CN112830956B - 棕榈酰四肽-7的液相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了棕榈酰四肽‑7的液相合成方法，其特征在于包括Boc‑Pro‑OH的合成、Boc‑Pro‑OSu的合成、Boc‑Pro‑Arg‑OH的合成、H‑Pro‑Arg‑OH TFA盐的合成、Pal‑Gly‑Gln‑OH的合成、Pal‑Gly‑Gln‑ONp的合成、Pal‑Gly‑Gln‑Pro‑Arg‑OH的合成；本发明的有益效果是：通过合成Pal‑Gly‑Gln‑ONp，并控制Pal‑Gly‑Gln‑Pro‑Arg‑OH的反应条件，避免Pal‑Gly‑Gln‑OH的环化，提高了反应收率和纯度，降低了生产成本；通过采用甲醇+乙腈作为精制溶剂，进一步地去除杂质，提高了纯度。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药制备方法技术领域，更具体地涉及棕榈酰四肽-7的液相合成方法。
背景技术：
棕榈酰四肽-7(Palmitoyl Tetrapeptide-7)可以延缓和抑制过量细胞白介素的生成，从而抑制一些不必要不恰当的炎症反应和糖基化损伤。在体外实验中，科学家们发现在细胞白介素生成时，“棕榈酰四肽-7诱导呈现出一种显著的剂量依赖性减少。棕榈酰四肽-7的剂量越高，细胞白介素减少得越多—高达40％。”已知UV紫外线辐射可以促进细胞白介素的生成,细胞与紫外线辐射接触，然后用棕榈酰四肽-7(Palmitoyl Tetrapeptide-7)治疗，可以看到细胞白介素减少86％。棕榈酰四肽-7是Matrixyl 3000中的一种关键成分，与棕榈酰寡肽(Palmitoyl Oligopeptide)一起结合使用。它们一起促进结缔组织的生长，增加皮肤中的胶原蛋白的生成；当胶原蛋白增加的时候，皮肤可以自我愈合和再生。
现有合成路线Gln的酰胺键需要保护，大大增加了生产成本。现有技术多采用固相合成方法，首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上，在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基X，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。
最近也报道了液相合成方法，但是R1-Gln-OH与NH2-R1对接时副反应多，摩尔收率低，难纯化，导致产品的杂质超量，严重影响了产品的品质。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种棕榈酰四肽-7的液相合成方法，能够有效的解决液相合成方法R1-Gln-OH与NH2-R1对接时副反应多，摩尔收率低，难纯化，导致产品的杂质超量，严重影响了产品的品质的问题。
本说明书和权利要求书所使用的缩写及英文的含义如下：
| 英文缩写 | 代表含义 | 英文缩写 | 代表含义 |
| Boc | 甲酸叔丁酯基 | CDI | N,N-碳酰二咪唑 |
| DCM | 二氯甲烷 | DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCC | 二环己基碳二亚胺 | GQPR | H-Gly-Gln-Pro-Arg-OH |
| HOSu | N-羟基琥珀酰亚胺 | HONp | 对硝基苯酚 |
| Pal-Cl | 棕榈酰氯 | TFA | 三氟乙酸 |
| THF | 四氢呋喃 | TLC | 薄层层析法 |
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为
棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于具体步骤包括：
(1)Boc-Pro-OH的合成
在反应溶剂甲醇中，搅拌下加入脯氨酸和Boc酸酐，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺,滴加完22-27℃反应12-16h，50-60℃浓缩至干，得到Boc-Pro-OH；
(2)Boc-Pro-OSu的合成
在反应溶剂THF中,搅拌下加入步骤(1)得到的Boc-Pro-OH，降温至0-5℃，加入HOSu，滴加DCC与THF的混合溶液，滴加完室温反应2h，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体Boc-Pro-OSu；
(3)Boc-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入精氨酸和碳酸氢钠，并向料液中滴加Boc-Pro-OSu与THF的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝6.5-7，外浴降温，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼真空干燥箱50℃干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH；
(4)H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
在反应溶剂TFA中，搅拌下加入步骤(3)得到的Boc-Pro-Arg-OH，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐；
