CN112807358A - 一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,所述中药组合物中的原料药包括:当归3‑15重量份、黄芪16‑48重量份、白芍5‑25重量份、马齿苋7‑33重量份、枸杞子5‑25重量份、茯苓6‑28重量份、山楂4‑20重量份、西洋参3‑15重量份、淫羊藿5‑25重量份、稻芽5‑25重量份。本发明中药组合物具有预防和/或治疗辐射所致生殖损伤的作用,具体对辐射所致睾丸结构损伤、精子质量下降和/或生育功能损伤方面具有显著疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,属于医药领域。
背景技术
随着核科学技术的广泛应用,战时核辐射、核恐怖袭击及临床上恶性肿瘤放疗等都可导致辐射对睾丸的严重损伤,产生不育、致癌、致畸等严重后果。睾丸辐射防护也是核医学科、介入科、放疗科和影像科育龄男性医生辐射防护的重点。睾丸内精母细胞、精原细胞精子对电离辐射极为敏感,睾丸受到辐射损伤后会出现精子减少和(或)缺失、精子畸形增加及生精细胞变性、坏死和脱落等。
现有的抗辐射药物不尽理想,主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物。细胞因子类药物有粒细胞集落刺激因子、白细胞介素、重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ和重组人血小板生成素,激素类药物有“500”针剂、“523”片剂、雌三醇和褪黑素,含硫化合物如氨磷汀(WR-2721)及其活性代谢物 WR-1605、N-乙酰半胱氨酸,另外还有碘化钾和DTPA类化合物。现在仍有大量抗辐射药物在实验研究阶段,大多毒副作用较大,应用受到限制。
中药及天然药物日益被重视,优势在于其毒性低,成分多样,可以通过多种途径、多靶点治疗疾病。大量实验已证实中药具有很好的抗辐射效果,中药“安多霖胶囊”是国内首个批准的抗辐射中药,人参、当归、刺五加和红景天等也有很好的抗辐射效果,并且无毒害或毒副作用较轻,相比于其他类药物使用更安全。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是提供一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物。
方案一:
一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,所述中药组合物的原料药包括:当归、黄芪、白芍、马齿苋、枸杞子、茯苓、山楂、西洋参。
进一步,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归3-15重量份、黄芪16-48重量份、白芍5-25 重量份、马齿苋7-33重量份、枸杞子5-25重量份、茯苓6-28重量份、山楂4-20重量份、西洋参3-15 重量份;
优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归4-12重量份、黄芪22-38重量份、白芍6-18 重量份、马齿苋9-25重量份、枸杞子6-18重量份、茯苓8-21重量份、山楂5-16重量份、西洋参4-12 重量份;
进一步优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归5-9重量份、黄芪25-35重量份、白芍7-14重量份、马齿苋11-18重量份、枸杞子7-14重量份、茯苓9-16重量份、山楂6-11重量份、西洋参5-9重量份;
最优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归6重量份、黄芪30重量份、白芍10重量份、马齿苋15重量份、枸杞子10重量份、茯苓12重量份、山楂7重量份、西洋参6重量份。
进一步,所述中药组合物还包括补阳药,如淫羊藿,菟丝子,续断,巴戟天,沙苑子,杜仲等;收涩药,如五味子,五倍子,乌梅,罂粟壳,山茱萸,肉豆蔻等;消食药,如谷芽,稻芽,麦芽等;补气药,如人参,党参,山药,白扁豆,甘草等;补阴药,如麦冬,天冬,百合,北沙参,南沙参,女贞子等。
方案二:
一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,所述中药组合物由如下原料药制成:当归、黄芪、白芍、马齿苋、枸杞子、茯苓、山楂、西洋参、淫羊藿、菟丝子、五味子、谷芽。
进一步,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归3-15重量份、黄芪16-48重量份、白芍5-25 重量份、马齿苋7-33重量份、枸杞子5-25重量份、茯苓6-28重量份、山楂4-20重量份、西洋参3-15 重量份、淫羊藿5-25重量份、菟丝子5-25重量份、五味子5-25重量份、谷芽5-25重量份;
优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归4-12重量份、黄芪22-38重量份、白芍6-18 重量份、马齿苋9-25重量份、枸杞子6-18重量份、茯苓8-21重量份、山楂5-16重量份、西洋参4-12 重量份、淫羊藿6-18重量份、菟丝子6-18重量份、五味子6-18重量份、谷芽6-18重量份
进一步优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归5-9重量份、黄芪25-35重量份、白芍7-14重量份、马齿苋11-18重量份、枸杞子7-14重量份、茯苓9-16重量份、山楂6-11重量份、西洋参5-9重量份、淫羊藿7-14重量份、菟丝子7-14重量份、五味子7-14重量份、谷芽7-14重量份;
最优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归6重量份、黄芪30重量份、白芍10重量份、马齿苋15重量份、枸杞子10重量份、茯苓12重量份、山楂7重量份、西洋参6重量份、淫羊藿10重量份、菟丝子10重量份、五味子10重量份、谷芽10重量份。
方案三:
一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,所述中药组合物由如下原料药制成:当归、黄芪、白芍、马齿苋、枸杞子、茯苓、山楂、西洋参、淫羊藿、稻芽。
进一步,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归3-15重量份、黄芪16-48重量份、白芍5-25 重量份、马齿苋7-33重量份、枸杞子5-25重量份、茯苓6-28重量份、山楂4-20重量份、西洋参3-15 重量份、淫羊藿5-25重量份、稻芽5-25重量份;
优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归4-12重量份、黄芪22-38重量份、白芍6-18 重量份、马齿苋9-25重量份、枸杞子6-18重量份、茯苓8-21重量份、山楂5-16重量份、西洋参4-12 重量份、淫羊藿6-18重量份、稻芽6-18重量份;
进一步优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归5-9重量份、黄芪25-35重量份、白芍7-14重量份、马齿苋11-18重量份、枸杞子7-14重量份、茯苓9-16重量份、山楂6-11重量份、西洋参5-9重量份、淫羊藿7-14重量份、稻芽7-14重量份;
最优选的,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归6重量份、黄芪30重量份、白芍10重量份、马齿苋15重量份、枸杞子10重量份、茯苓12重量份、山楂7重量份、西洋参6重量份、淫羊藿10重量份、稻芽10重量份。
上述技术方案中,所述西洋参可以用人参代替。
上述技术方案中,所述白芍为生白芍,即不经过炮制工艺进行处理的白芍;所述山楂为生山楂,即不经过炮制工艺进行处理的山楂。
上述技术方案中,所述中药组合物可以是上述原料药组成或制成的任何形式,包括:上述原料药分别粉碎后再混合而成的组合物;上述原料药混合后经粉碎得到的组合物;上述原料药分别按常规提取方法提取后再混合得到的提取物;上述原料药混合后按常规提取方法提取后得到的提取物;上述原料药的提取物进一步经过精制纯化工艺得到的有效部位;上述组合物、提取物、有效部位进一步按照常规制剂工艺制备得到常规剂型。
本发明所述常规提取方法包括浸渍提取、煎煮提取、回流提取、渗漉提取、超声提取、微波提取等;所述提取溶剂包括水或常规有机溶剂,如乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、异丙醇等;所述精制纯化工艺包括萃取、柱层析分离、高效液相色谱分离等。
本发明所述常规剂型包括不同给药途径的制剂。例如通过口服(包括颊内或舌下)、经鼻、局部(包括颊内、舌下或经皮)、不经肠道(包括皮下、皮内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输注)途径给药。这些制剂可通过药剂学技术中已知的任何方法,例如通过使活性成分与载体或赋形剂结合来制备。例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸、微球、滴丸、控释制剂、缓释制剂或注射剂。
适于口服给药的药物制剂可呈现为独立单位,诸如胶囊、片剂、粉末或颗粒;水性或非水性液体中的溶液、悬浮液、水包油型液体乳液或油包水型乳液。可以以单位剂量形式制备口服液体,如溶液、糖浆和酏剂。糖浆可通过使化合物溶解于经适当调味的水溶液中来制备,而酏剂是经由使用无毒载体(vehicle)来制备。还可添加增溶剂和乳化剂(诸如乙氧基化异十八醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(诸如薄荷油或天然甜味剂,或糖精或其它人工甜味剂)及类似物。适当时,用于口服给药的剂量单位制剂可以是微胶囊化的也可通过涂布或包埋颗粒物质于聚合物、蜡或类似物中来制备制剂以延长或持续释放。还可以以脂质体给药系统(诸如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体)的形式给药,脂质体可由各种各样的磷脂,如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
适于经皮给药的药物制剂可以以意欲保持与接受者表皮紧密接触较长时段的独立贴片形式呈现。适于局部给药的药物制剂可配制为软膏剂、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、搽剂或油剂。
本发明所述中药组合物的原料药均收载于《中国药典》(2015版)。
本发明解决的第二个问题是提供所述中药组合物的制备方法,该方法包括:
方案一:
步骤A、按比例取原料药;
步骤B、以溶剂对原料药进行提取,提取物干燥,即得。
