５０Ｉを、０.１％カゼインのＰＢＳ溶液
もしくは上記(2)で調製した抗原の存在しないヒト血清
を用いて、０.０７８、０.３１３、１.２５、５、１０
μｇ／ｍｌの濃度に調製して、標準溶液とした。
もしくは上記(2)で調製した抗原の存在しないヒト血清
を用いて、０.０７８、０.３１３、１.２５、５、１０
μｇ／ｍｌの濃度に調製して、標準溶液とした。
【００２９】(4)ビ−ズ法サンドイッチＥＩＡ チュ−ブに、上記(3)で調製した標準溶液２０μｌ、０.
１％カゼインのＰＢＳ溶液１００μｌ、上記２．(3)で
調整した抗体酵素複合体溶液のうち抗ＨＲＰ ＭｃＡｂ
濃度が１０μｇ／ｍｌのもの５０μｌを取り、撹拌後、
上記(1)で調製したＮＫＹ１３抗体結合ビ−ズを１個添
加した。室温で１８時間反応させた後、０.０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液２ｍｌで３回洗浄した。ビ−ズ
を新しいチュ−ブに移し換え、酵素反応基質発色液(２
ｍＭ 過酸化水素(H2O2)、４.３ｍＭＡＢＴＳの０.１Ｍ
ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)３００μｌを添加し、３７℃で３
０分間反応させた。反応停止液(０.３８ｍＭ アジ化ナ
トリウム(NaN3)の０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)２ｍｌ
を添加して反応を止め、反応液の４１５ｎｍでの吸光度
を測定した。また、抗体酵素複合体溶液の陰性対照液を
用いて同様の操作を行なった。その結果、図２に示した
ように、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂが存在する場合(図中、-○-
のグラフ)は、存在しない場合(図中、-●-のグラフ)に
比べて顕著に反応性は上昇し、感度は約４倍上昇した。
１％カゼインのＰＢＳ溶液１００μｌ、上記２．(3)で
調整した抗体酵素複合体溶液のうち抗ＨＲＰ ＭｃＡｂ
濃度が１０μｇ／ｍｌのもの５０μｌを取り、撹拌後、
上記(1)で調製したＮＫＹ１３抗体結合ビ−ズを１個添
加した。室温で１８時間反応させた後、０.０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液２ｍｌで３回洗浄した。ビ−ズ
を新しいチュ−ブに移し換え、酵素反応基質発色液(２
ｍＭ 過酸化水素(H2O2)、４.３ｍＭＡＢＴＳの０.１Ｍ
ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)３００μｌを添加し、３７℃で３
０分間反応させた。反応停止液(０.３８ｍＭ アジ化ナ
トリウム(NaN3)の０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)溶液)２ｍｌ
を添加して反応を止め、反応液の４１５ｎｍでの吸光度
を測定した。また、抗体酵素複合体溶液の陰性対照液を
用いて同様の操作を行なった。その結果、図２に示した
ように、抗ＨＲＰ ＭｃＡｂが存在する場合(図中、-○-
のグラフ)は、存在しない場合(図中、-●-のグラフ)に
比べて顕著に反応性は上昇し、感度は約４倍上昇した。
【００３０】さらに標準溶液の溶媒を０.１％カゼイン
のＰＢＳ溶液から抗原の存在しないヒト血清に変更する
ことにより、ブランクの４１５ｎｍでの吸光値を０.０
８〜０.０９から０.０２８まで低下させることができ
た。
のＰＢＳ溶液から抗原の存在しないヒト血清に変更する
ことにより、ブランクの４１５ｎｍでの吸光値を０.０
８〜０.０９から０.０２８まで低下させることができ
た。
【００３１】実施例２ １．酵素標識抗体の調製 ｈＡＮＰに対するモノクロ−ナル抗体であるＫＹ−ＡＮ
Ｐ−Ｉ抗体を用いて、実施例１と同様、石川らの方法に
従い、ＮＫＹ１３抗体の酵素標識抗体の調製に準じて、
ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体の酵素標識抗体を調製した。ＫＹ
−ＡＮＰ−Ｉ抗体は、１９８７年８月２０日からPHLS C
AMR、 Porton Down、 Salisbury、 Wilts、 United Kingdom
ion のECACC (European Collection of Animal Cell Cu
ltures)にブダペスト条約に基づき受託番号８７０８２
００１として寄託されているハイブリド−マ「ＫＹ−Ａ
ＮＰ−Ｉ」を用いて、特開平１−６１５００に記載の方
法で作製した。得られた酵素標識抗体は、０.１％ＢＳ
Ａを含むリン酸緩衝液に５００ｍｇ／ｍｌになるように
溶解して測定系に用いた。