(5)Pal-Gly-Gln-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌加入H-Gly-Gln-OH，用30％氢氧化钠溶液调pH＝13，搅拌溶解，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl和THF的混合溶液,控制pH＝11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH＝2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-OH；
(6)Pal-Gly-Gln-ONp的合成
在反应溶剂DMF中，搅拌下加入步骤(5)得到的Pal-Gly-Gln-OH、HONp、DCC,50℃反应2-2.5h,向料液中滴加水，加完搅拌半小时，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h,得到Pal-Gly-Gln-ONp；
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐、用三乙胺控制pH＝8-9,把步骤(6)得到的Pal-Gly-Gln-Pro-ONp和DMF的混合溶液滴加到料液中，控制pH＝8-9，滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2-2.5，外浴降温，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到棕榈酰四肽-7粗品。
进一步地，所述的步骤(7)得到的棕榈酰四肽-7粗品外浴50℃溶于甲醇，并向料液中滴加乙腈，25℃静置结晶2-4h，过滤得到产品，50℃真空干燥箱干燥12h，得到棕榈酰四肽-7。
进一步地，所述的棕榈酰四肽-7粗品：甲醇：乙腈＝2g:3ml：6ml-9ml。
进一步地，所述的步骤(6)中，DMF：Pal-Gly-Gln-OH：HONp：DCC：水＝30ml：4g：1.39g-1.64g：2.24g：100ml。
本发明的有益效果是：
1.通过合成Pal-Gly-Gln-ONp，并控制Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的反应条件，避免的副反应，提高了反应收率和纯度，降低了生产成本；
2.通过采用甲醇+乙腈作为精制溶剂，进一步地去除杂质，提高了纯度。
附图说明：
附图1是本发明合成路线示意图；附图中：
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于具体步骤包括：
(1)Boc-Pro-OH的合成
在反应溶剂甲醇中，搅拌下加入脯氨酸和Boc酸酐，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺,滴加完22-27℃反应12-16h，50-60℃浓缩至干，得到Boc-Pro-OH；
(2)Boc-Pro-OSu的合成
在反应溶剂THF中,搅拌下加入步骤(1)得到的Boc-Pro-OH，降温至0-5℃，加入HOSu，滴加DCC与THF的混合溶液，滴加完室温反应2h，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体Boc-Pro-OSu；
(3)Boc-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入精氨酸和碳酸氢钠，并向料液中滴加Boc-Pro-OSu与THF的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝6.5-7，外浴降温，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼真空干燥箱50℃干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH；
(4)H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
在反应溶剂TFA中，搅拌下加入步骤(3)得到的Boc-Pro-Arg-OH，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐；
(5)Pal-Gly-Gln-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌加入H-Gly-Gln-OH，用30％氢氧化钠溶液调pH＝13，搅拌溶解，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl和THF的混合溶液,控制pH＝11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH＝2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-OH；
(6)Pal-Gly-Gln-ONp的合成
在反应溶剂DMF中，搅拌下加入步骤(5)得到的Pal-Gly-Gln-OH、HONp、DCC,50℃反应2h,向料液中滴加水，加完搅拌半小时，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-ONp；
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐、用三乙胺调pH＝8-9,把步骤(6)得到的Pal-Gly-Gln-Pro-ONp和DMF的混合溶液滴加到料液中，用三乙胺控制pH＝8-9，滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2-2.5，外浴降温，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到棕榈酰四肽-7粗品。