上述技术方案中,步骤B所述溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯或石油醚;优选水提取。
上述技术方案中,步骤B所使用的溶剂与原料药的用量关系为,溶剂添加量为原料药总重量的 1-20倍;优选的,溶剂添加量为原料药总重量的5-15倍;更进一步的,溶剂添加量为原料药总重量的8-12倍。
上述技术方案中,步骤B所述提取采用煎煮、浸渍、回流、渗漉、超声、微波提取。提取次数为1-3次。
上述技术方案中,步骤B所述干燥为减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
方案二:
步骤A、按比例取原料药;
步骤B、以水为溶剂对原料药进行提取,浓缩;
步骤C、在步骤B制得的浓缩液中加入乙醇,静置,取乙醇液,浓缩,干燥,即得。
上述技术方案中,在步骤B“提取”之前,用水将原料药浸泡1-2小时。
上述技术方案中,步骤B所使用的溶剂与原料药的用量关系为,溶剂添加量为原料药总重量的 1-20倍;优选的,溶剂添加量为原料药总重量的5-15倍;更进一步的,溶剂添加量为原料药总重量的8-12倍。
上述技术方案中,步骤B所述提取采用煎煮、浸渍、回流、渗漉、超声、微波提取。提取次数为1-3次。
上述技术方案中,步骤B所述干燥为减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
上述技术方案中,步骤C加乙醇至乙醇浓度为50%-75%;优选加乙醇至乙醇浓度为55%-70%;进一步优选加乙醇至乙醇浓度为60%。
本发明解决的第三个问题是提供所述中药组合物在制备具有预防和/或治疗辐射所致生殖损伤作用的药物中的应用。具体的,所述生殖损伤包括辐射所致睾丸结构损伤、精子质量下降和/或生育功能损伤。
上述制药用途包括单独使用中药组合物或以中药组合物为主要活性成分的药物组合物在上述制药新用途。
所述中药组合物可以是上述原料药组成或制成的任何形式,包括:上述原料药分别粉碎后再混合而成的组合物;上述原料药混合后经粉碎得到的组合物;上述原料药分别按常规提取方法提取后再混合得到的提取物;上述原料药混合后按常规提取方法提取后得到的提取物;上述原料药的提取物进一步经过精制纯化工艺得到的有效部位;上述组合物、提取物、有效部位进一步按照常规制剂工艺制备得到常规剂型。
本发明解决的第四个问题是提供一种治疗辐射所致生殖损伤的方法,该方法包括给予受试者有效量的本发明中药组合物。
所述中药组合物可以是上述原料药组成或制成的任何形式,包括:上述原料药分别粉碎后再混合而成的组合物;上述原料药混合后经粉碎得到的组合物;上述原料药分别按常规提取方法提取后再混合得到的提取物;上述原料药混合后按常规提取方法提取后得到的提取物;上述原料药的提取物进一步经过精制纯化工艺得到的有效部位;上述组合物、提取物、有效部位进一步按照常规制剂工艺制备得到常规剂型。
本发明所述的“有效量”是指无毒性,但足够量的提供所需作用的药物。“有效量”会因受试者的不同而不同,依据年龄和个体的一般情况,特定的活性药物等等。因此,不可能总是指精确的“有效量”,然而,任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。优选的,本发明中药组合物的给药剂量为80g~200g生药/70kg·天;进一步优选的,本发明中药组合物的给药剂量为100g~150g生药/70kg·天;最优选的,本发明中药组合物的给药剂量为116g生药 /70kg·天。
附图说明
图1为2.0Gy60Coγ射线照射后不同时间点小鼠睾丸病理变化。
图2为2.0Gy60Coγ射线照射后不同时间点小鼠睾丸TLR4免疫组化结果。
图3为2.0Gy60Coγ射线照射后不同时间点小鼠睾丸TLR5免疫组化结果。
图4为2.0Gy60Coγ射线照射前1天小鼠睾丸形态结构。
图5为2.0Gy60Coγ射线照射后1天小鼠睾丸形态结构。
图6为2.0Gy60Coγ射线照射后3天小鼠睾丸形态结构。
图7为2.0Gy60Coγ射线照射后7天小鼠睾丸形态结构。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明,说明但不限制本发明。
实施例1
组方:当归6g,黄芪30g,生白芍10g,马齿苋15g,枸杞子10g,茯苓12g,生山楂7g,西洋参6g;
制备方法:上述药材加8倍水浸泡1小时后武火煎至沸腾,沸后改用文火继续煎煮30min后倒出第一煎药液,药渣加8倍热水继续煎煮,沸腾后煎煮30min,后倒出第二煎药液,两次药液合并。水浴浓缩至原药材的1-2g/ml。药液温度降低至室温,加入无水乙醇至药液乙醇浓度为60%,放置于 4℃冰箱中过夜静置。倒出上清液,沉淀用纱布过滤,60%乙醇洗涤3次,药液减压抽滤一次。水浴加热挥发乙醇,浓缩药液至所需体积。
实施例2
组方:当归5g,黄芪33g,生白芍8g,马齿苋17g,枸杞子8g,茯苓14g,生山楂6g,西洋参 8g;
制备方法同实施例1。
实施例3
组方:当归8g,黄芪28g,生白芍12g,马齿苋13g,枸杞子13g,茯苓10g,生山楂9g,西洋参5g;
制备方法同实施例1。
实施例4
组方:当归4g,黄芪37g,生白芍6g,马齿苋23g,枸杞子7g,茯苓19g,生山楂5g,西洋参 11g;
制备方法同实施例1。
实施例5
组方:当归11g,黄芪24g,生白芍16g,马齿苋10g,枸杞子16g,茯苓7g,生山楂15g,西洋参4g;
制备方法同实施例1。
实施例6
组方:当归3g,黄芪45g,生白芍5g,马齿苋30g,枸杞子6g,茯苓26g,生山楂4g,西洋参 14g;
制备方法同实施例1。
实施例7
组方:当归13g,黄芪18g,生白芍23g,马齿苋8g,枸杞子22g,茯苓6g,生山楂18g,西洋参3g;
制备方法同实施例1。
实施例8
组方:当归6g,黄芪30g,生白芍10g,马齿苋15g,枸杞子10g,茯苓12g,生山楂7g,西洋参6g,淫羊藿10g,菟丝子10g,五味子10g,谷芽10g;
制备方法:上述药材加12倍水浸泡1小时后武火煎至沸腾,沸后改用文火继续煎煮60min后倒出第一煎药液,二煎再加8倍热水继续煎煮,沸腾后煎煮30min,后倒出第二煎药液,两次药液合并。水浴浓缩至原药材的1-2g/ml。药液温度降低至室温,加入无水乙醇至药液乙醇浓度为60%,放置于 4℃冰箱中过夜静置。静置24h后,减压抽滤,沉淀用60%乙醇洗涤3次。回收乙醇,将药液稀释至所需浓度。
实施例9
组方:当归5g,黄芪33g,生白芍8g,马齿苋17g,枸杞子8g,茯苓14g,生山楂6g,西洋参8g,淫羊藿8g,菟丝子13g,五味子8g,谷芽13g;
制备方法同实施例8。
实施例10
组方:当归8g,黄芪28g,生白芍12g,马齿苋13g,枸杞子13g,茯苓10g,生山楂9g,西洋参5g,淫羊藿12g,菟丝子7g,五味子13g,谷芽8g;
制备方法同实施例8。
实施例11
组方:当归4g,黄芪37g,生白芍6g,马齿苋23g,枸杞子7g,茯苓19g,生山楂5g,西洋参 11g,淫羊藿6g,菟丝子17g,五味子7g,谷芽16g;
制备方法同实施例8。
实施例12
组方:当归11g,黄芪24g,生白芍16g,马齿苋10g,枸杞子16g,茯苓7g,生山楂15g,西洋参4g,淫羊藿16g,菟丝子6g,五味子15g,谷芽7g;
制备方法同实施例8。
实施例13
组方:当归3g,黄芪45g,生白芍5g,马齿苋30g,枸杞子6g,茯苓26g,生山楂4g,西洋参 14g,淫羊藿5g,菟丝子23g,五味子6g,谷芽21g;
制备方法同实施例8。
实施例14
组方:当归13g,黄芪18g,生白芍23g,马齿苋8g,枸杞子22g,茯苓6g,生山楂18g,西洋参3g,淫羊藿23g,菟丝子5g,五味子20g,谷芽6g;
制备方法同实施例8。
实施例15
组方:当归6g,黄芪30g,生白芍10g,马齿苋15g,枸杞子10g,茯苓12g,生山楂7g,西洋参6g,淫羊藿10g,稻芽10g;
制备方法:上述药材加12倍水浸泡1小时后武火煎至沸腾,沸后改用文火继续煎煮60min后倒出第一煎药液,二煎再加8倍热水继续煎煮,沸腾后煎煮30min,后倒出第二煎药液,两次药液合并。水浴浓缩至原药材的1-2g/ml。药液温度降低至室温,加入无水乙醇至药液乙醇浓度为60%,放置于 4℃冰箱中过夜静置。静置24h后,减压抽滤,沉淀用60%乙醇洗涤3次。回收乙醇,将药液稀释至所需浓度。
实施例16
组方:当归5g,黄芪33g,生白芍8g,马齿苋17g,枸杞子8g,茯苓14g,生山楂6g,西洋参 8g,淫羊藿8g,稻芽13g;
制备方法同实施例15。
实施例17
组方:当归8g,黄芪28g,生白芍12g,马齿苋13g,枸杞子13g,茯苓10g,生山楂9g,西洋参5g,淫羊藿12g,稻芽7g;
制备方法同实施例15。
实施例18
组方:当归4g,黄芪37g,生白芍6g,马齿苋23g,枸杞子7g,茯苓19g,生山楂5g,西洋参 11g,淫羊藿6g,稻芽17g;
制备方法同实施例15。
实施例19
组方:当归11g,黄芪24g,生白芍16g,马齿苋10g,枸杞子16g,茯苓7g,生山楂15g,西洋参4g,淫羊藿16g,稻芽6g;
制备方法同实施例15。
实施例20
组方:当归3g,黄芪45g,生白芍5g,马齿苋30g,枸杞子6g,茯苓26g,生山楂4g,西洋参 14g,淫羊藿5g,稻芽23g;
制备方法同实施例15。
实施例21
组方:当归13g,黄芪18g,生白芍23g,马齿苋8g,枸杞子22g,茯苓6g,生山楂18g,西洋参3g,淫羊藿23g,稻芽5g;
制备方法同实施例15。
实施例22
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、续断 10g、巴戟天10g。
实施例23
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、五味子10g、乌梅10g。
实施例24
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、山茱萸10g、肉豆蔻10g、谷芽10g。
实施例25
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、沙苑子10g、稻芽10g。
实施例26
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、党参 10g。
实施例27
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、麦冬 10g、北沙参10g。
实施例28
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、女贞子10g、杜仲10g、麦芽10g。
实施例29
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、百合 10g、甘草10g、山药10g。
实施例30
当归6g、黄芪30g、白芍10g、马齿苋15g、枸杞子10g、茯苓12g、山楂7g、西洋参6g、菟丝子10g、天冬10g。