Ｐ−Ｉ抗体を用いて、実施例１と同様、石川らの方法に
従い、ＮＫＹ１３抗体の酵素標識抗体の調製に準じて、
ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ抗体の酵素標識抗体を調製した。ＫＹ
−ＡＮＰ−Ｉ抗体は、１９８７年８月２０日からPHLS C
AMR、 Porton Down、 Salisbury、 Wilts、 United Kingdom
ion のECACC (European Collection of Animal Cell Cu
ltures)にブダペスト条約に基づき受託番号８７０８２
００１として寄託されているハイブリド−マ「ＫＹ−Ａ
ＮＰ−Ｉ」を用いて、特開平１−６１５００に記載の方
法で作製した。得られた酵素標識抗体は、０.１％ＢＳ
Ａを含むリン酸緩衝液に５００ｍｇ／ｍｌになるように
溶解して測定系に用いた。
【００３２】２．抗ＨＲＰ抗体溶液の調製 抗ＨＲＰポリクロ−ナル抗体（Dako社製）を、０、１０
０、２００ｎｇ ｔｉｔｅｒ／ｍｌとなるように０.１％
ＢＳＡを含むリン酸緩衝液に溶解して、測定系に用い
た。
０、２００ｎｇ ｔｉｔｅｒ／ｍｌとなるように０.１％
ＢＳＡを含むリン酸緩衝液に溶解して、測定系に用い
た。
【００３３】３．ＡＮ１１１抗体結合ビ−ズの調製 ＡＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体であるＡＮ
１１１抗体の結合ビ−ズを、実施例１のＮＫＹ１３抗体
結合ビ−ズの調製に準じて調製した。ＡＮ１１１抗体
は、１９８８年１２月２０日から茨城県つくば市東１−
１−３（郵便番号３０５）にある工業技術院微生物工業
技術研究所にブダペスト条約に基づき受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−２１９７として寄託されている「Mouse hybrid
oma AN111」を用いて、特開平２−２７６５９１に記載
の方法で作製した。
１１１抗体の結合ビ−ズを、実施例１のＮＫＹ１３抗体
結合ビ−ズの調製に準じて調製した。ＡＮ１１１抗体
は、１９８８年１２月２０日から茨城県つくば市東１−
１−３（郵便番号３０５）にある工業技術院微生物工業
技術研究所にブダペスト条約に基づき受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−２１９７として寄託されている「Mouse hybrid
oma AN111」を用いて、特開平２−２７６５９１に記載
の方法で作製した。
【００３４】４．標準溶液の調製 ｈＡＮＰ（ペプチド研）を０.１％ＢＳＡを含むリン酸
緩衝液に２０、６０、２００、６００、２０００ｐｇ／
ｍｌになるように溶解して、測定系に用いた。
緩衝液に２０、６０、２００、６００、２０００ｐｇ／
ｍｌになるように溶解して、測定系に用いた。
【００３５】５．ビ−ズ法サンドイッチＥＩＡ チュ−ブに標準溶液１００μｌ、酵素標識抗体溶液１０
０μｌ、抗ＨＲＰ抗体溶液１００μｌをとり、撹拌後、
ＡＮ１１１抗体結合ビ−ズを１個添加した。４℃で２０
時間反応させた後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ
溶液２ｍｌで３回洗浄した。ビ−ズを新しいチュ−ブに
移し替え、酵素反応基質発色液（２ｍＭ過酸化水素およ
び４.３ｍＭ ＡＢＴＳを含む０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.
５)）３００μｌを添加し、３７℃で３０分間反応させ
た。反応停止液（０.３８ｍＭアジ化ナトリウムを含む
０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)）２ｍｌを添加して反応を止
め、反応液の４１５ｎｍの吸光度を測定した。その結
果、図３に示すように、抗ＨＲＰ抗体を用いない場合
（図中、−○−のグラフ）に比べ、１００ｎｇ／ｍｌ、
２００ｎｇ／ｍｌの抗ＨＲＰ抗体を用いた場合（図中、
それぞれ−△−、−□−のグラフ）には反応性は上昇
し、得られる吸光度は約３倍に上昇した。
０μｌ、抗ＨＲＰ抗体溶液１００μｌをとり、撹拌後、
ＡＮ１１１抗体結合ビ−ズを１個添加した。４℃で２０
時間反応させた後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ
溶液２ｍｌで３回洗浄した。ビ−ズを新しいチュ−ブに
移し替え、酵素反応基質発色液（２ｍＭ過酸化水素およ
び４.３ｍＭ ＡＢＴＳを含む０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.