进一步地，所述的步骤(7)得到的棕榈酰四肽-7粗品外浴50℃溶于甲醇，并向料液中滴加乙腈，25℃静置结晶2-4h，过滤得到产品，50℃真空干燥箱干燥12h，得到棕榈酰四肽-7。
进一步地，所述的棕榈酰四肽-7粗品：甲醇：乙腈＝2g:3ml：6ml-9ml。
进一步地，所述的步骤(6)中，DMF：Pal-Gly-Gln-OH：HONp：DCC：水＝30ml：4g：1.39g-1.64g：2.24g：100ml。
实施例一：
(1)Boc-Pro-OH的合成
向三口瓶中，加入10ml甲醇，搅拌下加入脯氨酸2g(17.37mmol)、Boc酸酐4.55g(20.85mmol),外浴降温，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺2.11g(20.85mmol),滴加完25℃反应14h，55℃浓缩至干，得到Boc-Pro-OH3.5g，摩尔收率93.6％。
(2)Boc-Pro-OSu的合成
向三口瓶中，加入四氢呋喃14ml,搅拌下加入Boc-Pro-OH3g(13.94mmol)，降温至0-5℃，加入HOSu1.92g(16.72mmol)，滴加DCC3.45g(16.72mmol)与10ml四氢呋喃的混合溶液，滴加完室温反应2小时，过滤，滤液减压浓缩得到Boc-Pro-OSu4.21g，摩尔收率96.55％。
(3)Boc-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入精氨酸1.39g(8mmol)、碳酸氢钠1.35g(16mmol)，向料液中滴加Boc-Pro-OSu2.5g(8mmol)+THF13ml的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝6.5-7，外浴降温，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH2.82g,摩尔收率94.94％。
(4)H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
向三口瓶中，加入10ml的TFA，搅拌下加入Boc-Pro-Arg-OH 2g(5.38mmol)，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐2.57g，摩尔收率95.5％。
(5)Pal-Gly-Gln-OH的合成
向三口瓶中，加入50ml水，搅拌下加入H-Gly-Gln-OH4.07g(20.01mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝13，搅拌溶解，外浴降温，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl5g(18.19mmol)+10ml四氢呋喃的混合溶液,控制pH＝11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH＝2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到7.6g的Pal-Gly-Gln-OH，摩尔收率95％。
(6)Pal-Gly-Gln-ONp的合成
向三口瓶中，加入30ml的DMF，搅拌下加入4g Pal-Gly-Gln-OH(9.06mmol)、HONp1.39g(9.96mmol)、DCC 2.24g(10.87mmol),50℃反应2h，向料液中滴加100ml水，加完搅拌半小时过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，干燥得到4.95g的Pal-Gly-Gln-ONp，摩尔收率97％。
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入2.13g的H-Pro-Arg–OH的TFA盐(4.27mmol)、用三乙胺调pH＝8-9,把Pal-Gly-Gln-Pro-ONp2g(3.55mmol)+DMF13ml的混合溶液滴加到料液中，滴加过程中用三乙胺控制pH＝8-9,滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2.3，外浴降温，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到类白色固体，50℃外浴下，固体溶于3ml甲醇中，向料液中滴加6ml的乙腈，25℃静置结晶2h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到合格的Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH，1.86g，纯度98.3％，摩尔收率75.3％。
实施例二：
(1)Boc-Pro-OH的合成
向三口瓶中，加入10ml甲醇，搅拌下加入脯氨酸2g(17.37mmol)、Boc酸酐4.55g(20.85mmol)，冷井降温，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺2.11g(20.85mmol),滴加完25℃反应14h，55℃浓缩至干，得到3.52g的Boc-Pro-OH，摩尔收率94.1％；
(2)Boc-Pro-OSu的合成
向三口瓶中，加入四氢呋喃14ml,搅拌下加入Boc-Pro-OH3g(13.94mmol)，降温至0-5℃，加入HOSu 1.92g(16.72mmol)，滴加DCC 3.45g(16.72mmol)与10ml四氢呋喃的混合溶液，滴加完室温反应2小时，过滤，滤液减压浓缩得到Boc-Pro-OSu4.23g，摩尔收率97.24％。