实施例22-30所述中药组合物按如下方法制备:按比例取各原料药,加水提取,即得中药组合物。
效果实验
一、实施例1制备的中药组合物对5.5Gy60Coγ所致Balb/c小鼠睾丸损伤的治疗作用:
1、实验方法
将200只清洁级雄性Balb/c小鼠按随机数字表随机分为4批,每批50只,每批小鼠再次按照随机数字表分为五组【空白组、模型组、安多霖组、中药组合物高剂量组和中药组合物低剂量组(以下分别简称高剂量组、低剂量组)】,适应性喂养3天后,低剂量组给药量为0.69g/ml,安多霖组给药剂量为0.27g/ml(人临床等效剂量),高剂量组给药量为1.37g/ml(2倍等效剂量),每天灌胃1次,共给药14天。分组如下:
空白组,去离子水灌胃,不照射。
模型组,去离子水灌胃+60Coγ射线5.5Gy照射。
安多霖组,安多霖水溶液灌胃+60Coγ射线5.5Gy照射。
高剂量组,高剂量中药组合物灌胃+60Coγ射线5.5Gy照射。
低剂量组,低剂量中药组合物灌胃+60Coγ射线5.5Gy照射。
适应性喂养3天,给药14天后,上述模型组及各给药组用60Coγ射线进行全身一次照射。分别于照射后第1、7、21和35天分批处死小鼠,检测相关指标。
2、实验结果
2.1实验期间小鼠睾丸指数变化情况
2.1.1相同时间点、不同组间小鼠睾丸指数比较:
照后1天:各组间睾丸指数均无统计学差异(p>0.05);
照后7天:各组间睾丸指数均无统计学差异(p>0.05);
照后21天:各照射组均显著降低(均为p<0.001);各照射组间无显著差异(p>0.05)。
照后35天:各照射组均显著降低(均为p<0.001);各照射组间无显著差异(p>0.05)。
2.1.2同组、不同时间点小鼠睾丸指数比较:
模型组:与照后1天、7天比较,照后21、35天睾丸指数均明显下降(p<0.05,p<0.001),与照后21天比较,照后35天睾丸指数下降(p<0.05)。
各给药组:与照后1天、7天比较,照后21、35天睾丸指数均明显下降(p<0.01,p<0.001);与照后21天比较,照后35天睾丸指数下降(p<0.05)。
结果见表1。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。同组内不同时间点比较,与照后1天比较,p<0.05△,p<0.01△△,p<0.001△△△;与照后7天比较,p<0.05◇, p<0.01◇◇,p<0.001◇◇◇;与照后21天比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲
2.2实验期间各组小鼠附睾指数变化
2.2.1相同时间点、不同组间小鼠附睾指数比较:
照后1天:各组间附睾指数均无统计学差异(p>0.05)。
照后7天:各组间附睾指数均无统计学差异(p>0.05)。
照后21天:与空白组比较,模型组、安多霖组和低剂量组均显著降低(均为p<0.001),高剂量组下降(p<0.05);高剂量组高于模型组(p<0.05)。
照后35天:与空白组比较,模型组和安多霖组均显著降低(均为p<0.001),高剂量组下降 (p<0.05);高剂量组高于模型组(p<0.05),低剂量组明显高于模型组(p<0.001)。
2.2.2同组、不同时间点小鼠附睾指数比较:
模型组:与照后1天比较,照后7天附睾指数下降(p<0.05);与照后1天、7天比较,照后21 天、35天附睾指数均显著下降(均为p<0.01);与照后21天比较,照后35天附睾指数下降(p<0.05)。
各给药组:与照后1天、7天比较,照后21、35天附睾指数均明显下降(p<0.01);与照后21 天比较,照后35天安多霖组附睾指数下降(p<0.05)。
结果见表2。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。同组内不同时间点比较,与照后1天比较,p<0.05△,p<0.01△△,p<0.001△△△;与照后7天比较,p<0.05◇, p<0.01◇◇,p<0.001◇◇◇;与照后21天比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲
2.3实验期间各组小鼠精子密度
2.3.1相同时间点、不同组间小鼠精子密度比较:
照后1天:与空白组比较,模型组小鼠精子密度显著上升(p<0.01),各给药组与空白组差异均不明显(均为p>0.05)。
照后7天:与空白组比较,模型组上升极为显著(p<0.001),给药各组差异不明显(均为p>0.05);与模型组比较,各给药组均急剧降低(均为p<0.001)。
照后21天:与空白组比较,模型组和安多霖组均下降明显(均为p<0.01);高剂量组降低(p<0.05);与模型组比较,低剂量组上升显著(p<0.01),安多霖组和高剂量组变化均不明显(均为p>0.05)。
照后35天:与空白组比较,模型组、安多霖组和低剂量组均急剧降低(均为p<0.001),高剂量组降低明显(p<0.01);与模型组比较,安多霖组和低剂量组无明显变化(p>0.05),高剂量组回升极为显著(p<0.05)。
2.3.2同组、不同时间点小鼠精子密度比较:
模型组:与照后1天比较上升显著(p<0.01);与照后7天比较,照后21天和35天均降低极为显著(均为(p<0.001)。
其他照射组:与照后1天比较,照后7天、21天和35天小鼠精子密度均降低明显(均为p<0.01, p<0.001);与照后7天比较,安多霖组、低剂量组和高剂量组均下降(均为p<0.05),与照后21天比较,高剂量组升高(p<0.05)。
结果见表3。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。同组内不同时间点比较,与照后1天比较,p<0.05△,p<0.01△△,p<0.001△△△;与照后7天比较,p<0.05 ◇,p<0.01◇◇,p<0.001◇◇◇;与照后21天比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲
2.4实验期间小鼠精子活动率变化
2.4.1相同时间点、不同组间小鼠精子活动率比较:
照后1天:与空白组比较,安多霖组和低剂量组均上升(均为p<0.05),模型组和高剂量组升高均不明显(均为p>0.05);与模型组比较,各给药组均无明显差异(均为p>0.05)。
照后7天:与空白组比较,各组均升高,但差异不明显(均为p>0.05)。
照后21天:与空白组比较,模型组急剧下降(p<0.001),安多霖组和高剂量组均下降显著(均为p<0.01),低剂量组降低(p<0.05);与模型组比较,安多霖组和高剂量组均无明显差异(均为p>0.05),低剂量组升高(p<0.05)。
照后35天:与空白组比较,模型组降低极为明显(p<0.001);安多霖组和低剂量组均下降显著 (均为p<0.01)、高剂量组降低(p<0.05);与模型组比较,安多霖组和低剂量组均升高(均为p<0.05),高剂量组升高明显(p<0.01)。
2.4.2同组、不同时间点小鼠精子活动率比较:
模型组:与照后1天、7天比较,照后21天和照后35天均下降极为显著(均为p<0.001)。
安多霖组:与照后1天比较,照后7天下降(p<0.05),照后21天和35天均急剧降低(均为p<0.001);与照后7天比较,照后21
天和35天均急剧降低(均为p<0.001);与照后21天比较,照后35天升高(p<0.05)。
高剂量组:与照后1天、7天比较,照后21天和照后35天均下降极为显著(均为p<0.001);与照后21天比较,照后35天升高(p<0.05)。
低剂量组:与照后1天比较,照后7天下降(p<0.05);与照后1天、7天比较,照后21天和照后35天均下降极为显著(均为p<0.001)。
结果见表4。
注:精子活动率=(前向运动精子个数+非前向运动精子个数)/精子数量;
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。同组内不同时间点比较,与照后1天比较,p<0.05△,p<0.01△△,p<0.001△△△;与照后7天比较,p<0.05 ◇,p<0.01◇◇,p<0.001◇◇◇;与照后21天比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲
以上实验结果表示,该组方对睾丸急性辐射损伤具有一定的防护效应,但疗效需进一步提高。实施例2-7制备的化合物具备与实施例1化合物相同的效果。
二、实施例8制备的中药组合物对4.0Gy60Coγ影响Balb/c小鼠精子质量的治疗作用:
1、实验方法
将120只SPF级雄性成年Balb/c小鼠按体重随机分为4组:空白对照组(NC)、模型对照组(IR)、阳性药组(IR+阳性药,IRP)和中药组合物组(IR+中药组合物,IRC),每组30只小鼠。照射后分别给予各组小鼠以下处理:
空白对照组(NC),不照射,灌胃14天去离子水,0.2mL/10g;
模型对照组(IR),照射后灌胃14天去离子水,0.2mL/10g;
阳性药组(IRP),照射后灌胃14天复方皂矾丸混悬液,0.2mL/10g;
中药组合物组(IRC),照射后灌胃14天中药水复方,0.2mL/10g。
以上各组小鼠适应性喂养3天,除空白组小鼠外,其他各组小鼠进行一次性全身60Coγ射线照射,照射剂量为4.0Gy,剂量率为0.55Gy/min,建立急性辐射损伤模型。照射后给药14天,并分别在照后14、21和35天分三批取材,每批每组随机选取10只小鼠,眼眶取血后断颈处死,检测相关实验指标。
小鼠药量计算:
实施例8中药组合物共计136g,人体重70kg,人每天给药量136g/70kg,小鼠给药量按照人给药量的20倍。
小鼠每天给药量分别为136g/70kg*20倍,每组小鼠30只,每只小鼠体重按照30g计算,给药14 天。一只小鼠每天给药量为0.03kg*136g/70kg*20倍,30只小鼠14天给药量为:30只*14天 *0.03kg*136g/70kg*20=489.6g。小鼠灌胃量0.2ml/10g,一只一天小鼠给药量为0.6ml,30只小鼠14 天给药量为:0.6ml*30只*14天=252ml。
药物浓度分别为489.6(244.8)g/252ml=1.94(0.97)g/ml。
2、实验结果
2.1 4Gy60Coγ射线照射对小鼠睾丸指数的影响及中药的治疗效应
照射后,各组小鼠睾丸萎缩,重量下降,睾丸指数也降低。在照后14d时,各照射组小鼠睾丸指数较空白组显著降低(P<0.001),三个照射组间比较无显著性差异;照后21d时,各照射组小鼠睾丸萎缩更严重,睾丸指数更小,其中各照射组小鼠睾丸指数与空白组比较有显著性差异(P<0.001),且与照后14d的模型组比较也具有显著性差异(P<0.001),说明这期间睾丸的萎缩进行性加重;而到了照后35d,虽然各照射组与空白组比较具有显著性差异(P<0.001),与照后14d的模型组比较也具有显著性差异,但与照后21d的模型组比较无显著性差异,说明在照后21d到照后35d这两周期间,睾丸的萎缩不再持续。结果见表5。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与照后14d模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###。