５)）３００μｌを添加し、３７℃で３０分間反応させ
た。反応停止液（０.３８ｍＭアジ化ナトリウムを含む
０.１Ｍ ＣＢ(ｐＨ４.５)）２ｍｌを添加して反応を止
め、反応液の４１５ｎｍの吸光度を測定した。その結
果、図３に示すように、抗ＨＲＰ抗体を用いない場合
（図中、−○−のグラフ）に比べ、１００ｎｇ／ｍｌ、
２００ｎｇ／ｍｌの抗ＨＲＰ抗体を用いた場合（図中、
それぞれ−△−、−□−のグラフ）には反応性は上昇
し、得られる吸光度は約３倍に上昇した。
【図１】本発明の抗体酵素複合体(第一抗体：ＮＫＹ１
３抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲＰ、第二
抗体：抗ＨＲＰＭｃＡｂ)を用いて一定量のＬＳ１８０
Ｇ５０Ｉを含む試料の抗原固相ＥＬＩＳＡを行なったと
きの、抗ＨＲＰＭｃＡｂの濃度と吸光度との関係を示す
グラフである。
３抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲＰ、第二
抗体：抗ＨＲＰＭｃＡｂ)を用いて一定量のＬＳ１８０
Ｇ５０Ｉを含む試料の抗原固相ＥＬＩＳＡを行なったと
きの、抗ＨＲＰＭｃＡｂの濃度と吸光度との関係を示す
グラフである。
【図２】本発明の抗体酵素複合体(第一抗体：ＮＫＹ１
３抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲＰ、第二
抗体：抗ＨＲＰＭｃＡｂ)を用いて既知量のＬＳ１８０
Ｇ５０Ｉを含む試料のビ−ズ法サンドイッチＥＩＡを行
なったときに得られる標準曲線を示す。
３抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲＰ、第二
抗体：抗ＨＲＰＭｃＡｂ)を用いて既知量のＬＳ１８０
Ｇ５０Ｉを含む試料のビ−ズ法サンドイッチＥＩＡを行
なったときに得られる標準曲線を示す。
【図３】本発明の抗体酵素複合体（第一抗体：ＫＹ−Ａ
ＮＰ−Ｉ抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲ
Ｐ、第二抗体：抗ＨＲＰポリクロ−ナル抗体）を測定系
中で形成させながらｈＡＮＰのビ−ズ法サンドイッチＥ
ＩＡを行なったときに得られる標準曲線を示す。
ＮＰ−Ｉ抗体、架橋試薬：ＥＭＣＳ、標識酵素：ＨＲ
Ｐ、第二抗体：抗ＨＲＰポリクロ−ナル抗体）を測定系
中で形成させながらｈＡＮＰのビ−ズ法サンドイッチＥ
ＩＡを行なったときに得られる標準曲線を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 酵素との結合により抗原との結合力が低
下した第一抗体であるＮＫＹ１３抗体またはＫＹ−ＡＮ
Ｐ−Ｉが該酵素と架橋試薬により結合し、該酵素が該酵
素に対する第二抗体により結合している、該第一抗体の
抗原との結合力が回復した抗体酵素複合体からなる測定
感度が上昇した酵素免疫測定試薬。 - 【請求項２】 該第一抗体が抗体フラグメントである請
求項１記載の試薬。 - 【請求項３】 該第一抗体フラグメントがＦａｂ’であ
る請求項２記載の試薬。 - 【請求項４】 該酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある請求項１記載の試薬。 - 【請求項５】 該架橋試薬がＮ−（ε−マレイミドカプ
ロイルオキシ）スクシンイミドである請求項１記載の試
薬。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の試薬を
用いた酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15865492A JP3247147B2 (ja) | 1991-05-29 | 1992-05-25 | 抗体酵素複合体およびそれを用いた酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15559491 | 1991-05-29 | ||
| JP3-155594 | 1991-05-29 | ||
| JP15865492A JP3247147B2 (ja) | 1991-05-29 | 1992-05-25 | 抗体酵素複合体およびそれを用いた酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05180839A JPH05180839A (ja) | 1993-07-23 |
| JP3247147B2 true JP3247147B2 (ja) | 2002-01-15 |
Family
ID=26483550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15865492A Expired - Lifetime JP3247147B2 (ja) | 1991-05-29 | 1992-05-25 | 抗体酵素複合体およびそれを用いた酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3247147B2 (ja) |
-
1992
- 1992-05-25 JP JP15865492A patent/JP3247147B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05180839A (ja) | 1993-07-23 |
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