(3)Boc-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入精氨酸1.39g(8mmol)、碳酸氢钠1.35g(16mmol)，向料液中滴加Boc-Pro-OSu2.5g(8mmol)+THF13ml的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝6.5-7，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH2.84g，摩尔收率95.62％；
(4)H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
向三口瓶中，加入10ml的TFA，搅拌下加入的Boc-Pro-Arg-OH2g(5.38mmol)，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到的H-Pro-Arg-OH TFA盐2.58g，摩尔收率95.9％。
(5)Pal-Gly-Gln-OH的合成
向三口瓶中，加入50ml水，搅拌下加入H-Gly-Gln-OH4.07g(20.01mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝13，搅拌溶解，冰浴降温，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl5g(18.19mmol)+10ml四氢呋喃的混合溶液,控制pH＝11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH＝2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-OH7.57g，摩尔收率94.27％；
(6)Pal-Gly-Gln-ONp的合成
向三口瓶中，加入30ml的DMF，搅拌下加入Pal-Gly-Gln-OH4g(9.06mmol)、HONp1.5g(10.74mmol)、DCC 2.24g(10.87mmol),50℃反应2h，向料液中滴加100ml水，加完搅拌半小时过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-ONp4.93g，摩尔收率95.88％；
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐2.13g(4.27mmol)、用三乙胺调pH＝8-9,把Pal-Gly-Gln-Pro-ONp2g(3.55mmol)+DMF13ml的混合溶液滴加到料液中，滴加过程中用三乙胺控制pH＝8-9,滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2.4，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到类白色固体，50℃外浴下，固体溶于3ml甲醇中，向料液中滴加7ml的乙腈，25℃静置结晶3h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH1.83g，纯度98.4％，摩尔收率74.09％；
实施例三：
(1)Boc-Pro-OH的合成
向三口瓶中，加入10ml甲醇，搅拌下加入脯氨酸2g(17.37mmol)、Boc酸酐4.55g(20.85mmol)，冷井降温，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺2.11g(20.85mmol),滴加完25℃反应14h，55℃浓缩至干，得到Boc-Pro-OH3.51g，摩尔收率93.8％。
(2)Boc-Pro-OSu的合成
向三口瓶中，加入四氢呋喃14ml,搅拌下加入Boc-Pro-OH3g(13.94mmol)，降温至0-5℃，加入HOSu 1.92g(16.72mmol)，滴加DCC 3.45g(16.72mmol)与10ml四氢呋喃的混合溶液，滴加完室温反应2小时，过滤，滤液减压浓缩得到Boc-Pro-OSu4.22g，摩尔收率97.01％。
(3)Boc-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入精氨酸1.39g(8mmol)、碳酸氢钠1.35g(16mmol)，向料液中滴加2.5g的Boc-Pro-OSu(8mmol)+THF13ml的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝6.5-7，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH2.79g，摩尔收率93.93％。
(4)H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
向三口瓶中，加入10ml的TFA，搅拌下加入Boc-Pro-Arg-OH2g(5.38mmol)，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐2.56g，摩尔收率95.16％。
(5)Pal-Gly-Gln-OH的合成
向三口瓶中，加入50ml水，搅拌下加入H-Gly-Gln-OH4.07g(20.01mmol)，用30％氢氧化钠溶液调pH＝13，搅拌溶解，冰浴降温，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl5g(18.19mmol)+10ml四氢呋喃的混合溶液,控制pH＝11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH＝2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐7.61g，摩尔收率94.77％；