2.2 4Gy60Coγ射线照射对小鼠精子浓度和质量的影响及中药的治疗效应
2.2.1精子浓度
结果显示,照后14d,各照射组小鼠精子浓度与空白组比较无显著性差异;照后21d时,各照射组小鼠精子浓度较空白组显著降低(P<0.05);照后35d时,各照射组小鼠精子浓度更低,与空白组比较具有显著性差异(P<0.001),与照后21d时的模型组比较也具有显著性差异(P<0.001)。结果见表6。
组别 | 14d | 21d | 35d |
空白组 | 19.67±1.21 | 22.20±1.69 | 21.00±5.87 |
模型组 | 21.10±3.63 | 18.60±3.78<sup>*</sup> | 6.00±2.92<sup>***▲▲▲</sup> |
阳性药组 | 21.00±2.45 | 18.40±3.69<sup>*</sup> | 6.89±3.59<sup>***▲▲▲</sup> |
中药组 | 21.57±3.55 | 18.50±3.16<sup>*</sup> | 6.80±3.16<sup>***▲▲▲</sup> |
F | 0.477 | 3.307 | 19.551 |
P | 0.701 | 0.032 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与照后14d模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###;与照后21d模型组比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲,p<0.001▲▲▲。
2.2.2精子活率
结果显示,照后14d时,各组间小鼠精子活率比较无显著性差异;照后21d时,各照射组与空白组比较精子活率显著降低(P<0.01),各照射组与照后14d的模型组比较,精子活率也显著降低(P<0.01);照后35d时,各照射组小鼠精子活率几乎为0。结果见表7。
组别 | 14d | 21d | 35d |
空白组 | 60.60±8.69 | 64.20±3.61 | 58.75±6.45 |
模型组 | 65.33±4.06 | 51.56±11.70<sup>**##</sup> | 0.56±1.67<sup>***###▲▲▲</sup> |
阳性药组 | 65.22±4.02 | 55.22±5.95<sup>**##</sup> | 0.13±0.35<sup>***###▲▲▲</sup> |
中药组 | 62.33±5.85 | 51.30±9.24<sup>**##</sup> | 0.10±0.32<sup>***###▲▲▲</sup> |
F | 3.240 | 5.371 | 18.908 |
P | 0.356 | 0.004 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与照后14d模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###;与照后21d模型组比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲,p<0.001▲▲▲。
2.2.3精子活力
照后14d时,各组间小鼠精子活力比较无显著性差异;照后21d时,各照射组与空白组比较精子活力显著降低(P<0.001),与照后14d的模型组比较,也显著降低(P<0.001);照后35d时,各照射组小鼠精子活力几乎为0。结果见表8。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与照后14d模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###;与照后21d模型组比较,p<0.05▲,p<0.01▲▲,p<0.001▲▲▲。
2.2.4精子形态
照射后14d时,各照射组小鼠正常形态精子百分比降低,模型组和阳性药组与空白组比较无显著性差异,而中药组和空白组比较具有显著性差异(P<0.05),三个照射组间比较无显著性差异;照后21d时,三个照射组小鼠正常形态精子百分比均显著降低,其中阳性药组与空白组比较P<0.01,模型组和中药组与空白组比较P<0.001,各照射组与照后14d模型组比较无显著性差异;照后35d,各照射组与空白组比较具有显著性差异(P<0.001),与照后14d模型组比较也具有显著性差异 (P<0.01),与照后21d模型组比较无显著性差异。
结果见表9。
组别 | 14d | 21d | 35d |
空白组 | 63.01±5.34 | 68.44±7.22 | 68.12±7.00 |
模型组 | 54.88±7.67 | 44.83±8.95<sup>***</sup> | 35.78±13.99<sup>***##</sup> |
阳性药组 | 57.75±11.27 | 48.19±9.10<sup>**</sup> | 37.30±9.96<sup>***##</sup> |
中药组 | 49.58±5.84<sup>*</sup> | 44.67±8.58<sup>***</sup> | 36.01±6.68<sup>***##</sup> |
F | 3.205 | 9.165 | 13.001 |
P | 0.047 | 0.001 | 0.000 |
以上实验结果表示,实施例8制备的中药组合物对精子质量辐射损伤效应的疗效并不显著。实施例9-14制备的化合物具备与实施例8化合物相同的效果。
三、实施例15制备的中药组合物对辐射所致小鼠生殖系统的保护作用:
(一)中药组合物对Balb/c小鼠2.0Gy60Coγ射线照后7天和21天睾丸的防护作用
1、实验方法
将120只SPF级雄性成年Balb/c小鼠按体重随机分为5组:空白对照组(NC)、模型组对照组(IR)、阳性药组(IR+阳性药,IRP)、中药组合物低剂量组(IR+低剂量,IRL)和中药组合物高剂量组(IR+高剂量,IRH);每组24只,适应性喂养3天后,进行如下干预:
空白对照组(NC),灌胃10天去离子水,0.2ml/10g,不照射;
模型对照组(IR),灌胃10天去离子水,0.2ml/10g,照射;
阳性药组(IRP),灌胃10天安多霖胶囊水溶液,0.2ml/10g,照射;
中药组合物低剂量组(IRL),灌胃10天低浓度中药水煎液,0.2ml/10g,照射;
中药组合物高剂量组(IRH),灌胃10天高浓度中药水煎液,0.2ml/10g,照射。
以上各组小鼠适应性喂养3天,连续灌胃给药10天,每天一次。给药第10天,除正常组外,其余各组小鼠用60Coγ射线进行一次性全身照射,照射剂量为2.0Gy,照射剂量率为1.1Gy/min,复制急性辐射损伤模型。各组照后不再给药,于照射后7、21天分两批取材,检测相关指标。
小鼠药量计算:
实施例15中药组合物共计116g,人体重70kg,人每天给药量116g/70kg,小鼠给药量分为高、低两个剂量:分别按照人给药量的20、10倍。
小鼠每天给药量分别为116g/70kg*20(10)倍,每组小鼠24只,每只小鼠体重按照30g计算,给药10天。一只小鼠每天给药量为0.03kg*116g/70kg*20(10)倍,24只小鼠10天给药量为:24只 *10天*0.03kg*116g/70kg*20(10)=238.6(119.3)g。总药量为:238.6+119.3=357.9g。
小鼠灌胃量0.2ml/10g,一只一天小鼠给药量为0.6ml,高、低两个剂量组48只小鼠10天给药量为:0.6ml*48只*10天=288ml。
药物浓度分别为238.6(119.3)g/144ml=1.66(0.83)g/ml。
阳性药安多霖、中药组合物低剂量组给药剂量均为人临床剂量的10倍量,中药组合物高剂量组给药剂量为人临床剂量的20倍量。药物浓度分别为:安多霖0.27g/ml,高剂量1.66g/ml,低剂量 0.83g/ml。
2、实验结果
2.1中药组合物对急性辐射损伤小鼠睾丸指数的影响
照射后7d,与空白对照组相比,各照射组小鼠睾丸指数均显著下降;而与模型组相比,阳性药和中药组合物高剂量(人体等效剂量)组小鼠睾丸指数有显著升高(P<0.05;P<0.01)。在照后21d 取材时,各照射组小鼠睾丸指数较第7d持续降低,与空白组相比,均具有显著性差异(P<0.01),而各给药组和模型组比较无显著性差异。可见2Gy电离辐射全身照射后在7d内即可引起小鼠睾丸指数的显著下降,提示睾丸萎缩,重量减轻,照前给药可以在一定程度上减轻电离辐射对睾丸的损伤,短期内中药高剂量和阳性药的防护效果较好,到第21d时各照射组小鼠睾丸指数持续降低,且各个照射组间的睾丸指数比较无显著性差异,说明睾丸的损伤一直在持续,但阳性药和中药的保护作用没有持续到照后21d。结果见表10。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 0.78±0.06 | 0.78±0.08 |
模型组 | 0.64±0.07<sup>***</sup> | 0.45±0.10<sup>***</sup> |
安多霖组 | 0.71±0.05<sup>**</sup> | 0.45±0.09<sup>***</sup> |
低剂量组 | 0.65±0.05<sup>***</sup> | 0.50±0.05<sup>***</sup> |
高剂量组 | 0.72±0.07<sup>*</sup> | 0.44±0.04<sup>***</sup> |
F | 9.049 | 44.358 |
P | 0.000 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
2.2 2.0Gy60Coγ射线照射对小鼠生精细胞凋亡的影响及中药复方的防护效应
流式结果显示照后7d,睾丸内生精细胞已经开始凋亡,与空白组相比,模型组小鼠生精细胞凋亡率显著升高(P<0.05),各给药组小鼠生精细胞凋亡率虽有升高,但与空白组比较无显著性差异;给药组与模型组比较生精细胞凋亡率较低,但也无显著性差异。在照后21d,各照射组生精细胞凋亡率显著增高,与正常组比较均具有显著性差异,而与模型组比较均无显著性差异,结果见表11。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***。
2.3 2.0Gy60Coγ射线对小鼠睾丸各倍体细胞百分比的影响及中药复方的防护效应
对生精细胞进行流式分析显示,正常睾丸组织主要由3类细胞群组成:单倍体(1C),二倍体 (2C)和四倍体(4C)。其中1C细胞包括精子细胞和精子,2C细胞包括G0期精原细胞、次级精母细胞、支持细胞和间质细胞等,4C细胞包括细线期、粗线期、双线期的初级精母细胞和G2期的精原细胞及非生殖细胞。
照射后7d时,各照射组小鼠睾丸中单倍体细胞百分比下降,其中模型组和中药低剂量组与空白组比较有显著性差异(P<0.01),而阳性药组和中药高剂量组的小鼠睾丸单倍体细胞百分比与正常组比较无显著性差异;与模型组比较,中药高剂量组小鼠睾丸内单倍体细胞百分比显著增高(P<0.05);照射后21d时,各受照射组小鼠睾丸内单倍体细胞百分比均显著降低,其中模型组、阳性药组和中药低剂量组与空白组比较P<0.001,中药高剂量组与空白组比较P<0.01。结果见表12。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 52.53±5.56 | 55.68±13.71 |
模型组 | 44.97±4.44<sup>*</sup> | 27.10±10.71<sup>***</sup> |
安多霖组 | 49.78±2.94 | 33.32±5.08<sup>***</sup> |
低剂量组 | 44.48±3.32<sup>**</sup> | 31.53±3.88<sup>***</sup> |
高剂量组 | 50.85±6.79<sup>#</sup> | 36.18±2.74<sup>**</sup> |
F | 3.354 | 9.478 |
P | 0.025 | 0.000 |
对于二倍体细胞,照后7d时,中药低剂量组小鼠二倍体细胞百分比较正常组高,差异具有显著性(P<0.05),其余各组与空白组比较均无显著性差异。照后21d时,各照射组小鼠睾丸中二倍体细胞百分比显著高于空白组(P<0.001),与模型组比较,中药高剂量组小鼠睾丸二倍体细胞百分比显著降低(P<0.05)。结果见表13。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 20.15±1.25 | 19.42±1.29 |
模型组 | 21.63±1.57 | 39.96±8.34<sup>***</sup> |
安多霖组 | 21.73±1.68 | 35.45±3.76<sup>***</sup> |
低剂量组 | 22.97±2.01<sup>*</sup> | 36.78±2.96<sup>***</sup> |
高剂量组 | 21.53±1.10 | 33.2±6.37<sup>***#</sup> |
F | 1.956 | 12.265 |
P | 0.132 | 0.000 |
对于四倍体细胞百分比,从结果可以看出照后7d时,各个组小鼠之间均无差异,照后21d时,各照射组小鼠睾丸中四倍体细胞百分比显著上升,与空白组比较具有显著性差异。各照射组之间比较无差异。结果见表14。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 5.85±1.40 | 9.30±4.91 |
模型组 | 6.23±0.94 | 15.30±5.58<sup>*</sup> |
安多霖组 | 6.48±0.65 | 14.17±3.96<sup>*</sup> |
低剂量组 | 6.52±0.62<sup>*</sup> | 14.65±1.15<sup>*</sup> |
高剂量组 | 5.95±1.07 | 15.55±2.79<sup>*</sup> |
F | 0.571 | 2.140 |
P | 0.686 | 0.113 |
注:以上表12-14,与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###。
各照射组小鼠照后7d时,与空白组比较,模型组、中药低剂量组小鼠睾丸中1C:2C比值显著降低(P<0.01),阳性药组也显著降低(P<0.05),中药高剂量组与空白组比较无显著性差异;照后 21d,各照射组与空白组比较均显著降低(P<0.001)。结果见表15。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 2.67±0.17 | 2.87±0.73 |
模型组 | 2.10±0.32<sup>**</sup> | 0.73±0.35<sup>*</sup> |
安多霖组 | 2.20±0.23<sup>*</sup> | 0.96±0.22<sup>*</sup> |
低剂量组 | 1.95±0.27<sup>**</sup> | 0.87±0.16<sup>*</sup> |
高剂量组 | 2.32±0.49 | 1.03±0.44<sup>*</sup> |
F | 4.260 | 23.655 |
P | 0.012 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***。
各照射组小鼠照后7d时,与空白组比较,模型组、中药低剂量组小鼠睾丸中1C:4C比值显著降低(P<0.05),阳性药与中药高剂量组无显著性差异;照后21d时,各个照射组均显著降低 (P<0.001)。结果见表16。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 10.44±1.93 | 7.78±1.34 |
模型组 | 6.60±1.31<sup>**</sup> | 3.14±1.66<sup>*</sup> |
安多霖组 | 7.98±1.10 | 2.51±0.77<sup>*</sup> |
低剂量组 | 6.87±0.79<sup>**</sup> | 2.17±0.36<sup>*</sup> |
高剂量组 | 9.01±3.28 | 2.18±0.98<sup>*</sup> |
F | 3.213 | 21.093 |
P | 0.033 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***。
2.4 2.0Gy60Coγ射线照射后不同时间点小鼠睾丸病理变化(HE染色)
病理结果见图1。
从小鼠病理切片染色结果可以看出,空白组小鼠睾丸各级生精细胞结构完整,在生精上皮中紧密而规则有序地排列,生精小管中可以清楚地观察到精原细胞、精母细胞、精子细胞和长形精子以及支持细胞,生精上皮的基底膜结构完整,边界清晰;各生精小管之间的排列紧密,睾丸间质完好。各照射组小鼠受到不同程度的损伤,由图可以看出其损伤随时间推移是加重的。
照射后第7d时,各照射组小鼠睾丸结构尚比较清晰,上皮细胞排列较为紧密规则,模型组小鼠管腔内生精细胞层数减少,其中精原细胞大部分消失,精母细胞数量尚多,生精小管略有萎缩,各生精小管之间间隙略有增大,支持细胞和间质细胞完好,睾丸间质无水肿;阳性药组小鼠尚可看到少量精原细胞,精母细胞数量较多,精子细胞和长形精子仍然可见,细胞层数较模型组多,排列整齐规则,基底膜完好,生精小管边界间清晰,睾丸间质未见明显损伤;中药低剂量组可见精原细胞大量消失,生精上皮结构有轻微损伤,精母细胞、精子细胞和长形精子仍然可见,生精小管略有萎缩;高剂量组小鼠,尚可见少量的精原细胞,精母细胞、精子细胞和长形精子数量较多,生精小管内细胞层数较多,排列整齐紧密,睾丸间质无显著损伤。
照后21d时,模型组小鼠生精上皮结构排列混乱,各级生精细胞严重脱落,生精小管高度退化、变性、萎缩,生精上皮破损严重,上皮变薄萎缩,生精上皮脱落形成空泡样变化,基底膜增厚,生精小管萎缩严重,生精小管间隙变大,间质细胞退化;阳性药组小鼠生精上皮损伤严重,生精上皮变薄萎缩,上皮细胞排列混乱,生精细胞大量凋亡,生精小管萎缩严重,基底膜增厚,生精小管萎缩,小管间隙变大,睾丸间质退化;中药低剂量组小鼠生精上皮结构排列混乱,各级生精细胞严重脱落,生精小管高度退化、变性、萎缩,生精上皮破损严重,上皮变薄萎缩,生精上皮脱落形成空泡样变化,基底膜增厚,生精小管萎缩严重,生精小管间隙变大,间质细胞退化;高剂量组小鼠生精上皮损伤严重,生精上皮变薄萎缩,上皮细胞排列混乱,生精细胞大量凋亡,生精小管萎缩严重,基底膜增厚,生精小管萎缩,小管间隙变大,睾丸间质退化。
2.5 2.0Gy60Coγ射线照射后小鼠睾丸TLR4/TLR5通路各因子的基因表达
RT-PCR结果显示在照后7d,模型组和中药低剂量组TLR4 mRNA水平降低,与空白组比较具有显著性差异(P<0.05),而阳性药组和中药高剂量组与空白组比较无显著性差异;照后21d,各照射组小鼠睾丸TLR4 mRNA水平均显著降低,阳性药组与空白组比较P<0.05,其余各照射组与空白组比较P<0.01,结果见表17。
照后7d高剂量组TLR5 mRNA的表达显著升高,与空白组和模型组均有显著性差异(P<0.05),其余各照射组与正常组比较无显著性差异;而照后21d,与正常组相比,各照射组TLR5 mRNA表达显著降低(P<0.001),结果见表18。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 1.11±0.63 | 1.04±0.28 |
模型组 | 1.03±0.53 | 0.39±0.06<sup>**</sup> |
安多霖组 | 1.64±0.81 | 0.38±0.05<sup>*</sup> |
低剂量组 | 1.31±0.31 | 0.42±0.12<sup>**</sup> |
高剂量组 | 2.41±1.49<sup>*#</sup> | 0.39±0.08<sup>**</sup> |
F | 9.888 | 14.120 |
P | 0.042 | 0.007 |
照后7d高剂量组MyD88 mRNA表达显著升高,与空白组和模型组相比均有显著性差异(P<0.05, P<0.01),其余各照射组和空白组比较无显著性差异;照后21d,与正常组相比各照射组MyD88 mRNA 表达水平显著降低(P<0.001),各给药组与模型组比较无显著性差异,结果见表19。
照后7d高剂量组NF-κB mRNA表达显著升高,与空白组和模型组相比均有显著性差异 (P<0.01),其余各照射组和空白组比较无显著性差异;照后21d,与空白组相比各照射组NF-κB mRNA表达水平显著降低(P<0.001),各给药组与模型组比较无显著性差异,结果见表20。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 1.04±0.27 | 1.01±0.17 |
模型组 | 1.04±0.33 | 0.46±0.05<sup>***</sup> |
安多霖组 | 1.31±0.18 | 0.48±0.07<sup>***</sup> |
低剂量组 | 1.17±0.22 | 0.45±0.08<sup>***</sup> |
高剂量组 | 1.67±0.19<sup>**##</sup> | 0.47±0.12<sup>***</sup> |
F | 6.788 | 14.413 |
P | 0.001 | 0.006 |
照后7d,与空白组相比,各照射组的TNF-αmRNA表达水平无显著性差异,与模型组比较,阳性药组和中药低剂量组显著升高(P<0.01);照后21d,与空白组相比各照射组TNF-αmRNA表达水平显著降低(P<0.001),各给药组与模型组比较无显著性差异,结果见表21.