(6)Pal-Gly-Gln-ONp的合成
向三口瓶中，加入30ml的DMF，搅拌下加入Pal-Gly-Gln-OH4g(9.06mmol)、HONp1.64g(11.53mmol)、DCC 2.24g(10.87mmol),50℃反应2h，向料液中滴加100ml水，加完搅拌半小时过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-ONp4.89g，摩尔收率95.88％；
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐2.13g(4.27mmol)、用三乙胺调pH＝8-9,把Pal-Gly-Gln-Pro-ONp2g(3.55mmol)+DMF13ml的混合溶液滴加到料液中，滴加过程中用三乙胺控制pH＝8-9,滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2.5，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到类白色固体，50℃外浴下，固体溶于3ml甲醇中，向料液中滴加9ml的乙腈，25℃静置结晶4h，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH1.82g，纯度98.3％，摩尔收率74.90％；
为了更加直观的展现本发明的步骤(7)精制工艺优势，进行对比实验，
对比例一：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤(7)中的精制溶剂替换成DMSO；
对比例二：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤(7)中的精制溶剂替换成DMF；
对比例三：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤(7)中的精制溶剂替换成甲醇；测定棕榈酰四肽-7纯度，结果如下：
表1：不同精制溶剂对于棕榈酰四肽-7纯度的影响
| 实验组 | 精制溶剂 | 保温 | 25℃静置 | 纯度 |
| 实施例一 | 甲醇+乙腈 | 50℃ | + | 98.3％ |
| 实施例二 | 甲醇+乙腈 | 50℃ | + | 98.4％ |
| 实施例三 | 甲醇+乙腈 | 50℃ | + | 98.3％ |
| 对比例一 | DMSO | 50℃ | + | 无法得到固体 |
| 对比例二 | DMF | 50℃ | + | 无法得到固体 |
| 对比例三 | 甲醇 | 50℃ | + | 无法得到固体 |
由表1数据分析可知：根据对比例一到三，采用常规的精制溶剂包括甲醇，均不能获得目的物棕榈酰四肽-7；长期以来一致认为棕榈酰四肽-7无法利用精制溶剂包括但不限于甲醇和乙醚，通过精制手段对棕榈酰四肽-7进行提纯；
本发明创造性地找到了以甲醇+乙腈作为混合溶剂，进行精制并获得了提高纯度的效果。
为了更加直观的展现本发明的工艺优势，进行对比实验，
对比例四：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤(6)中的HONp替换成CDI，具体的：
(6)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入30ml的DMF，搅拌下加入Pal-Gly-Gln-OH 2g(4.53mmol)、CDI0.77g(4.76mmol),25℃反应2h，搅拌下把料液滴到H-Pro-Arg-OH的TFA盐2.71g(5.43mmol)+三乙胺1.1g(10.87mmol)+DMF20ml的料液中，25℃反应2h，用浓盐酸调pH＝2.5，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤得到粘稠物,粘稠物50℃真空干燥箱干燥14h,得到粘稠物，50℃外浴下，粘稠物溶于3ml甲醇中，向料液中滴加9ml的乙腈，25℃静置结晶4h，得到粘稠物，无法得到固体，粘稠物真空干燥箱50℃干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH3.1g,纯度67.3％，摩尔收率120％；
对比例五：
制备方法同实施例一，所不同的是：本对比例的制备过程中，步骤(6)中的HONp替换成HOSu，具体的：
(6)Pal-Gly-Gln-OSu的合成
向三口瓶中，加入30ml的DMF，搅拌下加入Pal-Gly-Gln-OH4g(9.06mmol)、HOSu1.15g(9.96mmol)、DCC 2.24g(10.87mmol),50℃反应2h，向料液中滴加100ml水，加完搅拌半小时过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-OSu4.6g，摩尔收率94.2％；
(7)Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
向三口瓶中，加入13ml水，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐2.22g(4.46mmol)、用三乙胺控制pH＝8-9,把Pal-Gly-Gln-Pro-OSu2g(3.71mmol)+DMF13ml的混合溶液滴加到料液中，控制pH＝8-9，滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH＝2.5，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤得到粘稠物,粘稠物50℃真空干燥箱干燥14h，得到粘稠物，50℃外浴下，粘稠物溶于3ml甲醇中，向料液中滴加9ml的乙腈，25℃静置结晶4h，得到粘稠物，无法得到固体，粘稠物真空干燥箱50℃干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH1.9g,纯度87.3％，摩尔收率73.6％；并测定棕榈酰四肽-7纯度及杂质的种类，结果如下：