照后7d,与空白组相比各照射组IL-6 mRNA表达无显著性变化,各给药组与模型组比较也无显著性变化;照后后21d,与空白组相比各照射组IL-6 mRNA表达水平显著降低(P<0.001),各给药组与模型组比较无显著性差异,结果见表22。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 1.04±0.28 | 1.09±0.52 |
模型组 | 0.85±0.10 | 0.12±0.03<sup>***</sup> |
安多霖组 | 1.08±0.55<sup>##</sup> | 0.10±0.04<sup>***</sup> |
低剂量组 | 0.92±0.06<sup>##</sup> | 0.11±0.01<sup>***</sup> |
高剂量组 | 1.39±1.04 | 0.11±0.03<sup>***</sup> |
F | 1.662 | 14.370 |
P | 0.798 | 0.006 |
注:以上表17-22,与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##, p<0.001###。
2.6 2.0Gy60Coγ射线照射后不同时间点小鼠睾丸TLR4和TLR5蛋白的表达
(1)免疫组化染色结果
1)TLR4
结果见图2。免疫组化染色为棕黄色或棕褐色的即为阳性表达,免疫组化染色结果发现,TLR4 在空白组小鼠的睾丸中广泛表达,其中在支持细胞和间质细胞中的表达水平较高。
而模型组小鼠在照射后7d时,TLR4也是在睾丸中广泛表达,与空白组比较差异较小,照后21 d时,睾丸间质TLR4表达增强而生精小管内因生精细胞的凋亡和脱落使TLR4阳性细胞数减少。
阳性药组和中药高、低剂量组TLR4的免疫组化结果与模型组相近。
2)TLR5
结果见图3。TLR5免疫组化染色结果发现,TLR5在正常组小鼠的睾丸中广泛表达,但在次级精母细胞和精子细胞上的表达程度更高。
模型组小鼠在照后7d时,TLR5在睾丸中的表达较空白组强,照后21d时,模型组表达更强。
阳性药组小鼠在照后7d时,睾丸中TLR5表达与空白组无显著性差异,照后21天,表达程度较空白组显著增强。
中药低剂量小鼠照后7d和21d时,睾丸中TLR5表达与空白组无明显差异。
中药高剂量组小鼠照后7d时,睾丸中TLR5表达强于空白组,而照后21d时,TLR5的表达弱于空白组。
(2)免疫组化染色半定量
1)TLR4
照后7d时,只有中药低剂量组小鼠TLR4表达弱于空白组,差异具有显著性(P<0.05);照后 21d时,阳性药组小鼠睾丸TLR4表达强于空白组,差异具有显著性(P<0.01),结果见表23。
组别 | 7d | 21d |
空白组 | 0.24±0.02 | 0.23±0.02 |
模型组 | 0.24±0.02 | 0.24±0.01 |
安多霖组 | 0.23±0.01 | 0.25±0.02<sup>**</sup> |
低剂量组 | 0.23±0.01<sup>*</sup> | 0.24±0.02 |
高剂量组 | 0.24±0.02 | 0.23±0.02 |
F | 4.169 | 14.601 |
P | 0.384 | 0.006 |
2)TLR5
照后7d时,中药高剂量组小鼠睾丸TLR5表达显著强于空白组(P<0.05)。照后21d时,模型组和阳性药组睾丸TLR5表达显著强于空白组(P<0.01);中药低剂量组与空白组比较无显著性差异,与模型组比较TLR5表达显著降低(P<0.05);中药高剂量组TLR5表达显著低于空白组(P<0.05)和模型组(P<0.001),结果见表24。
(二)中药组合物对Balb/c小鼠2.0Gy60Coγ射线照后1、3、7天的防护作用
1、实验方法
成年雄性balb/c小鼠6-8周龄,体重18~22克,按体重随机分为4组:正常对照组(NC)、模型对照组(IR)、阳性药组(IR+阳性药,IRP)和中药组合物高剂量(IR+高剂量,IRH)和中药组合物低剂量组(IR+低剂量,IRL),每组12只。所有小鼠饲养在22±0.5℃恒温、湿度适宜条件,自由饮水和饮食,适应性喂养3天。
正常对照(NC):每日以去离子水0.2ml/10g体重灌胃,无射线照射,自由活动直至处死。
模型对照组(IR):每日以去离子水0.2ml/10g体重灌胃,于第10天2.0Gy60Coγ射线照射小鼠。
阳性药组(IRP):每日以去离子水0.2ml/10g体重灌胃安多霖水煎液,于第10天2.0Gy60Coγ射线照射小鼠。
中药组合物高剂量组(IRH):每日以中药复方水煎液0.2ml/10g体重灌胃,于第10天2.0Gy60Co γ射线照射小鼠。
中药组合物低剂量组(IRL):每日以中药复方水煎液0.2ml/10g体重灌胃,于第10天2.0Gy60Co γ射线照射小鼠。
给药10天后,2.0Gy60Coγ射线对小鼠进行全身一次性照射,照射剂量率控制在0.5~1.0Gy/min 之间。在每日灌胃过程中,观察小鼠皮毛、精神、粪便大小及状况、摄食量、活动等情况,并每日记录小鼠体重,于给药10天后、照后1天、3天、7天进行分批取材,摘眼球脱颈椎处死各组小鼠,解剖腹腔,取出双侧睾丸和双侧附睾。
安多霖、中药组合物低剂量组给药剂量均为人临床剂量的10倍量,二号方高剂量组给药剂量为人临床剂量的20倍量。药物浓度分别为:安多霖0.27g/ml,高剂量1.66g/ml,低剂量0.83g/ml。
2、实验结果
2.1照前给予中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤睾丸指数的影响
照前1天以及照后1、3天与正常组相比,各给药组睾丸指数均无明显变化(P>0.05);照后第 7天,与正常组相比,各照射组小鼠睾丸指数均显著下降,差异有统计学意义(P<0.01);而中药低剂量组小鼠睾丸指数比模型组明显升高(P<0.05)。结果见表25。
组别 | 照前1d | 照后1d | 照后3d | 照后7d |
空白组 | 8.05±0.72 | 7.52±0.65 | 7.90±0.60 | 8.31±0.58 |
模型组 | 无 | 7.42±0.46 | 7.57±0.38 | 7.45±0.54<sup>**</sup> |
阳性药组 | 7.80±0.52 | 7.60±0.36 | 7.96±0.71 | 7.59±0.52<sup>**</sup> |
高剂量组 | 7.87±0.31 | 7.48±0.53 | 7.51±0.67 | 7.73±0.40<sup>**</sup> |
低剂量组 | 8.45±0.49 | 7.45±0.24 | 7.70±0.57 | 7.78±0.50<sup>**#</sup> |
F | 1.570 | 0.215 | 1.056 | 5.506 |
P | 0.229 | 0.929 | 0.389 | 0.001 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
2.2照前给予中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤睾丸形态结构的影响(HE,×400)
2.2.1不同时间点小鼠睾丸形态结构
照前1天:结果如图4所示。
正常组小鼠睾丸结构清晰,各级生精细胞沿基底面向管腔面有序排列,层次分明;在生精细胞的管腔内我们可以见到各级生精细胞、支持细胞以及睾丸间质中的间质细胞形态完好;各生精小管结构完好,边界清楚,相互之间排列紧凑,睾丸间质完好。各给药组HE染色切片与正常组之间无差异。
照后1天:结果如图5所示。
正常组小鼠睾丸结构清晰,各级生精细胞沿基底面向管腔面有序排列,层次分明;在生精细胞的管腔内我们可以见到各级生精细胞、支持细胞以及睾丸间质中的间质细胞形态完好;各生精小管结构完好,边界清楚,相互之间排列紧凑,睾丸间质完好。模型组小鼠睾丸结构较模糊,各级生精细胞排列开始出现紊乱,但排列层次仍较分明,在管腔内可以见到少量的脱落的生精细胞,支持细胞和间质细胞形态结构完整,睾丸间质无水肿。各给药组小鼠睾丸未发现明显的形态结构变化。
照后3天:结果如图6所示。
正常组小鼠睾丸结构清晰,各级生精细胞沿基底面向管腔面有序排列,层次分明;在生精细胞的管腔内我们可以见到各级生精细胞、支持细胞以及睾丸间质中的间质细胞形态完好;各生精小管结构完好,边界清楚,相互之间排列紧凑,睾丸间质完好;
模型组小鼠管腔内生精细胞层数较照后1天继续减少,排列较显紊乱,层次不清;其中精原细胞数量减少,精母细胞数量仍然较多,支持细胞和间质细胞完好,睾丸间质无水肿;
阳性药组小鼠睾丸仍有大量精原细胞存在,其中精母细胞数量较多,精子细胞和精子细胞和长形精子仍然可见,细胞层数较模型组多,排列整齐规则,基底膜完好,生精小管边界间清晰,睾丸间质无损害;
中药高剂量组可见大量的精原细胞,精子细胞和精子细胞和长形精子仍然可见,细胞层数较模型组多,排列整齐规则,基底膜完好,生精小管边界间清晰,睾丸间质未见明显损伤;低剂量组小鼠睾丸中有大量的精原细胞存在,精母细胞、精子细胞和长形精子数量较多,生精小管内细胞层数较多,排列整齐紧密,睾丸间质无显著损伤。
照后7天:结果如图7所示。
正常组小鼠睾丸结构清晰,各级生精细胞沿基底面向管腔面有序排列,层次分明;在生精细胞的管腔内我们可以见到各级生精细胞、支持细胞以及睾丸间质中的间质细胞形态完好;各生精小管结构完好,边界清楚,相互之间排列紧凑,睾丸间质完好;
模型组小鼠管腔内生精细胞层数减少,数目减少;其中精原细胞小部分消失,精母细胞数量还比较多,生精小管略有萎缩、变形,各生精小管之间间隙增大,但是支持细胞和间质细胞形态完好,睾丸间质无水肿;
阳性药组小鼠尚可看到大量的精原细胞,精母细胞数量较多,精子细胞和精子细胞和长形精子仍然可见,细胞层数较模型组多,排列较模型组整齐规则,基底膜完好,生精小管边界间清晰,睾丸间质未见损伤;
中药组合物高剂量组可见精原细胞少量消失,生精上皮结构有轻微损伤,精母细胞、精子细胞和长形精子数目比较多,生精小管稍有萎缩,睾丸间质未见损伤。中药组合物低剂量组小鼠,精原细胞数目众多,精母细胞、精子细胞和长形精子数量较多,生精小管内细胞层数较多,排列较其他照射组更显整齐紧密,睾丸间质无损伤。
2.2.2不同时间点小鼠睾丸HE染色半定量分析
结果见表26。
组别 | 照前1d | 照后1d | 照后3d | 照后7d |
空白组 | 9.5±0.84 | 9.50±0.55 | 9.50±0.84 | 9.00±1.00 |
模型组 | 无 | 8.14±1.21<sup>*</sup> | 6.33±0.82<sup>***</sup> | 5.40±1.26<sup>***</sup> |
阳性药组 | 9.00±1.00 | 8.50±1.52 | 8.14±1.68<sup>*##</sup> | 6.29±0.95<sup>**</sup> |
高剂量组 | 9.50±0.55 | 8.71±0.95 | 8.14±1.07<sup>*##</sup> | 7.17±1.17<sup>*#</sup> |
低剂量组 | 9.17±0.75 | 8.71±0.76 | 8.57±0.98<sup>##</sup> | 7.86±0.69<sup>##</sup> |
F | 0.611 | 1.426 | 6.174 | 14.073 |
P | 0.616 | 0.251 | 0.001 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
如表26所示,在照前1天,各给药组睾丸Johnsen评分与正常组相比无显著性差异(P>0.05)。
照后1天,与正常组相比,模型组睾丸Johnsen评分降低,有显著性差异(P<0.01);各给药组睾丸Johnsen评分有降低趋势,与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。与模型组相比,各给药组睾丸Johnsen评分显著高于模型组(P<0.05)。
照后3天,与正常组相比,模型组睾丸Johnsen评分显著性降低(P<0.001),阳性药组和高剂量组也降低(P<0.05),均有显著性差异。与模型组相比,各给药组睾丸Johnsen评分明显升高(P<0.01),有显著性差异。
照后7天,与正常组睾丸Johnsen评分相比,模型组显著性降低(P<0.001),阳性药组明显降低 (P<0.01),高剂量组也降低(P<0.05),均有显著性差异;与模型组睾丸Johnsen评分相比,高剂量组升高(P<0.05),低剂量组也明显升高(P<0.01),均有显著性差异。
2.3照前给予中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤生精细胞凋亡率的影响
结果见表27。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
如表27所示,照前1天,与正常组相比,各给药组生精细胞凋亡率没有明显差异(P>0.05)。
照后1天,各照射组小鼠睾丸内生精细胞与正常组相比凋亡率升高;其中模型组小鼠与正常组相比生精细胞凋亡率升高,有显著性差异(P<0.05),其余各给药组小鼠生精细胞凋亡率与正常组相比虽有升高趋势,但无显著性差异(P>0.05);低剂量组生精细胞凋亡率低于模型组,且有显著性差异 (P<0.05)。
照后3天:与空白组相比,各照射组小鼠睾丸生精细胞凋亡率显著升高(P<0.001);与模型组相比,阳性药组和高剂量组睾丸凋亡率均低于模型组,有显著性差异(P<0.05);低剂量组睾丸生精细胞凋亡率明显低于模型组,有显著性差异(P<0.01)。
照后7天:与空白组相比,各照射组生精细胞凋亡率显著升高(P<0.001);与模型组相比,低剂量组睾丸生精细胞凋亡率低于模型组(P<0.01),阳性药组和高剂量组生精细胞凋亡率虽低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4照前给予中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤生精细胞凋亡基因的影响
结果见表28-表31。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
如表28所示,照前1天,各组小鼠生精细胞凋亡基因的表达无差异(P>0.05)。
如表29所示,照后1天:低剂量组Caspases3 mRNA的表达升高,与正常组相比有显著性差异 (P<0.05),其余各照射组与正常组比较无显著性差异(P>0.05),各给药组与模型组相比也无显著性差异(P>0.05);各照射组Bax mRNA的表达与正常组无显著性差异(P>0.05),各给药组与模型组相比也无显著性差异(P>0.05);各照射组Bcl-2 mRNA的表达与正常组比较无显著性差异(P> 0.05),各给药组与模型组相比也无显著性差异(P>0.05)。
如表30所示,照后3天:模型组和阳性药组Cytochrome C mRNA的表达显著性升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05),其余各照射组与正常组相比无显著性差异;高剂量组与低剂量组 Cytochrome C mRNA mRNA的表达降低,与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。各照射组Caspase3 mRNA、Bax mRNA和Bcl-2 mRNA的表达与正常组相比均没有显著性差异,且各照射组之间比较均无显著差异(P>0.05)。
如表31所示,照后7天:与正常组相比,模型组Cytochrome C mRNA的表达升高(P<0.05),有显著性差异,其余照射组与正常组相比无显著性差异(P>0.05);与模型组相比,高剂量组与低剂量组Cytochrome C mRNA的表达降低,有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。模型组和阳性药组Caspases3 mRNA的表达与正常组相比升高,有显著性差异(P<0.05),其余各给药组与正常组相比无显著性差异(P>0.05);各给药组与模型组相比Caspases3 mRNA的表达没有显著性差异(P>0.05)。模型组与正常组相比,Bax mRNA的表达升高,有显著性差异(P<0.05);阳性药组、高剂量组与正常组相比,Bax mRNA的表达降低,有显著性差异(P<0.05);低剂量组与正常组相比,Bax mRNA的表达降低,但无显著性差异(P>0.05);各给药组与模型组相比,Bax mRNA的表达明显降低,有显著性差异(P<0.01)。各组间Bcl-2 mRNA的表达情况均无显著性差异(P>0.05)。
2.5照前给予中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤睾丸TLR5、NF-κ B免疫组化结果
结果见表32-35。
组别 | TLR5 MOD | NF-κB MDA |
空白组 | 0.06±0.00 | 0.20±0.03 |
模型组 | 无 | 无 |
阳性药组 | 0.06±0.01 | 0.20±0.02 |
高剂量组 | 0.06±0.02 | 0.20±0.02 |
低剂量组 | 0.07±0.02 | 0.20±0.02 |
F | 10.104 | 0.063 |
P | 0.957 | 0.979 |
组别 | TLR5 MOD | NF-κB MDA |
空白组 | 0.07±0.01 | 0.20±0.03 |
模型组 | 0.06±0.01 | 0.20±0.02 |
阳性药组 | 0.08±0.01<sup>***###</sup> | 0.19±0.03 |
高剂量组 | 0.07±0.01 | 0.26±0.04<sup>***###</sup> |
低剂量组 | 0.08±0.01<sup>**###</sup> | 0.22±0.03<sup>**#</sup> |
F | 7.894 | 22.235 |
P | 0.000 | 0.000 |
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
如表32所示,照前1天,与正常组相比,各给药组TLR5、NF-κB的表达无显著性差异(P> 0.05)。
如表33所示,照后1天:高剂量组NF-κB的表达显著性升高,和正常组相比有显著性差异 (P<0.05);其余照射组与正常组相比无显著性差异(P>0.05),各给药组与模型组相比也无显著性差异(P>0.05)。阳性药组TLR5的表达显著性升高,与正常组和模型组相比均有显著性差异 (P<0.001);高剂量组和低剂量组TLR5的表达明显升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01),与模型组相比也有显著性差异(P<0.05)。
如表34所示,照后3天,高剂量组NF-κB的表达显著性升高,与正常组和模型组相比有显著性差异(P<0.001);低剂量组NF-κB的表达明显升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01),与模型组相比也有显著性差异(P<0.05)。阳性药组TLR5的表达显著性升高,与正常组和模型组相比均有显著性差异(P<0.001);低剂量组TLR5的表达明显升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01),与模型组相比也有显著性差异(P<0.001)。
如表35所示,照后7天,高剂量组和低剂量组的NF-κB的表达显著高于正常组和模型组 (P<0.001),模型组NF-κB的表达显著显著低于正常组(P<0.05)。模型组和阳性药组TLR5的表达降低,与正常组相比有显著性差异(P<0.001);高剂量组较正常组TLR5的表达降低,有显著性差异 (P<0.05),相比模型组表达量升高,有显著性差异(P<0.05);低剂量组较正常组TLR5的表达降低,有显著性差异(P<0.05);与模型组相比,低剂量组TLR5升高,有显著性差异(P<0.01)。
2.6照前给予二号方对2.0Gy60Coγ射线致BALB/c小鼠睾丸急性损伤睾丸TLR5/NF-κB相关基因表达的影响
结果见表36-39。
注:与空白组比较,p<0.05*,p<0.01**,p<0.001***;与模型组比较,p<0.05#,p<0.01##,p<0.001###。
RT-PCR结果显示:
如表36所示,在照前1天,与正常组相比,阳性药组和低剂量组TLR5 mRNA的表达升高 (P<0.05);在照前1天,阳性药和低剂量组MyD88 mRNA的表达明显降低(P<0.01);在照前1天,各组之间NF-κB mRNA的表达无差异(P>0.05);在照前1天,阳性药组TNF-αmRNA的表达较正常组显著升高(P<0.001),高剂量组和低剂量组TNF-αmRNA的表达较正常组明显升高(P<0.01)。