表2：不同反应溶剂对于棕榈酰四肽-7成环反应的影响
| 实验组 | 反应试剂 | 杂质种类 | 纯度 |
| 实施例一 | HONp | Pal-Gly-Gln-OH自身环合 | 98.3％ |
| 对比例四 | CDI | Pal-Gly-Gln-OH自身环合 | 67.3％ |
| 对比例五 | HOSu | Pal-Gly-Gln-OH自身环合 | 87.3％ |
由表2数据分析可知，采用常用的反应试剂如CDI和HOSu，在液相合成棕榈酰四肽-7的过程中，如对比例四和对比例五，会产生较为严重的Pal-Gly-Gln-OH自身环合，导致杂质的大量产生；
本发明采用HONp作为反应试剂，并根据该反应试剂调整反应步骤，通过合成Pal-Gly-Gln-ONp，并控制Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的反应条件，极大程度上避免了Pal-Gly-Gln-OH的自身环合，提高了反应收率和纯度。
综上所述：
1.本发明采用HONp作为反应试剂，并根据该反应试剂调整反应步骤，通过合成Pal-Gly-Gln-ONp，并控制Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的反应条件，极大程度上避免了Pal-Gly-Gln-OH的自身环合，提高了反应收率和纯度；
2.本发明创造性地找到了以甲醇+乙腈作为结晶溶剂，进行精制并获得了提高纯度的效果。
Claims (4)
1. 棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于具体步骤包括：
（1）Boc-Pro-OH的合成
在反应溶剂甲醇中，搅拌下加入脯氨酸和Boc酸酐，控制料温≤5℃，向料液中滴加三乙胺, 滴加完22-27℃反应12-16h，50-60℃浓缩至干，得到Boc-Pro-OH；
（2）Boc-Pro-OSu的合成
在反应溶剂THF中,搅拌下加入步骤（1）得到的Boc-Pro-OH，降温至0-5℃，加入HOSu，滴加DCC与THF的混合溶液，滴加完室温反应2h，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体Boc-Pro-OSu；
（3）Boc-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入精氨酸和碳酸氢钠，并向料液中滴加Boc-Pro-OSu与THF的混合溶液，滴加完25℃反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH=6.5-7，外浴降温，控制料液温度5±2℃搅拌2h，过滤，滤饼真空干燥箱50℃干燥12h，得到Boc-Pro-Arg-OH；
（4）H-Pro-Arg-OH TFA盐的合成
在反应溶剂TFA中，搅拌下加入步骤（3）得到的Boc-Pro-Arg-OH，25℃反应1h，45℃减压浓缩，得到H-Pro-Arg-OH TFA盐；
（5）Pal-Gly-Gln-OH 的合成
在反应溶剂水中，搅拌加入H-Gly-Gln-OH，用30%氢氧化钠溶液调pH=13，搅拌溶解，控制料温＜10℃，向料液中滴加Pal-Cl和THF的混合溶液,控制pH=11±0.2,滴加完反应1h，用浓盐酸调pH=2±0.2，控制料液温度5±2℃，搅拌半小时后过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h，得到Pal-Gly-Gln-OH；
（6）Pal-Gly-Gln-ONp的合成
在反应溶剂DMF中，搅拌下加入步骤（5）得到的Pal-Gly-Gln-OH、HONp、DCC,50℃反应2-2.5h,向料液中滴加水，加完搅拌半小时，过滤，滤饼50℃真空干燥箱干燥12h,得到Pal-Gly-Gln-ONp；
（7）Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH的合成
在反应溶剂水中，搅拌下加入H-Pro-Arg–OH的TFA盐、用三乙胺控制pH=8-9,把步骤（6）得到的Pal-Gly-Gln-Pro-ONp和DMF的混合溶液滴加到料液中，控制pH=8-9，滴加完反应2h，TLC监控反应完，用浓盐酸调pH=2-2.5，外浴降温，保持料温5±2℃搅拌2h，过滤,滤饼50℃真空干燥箱干燥14h，得到棕榈酰四肽-7粗品。
2.根据权利要求1所述的棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于所述的步骤（7）得到的棕榈酰四肽-7粗品外浴50℃溶于甲醇，并向料液中滴加乙腈，25℃静置结晶2-4h，过滤得到产品，50℃真空干燥箱干燥12h，得到棕榈酰四肽-7。
3.根据权利要求2所述的棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于所述的棕榈酰四肽-7粗品：甲醇：乙腈=2g:3ml：6ml-9ml。
4.根据权利要求1-3任意一条所述的棕榈酰四肽-7的液相合成方法，其特征在于所述的步骤（6）中，DMF：Pal-Gly-Gln-OH：HONp：DCC：水=30ml：4g：1.39g-1.64g：2.24g：100ml。
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