如表37所示,在照后1天,高剂量组TLR5 mRNA的表达显著升高,与正常组和模型组均有显著性差异(P<0.05),其余各照射组与正常组比较无显著性差异,其余各照射组与正常组比较无显著性差异(P>0.05),阳性药组、低剂量组和模型组比较也无显著性差异(P>0.05);在照后1天,各照射组NF-κB mRNA的表达虽较正常组升高,但差异无统计学意义(P>0.05),各给药组与模型组比较无显著性差异(P>0.05);在照后1天,高剂量组MyD88 mRNA表达显著升高,与正常组和模型组相比均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),其余各照射组和正常组比较无显著性差异(P>0.05);各给药组虽较模型组MyD88 mRNA表达升高,但无显著性差异(P>0.05)。在照后1天,高剂量组 TNF-αmRNA的表达升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.05),其余照射组虽较正常组升高,但无显著性差异(P>0.05);各给药组与模型组间无显著性差异(P>0.05)。
如表38所示,在照后3天,低剂量组mRNA的表达显著升高,与正常组和模型组均有显著性差异(P<0.05),模型组和高剂量组较正常组表达量有减低趋势,但无显著性差异(P>0.05),阳性药组与正常组相比表达有升高趋势,但是无显著性差异,其余给药组与模型组间也无显著性差异;在照后3天,与正常组相比,模型组和阳性药组的NF-κB mRNA表达降低,高剂量组与低剂量组的表达升高,均有显著性差异;与模型组相比,高剂量组和低剂量组的NF-κB mRNA的表达升高,有显著性差异,阳性药组和模型组相比无显著性差异(P>0.05)。在照后3天,各照射组MyD88 mRNA的表达与正常组相比无显著性差异(P>0.05);低剂量组MyD88 mRNA表达与模型组相比升高,有显著性差异(P<0.01)。在照后3天,高剂量组TNF-αmRNA的表达升高,与正常组相比有显著性差异 (P<0.05);低剂量组TNF-αmRNA的表达升高,与正常组相比有显著性差异(P<0.01),与模型组相比也有显著性差异(P<0.001)。
如表39所示,在照后7天,与正常组相比,各照射组TLR5 mRNA与正常组相比表达虽有降低趋势,但是没有显著性差异(P>0.05);各给药组与模型组相比,TLR5 mRNA的表达有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。在照后7天,模型组NF-κB mRNA与正常组相比显著降低,有显著性差异(P<0.05),其余各给药组与正常组相比无显著性差异(P>0.05);各给药组NF-κB mRNA 的表达虽较模型组升高,但无显著性差异(P>0.05)。在照后7天,各照射组MyD88 mRNA的表达与正常组相比无显著性差异(P>0.05),各给药组MyD88 mRNA的表达与模型组相比也没有显著性差异(P>0.05)。在照后7天,模型组TNF-αmRNA的表达显著减低,与正常组相比有显著性差异 (P<0.05);各给药组与正常组、模型组相比无显著性差异(P>0.05)。
(三)中药组合物对2.0Gy60Coγ射线致雄性Balb/c小鼠生育功能损伤的防治效应
1、实验方法
造模方法:用60Coγ射线对小鼠进行一次性全身照射,照射剂量为1.0Gy,照射剂量率为2.0 Gy/min,复制睾丸急性辐射损伤模型。钴源由北京大学化学与分子工程学院钴源室提供。
动物分组及给药:将上述40只雄性小鼠按随机数字表法分为3组:空白组、模型组、阳性药组和中药组,每组10只。以上小鼠适应性喂养3d后,空白组与模型组小鼠灌胃去离子水,安多霖组小鼠灌胃安多霖中药组小鼠灌胃中药组合物药液,均每日1次,共7d。7d后,将模型组、阳性药组与中药组用上述造模方法复制急性辐射损伤模型。照射后第4d开始,空白组和模型组小鼠灌胃去离子水,中药组小鼠灌胃中药组合物药液,均每日1次至照后35d。第36d开始,将各组雄鼠分别与正常雌鼠(每组20只)连续合笼,每1只雄鼠合2只雌鼠。确定雌鼠受孕后,将孕鼠单笼隔离饲养,各组雄鼠于照后第70d取材。
中药组给药剂量均为人临床剂量的10倍量。药物浓度为:0.83g/ml。
2、实验结果
2.1照后第70d各组小鼠精子质量情况
结果见表40。
注:与正常组比较,P<0.001***,P<0.01**,P<0.05*;与模型组比较,P<0.001###,P<0.01##, P<0.05#,与阳性药组比较,P<0.001###,P<0.01##,P<0.05#。
实验结果显示,照后第70d,与空白组比较,模型组小鼠的精子浓度、活率及膜电位显著降低 (P<0.05),阳性药组和中药组小鼠仅表现出精子膜电位显著降低(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组小鼠的精子膜电位显著上升(P<0.05),中药组小鼠的精子浓度、活率及精子膜电位显著上升 (P<0.05)。与阳性药组比较,中药组小鼠膜电位显著降低(P<0.05)。
2.2各组雌鼠受孕率、窝仔数及子代一般健康情况
2.2.1雌鼠窝仔数
结果见表41-43。
组别 | 雌鼠窝仔数(只) |
空白组 | 6.06±1.25 |
模型组 | 4.25±2.42** |
阳性药组 | 4.50±0.94* |
中药组 | 6.00±1.71##△ |
如表41所示,跟空白组相比,模型组和阳性药组雌鼠窝仔数显著降低(P<0.05),且中药组雌鼠窝仔数已恢复至正常水平,其数量显著高于模型组及阳性药组雌鼠窝仔数(P<0.05)。
表42雌鼠受孕率(n=76)
如表42所示,中药组受孕率明显高于阳性药组。
表43子代小鼠性别比例(n=158)
如表43所示,各组间雌性与雄性所占总体数量的百分比,具有统计学差异(P<0.05)。其中,与空白组相比,中药组子代小鼠雄性比例显著上升,雌性比例显著下降(P<0.05)。其余各组比较无显著差异。
2.2.2子代小鼠生长发育情况
结果见表44。
注:F组间=0.713,P=0.556>0.05;F时间=208.398,P=0.000<0.05;F交互=4.068,P=0.021<0.05;与空白组比较*P<0.05**P<0.01;与模型组比较#P<0.05;与阳性药组比较△△P<0.01△△△P<0.001。
如表44所示,在子代小鼠42日龄时,中药组子代小鼠体质量、身长显著高于其余三组(P<0.05)。在子代小鼠尾长方面,阳性药组子代小鼠尾长显著低于其余三组(P<0.05)。其余各组之间相比无显著差异。
综上所述,实施例15制备的中药组合物对辐射损伤小鼠的睾丸结构、精子质量以及生育功能等方面都具有显著的疗效。实施例16-21制备的化合物具备与实施例15化合物相同的效果。
Claims (10)
1.一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物中的原料药包括:当归3-15重量份、黄芪16-48重量份、白芍5-25重量份、马齿苋7-33重量份、枸杞子5-25重量份、茯苓6-28重量份、山楂4-20重量份、西洋参3-15重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物还包括补阳药,选自淫羊藿,菟丝子,续断,巴戟天,沙苑子,杜仲中的任意一种或几种;收涩药,选自五味子,五倍子,乌梅,罂粟壳,山茱萸,肉豆蔻中的任意一种或几种;消食药,选自谷芽,稻芽,麦芽中的任意一种或几种;补气药,选自人参,党参,山药,白扁豆,甘草等;补阴药,如麦冬,天冬,百合,北沙参,南沙参,女贞子中的任意一种或几种。
3.一种防治辐射所致生殖损害的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归3-15重量份、黄芪16-48重量份、白芍5-25重量份、马齿苋7-33重量份、枸杞子5-25重量份、茯苓6-28重量份、山楂4-20重量份、西洋参3-15重量份、淫羊藿5-25重量份、稻芽5-25重量份;
或,当归4-12重量份、黄芪22-38重量份、白芍6-18重量份、马齿苋9-25重量份、枸杞子6-18重量份、茯苓8-21重量份、山楂5-16重量份、西洋参4-12重量份、淫羊藿6-18重量份、稻芽6-18重量份;
或,当归5-9重量份、黄芪25-35重量份、白芍7-14重量份、马齿苋11-18重量份、枸杞子7-14重量份、茯苓9-16重量份、山楂6-11重量份、西洋参5-9重量份、淫羊藿7-14重量份、稻芽7-14重量份。
4.如权利要求3所述的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物中各原料药的用量为:当归6重量份、黄芪30重量份、白芍10重量份、马齿苋15重量份、枸杞子10重量份、茯苓12重量份、山楂7重量份、西洋参6重量份、淫羊藿10重量份、稻芽10重量份。
5.如权利要求1-4任一项所述的中药组合物,其特征在于,所述西洋参用人参代替。
6.如权利要求1-4任一项所述的中药组合物,其特征在于,所述中药组合物选自如下任意一种形式:各原料药分别粉碎后再混合而成的组合物;各原料药混合后经粉碎得到的组合物;各原料药分别按常规提取方法提取后再混合得到的提取物;各原料药混合后按常规提取方法提取后得到的提取物;各原料药的提取物进一步经过精制纯化工艺得到的有效部位;上述组合物、提取物、有效部位进一步按照常规制剂工艺制备得到常规剂型。
7.如权利要求1-4任一项所述的中药组合物的制备方法,其特征在于,该方法包括:
方案一:
步骤A、按比例取原料药;
步骤B、以溶剂对原料药进行提取,提取物干燥,即得。
方案二:
步骤A、按比例取原料药;
步骤B、以水为溶剂对原料药进行提取,浓缩;
步骤C、在步骤B制得的浓缩液中加入乙醇,静置,取乙醇液,浓缩,干燥,即得。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,方案二步骤C加乙醇至乙醇浓度为50%-75%;优选加乙醇至乙醇浓度为55%-70%;进一步优选加乙醇至乙醇浓度为60%。
9.如权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备具有预防和/或治疗辐射所致生殖损伤作用的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述生殖损伤包括辐射所致睾丸结构损伤、精子质量下降和/或生育功能损伤。
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石中玉等: "益气解毒方对1Gy 60Coγ射线致雄性小鼠生育功能损伤的防治效应", 《北京中医药大学学报》 * |
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