CN112725252A

CN112725252A - 一种单鼠李糖脂生产菌株及其应用

Info

Publication number: CN112725252A
Application number: CN202010924366.3A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 汪江林
Original assignee: Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Hengshi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN112725252B

Abstract

本发明一种单鼠李糖脂生产菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为出发菌株，利用同源重组的方法将其自身的rhlC基因替换为rhlAB‑R基因簇，获得了一株能够专一性生产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株；进一步结合随机诱变，筛选出一株单鼠李糖脂生产水平显著提高的突变菌株。该突变菌株利用市售的金龙鱼葵花籽油作为底物，在5L的生物反应器中，于37℃发酵90小时，单鼠李糖脂的浓度达到62.7g/L，纯度达到95.16％，其中Rha‑C₁₀‑C₁₀的比例最大，占比为68.59％。

Description

一种单鼠李糖脂生产菌株及其应用

【技术领域】

本发明属于生物技术领域。

【背景技术】

鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或者伯克氏菌(Burkholderia)分泌的一类表面活性分子，属于生物表面活性剂。它具备生物可降解、低毒性、在极端环境下仍有效等的特性。另外，还具备抑制微生物、皮肤相容性以及螯合重金属离子处理重金属污染、促进微溶性的有机化合物的溶解和生物降解。鼠李糖脂的这些特性使得它能够广泛应用于生物防治、化妆品、医药、洗涤剂、环境清洁以及是由开采等领域。

通常表说的“鼠李糖脂”不是一种单一的结构体，而是由很多种同族结构组成的混合物，在已知的报道中已经发现多达28种不同结构的鼠李糖脂结构。其具备一般表面活性剂的基本特征，其亲水基团一般由1～2分子的鼠李糖环构成，疏水基团则由1～2分子具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸构成。铜绿假单胞菌分泌的鼠李糖脂的脂链一般包括两个链长相同的羟基脂肪酸链，结构可以表示为Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀。而不同结构的鼠李糖脂同系物的分布成为了限制鼠李糖脂商品化的一个主要问题。这是由于不同结构的鼠李糖脂具备不同的溶解性以及表面活性，从而会影响鼠李糖脂产品的物理化学性质以及产品在高端领域的应用。

为了提高鼠李糖脂在高端领域的应用价值，往往需要对发酵液中的鼠李糖脂产品进行多级的纯化，已有的数据表明，后期纯化鼠李糖脂的成本占到总成本的75％左右。因此，一般通过化学合成工艺制备纯度较高的同种鼠李糖脂，例如GlycoSurf公司使用化学方法生产的鼠李糖脂，原料为鼠李糖，他们可以利用鼠李糖生产多种鼠李糖脂，从而能够更好地满足客户需求，还减少了发酵和分离过程的成本，得到更高的产量。但化学合成工艺复杂，成本居高不下。

虽然早在1980年，研究人员就从外耳感染病人中分离出了一株铜绿假单胞菌ATCC 9027(DSM 1128)，可以专一的生产单鼠李糖脂，但在37℃条件下，其生产的单鼠李糖脂水平远远低于铜绿假单胞菌PAO1菌株(Complete genome sequence of Pseudomonasaeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen. Nature 2000,406:959-964.)；尽管在小鼠模型中，研究人员验证了 ATCC9027菌株不存在感染性，但在30℃条件下，ATCC9027菌株生产的绿脓菌素水平远远高于PAO1菌株，这仍然是一个不容忽视的问题；这些问题都大大限制ATCC9027菌株的应用(María-Victoria Grosso-Becerra et al., Pseudomonasaeruginosa ATCC 9027is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipidsproduction)。

另外，也有研究人员试图在异源宿主如大肠杆菌或恶臭假单胞菌中表达铜绿假单胞菌基因组中单鼠李糖脂合成的相关基因簇以实现鼠李糖脂的生产，但产量远远低于铜绿假单胞菌本身生产的鼠李糖脂的水平(参考文献：Cabrera- Valladares N,Richardson A P,Olvera C,et al.Monorhamnolipids and 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs)production using Escherichia coli as a heterologous host[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(1):187-194.Wittgens A,TisoT,Arndt T T,et al.Growth independent rhamnolipid production from glucoseusing the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440[J].Microbial CellFactories,2011,10(1):80.)。

因此，仍然有迫切的需要构建能够专一性地生产单鼠李糖脂，且生产水平不低于PAO1菌株生产的单双混合鼠李糖脂水平的菌株。

典型模式菌株铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1 as a modelfor rhamnolipid production in bioreactor systems.Applied Microbiology andBiotechnology,2010,87(1):167-174.)。

【发明内容】

为了有效地减少下游鼠李糖脂分离纯化的过程从而有效地节约成本，本申请改用基因工程的方法构建一株能够专一性生产单鼠李糖脂，能替代传统方法生产高纯度的单鼠李糖脂的能力的菌株。本发明以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为出发菌株，该铜绿假单胞菌PAO1通过市场采购即可获得(购买自生物风，产品目录号:15692)。

针对现有技术的不足，本发明需要解决的问题是获得一株能够高效生产单鼠李糖脂的菌株，并利用该突变菌株进行发酵，生产高浓度、高纯度的单鼠李糖脂。本申请给出技术方案：

技术方案一、重组获得新菌株

一株能够高效生产高纯度的单鼠李糖脂的生产菌株，重组思路为：以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为出发菌株，利用同源重组的方法将其自身的rhlC基因替换为rhlAB-R基因簇，rhlC基因被阻断从而阻止双鼠李糖脂的合成，同时加强单鼠李糖合成基因簇rhlAB-R的表达以加强单鼠李糖脂的合成，通过以上重组构建方法获得能够专一性生产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株。

具体操作过程为：

a.以铜绿假单胞菌PAO1的基因组为模板，通过PCR方法获得rhlC基因 (KEGGaccession no.PA1130)上下游各700bp的DNA片段rhlC-U(SEQ ID NO:1)和rhlC-D(SEQ IDNO:2)；

b.以铜绿假单胞菌PAO1的基因组为模板，通过PCR方法获得包括rhlAB- R基因簇及其rhlA上游的启动子和rhlR下游的终止子序列的DNA片段rhlAB-R (SEQ ID NO:3)，共3687bp(rhlA:KEGG accession no.PA3479；rhlB: KEGG accession no.PA3478；rhlR:KEGGaccession no.PA3477).

在一些实施方案中，rhlA上游的启动子还可以被替换为乳糖诱导型启动子 Plac,Ptac或阿拉伯糖诱导型启动子ParaB等；

c.以质粒pSTV28(购买自宝日医生物(大连)有限公司)为模板，利用 PCR方法扩增获得氯霉素编码基因Tn9(SEQ ID NO:4，含启动子和终止子序列)，长度为965bp。

在一些实施方案中，选择的抗性基因标记还可以为四环素抗性基因、阿泊拉霉素抗性基因等。

d.利用融合PCR的方法对这4个DNA片段进行融合，对目的产物进行切胶回收，获得rhlC-U-rhlAB-R-Tn9-rhlC-D(SEQ ID NO:4)片段。

e.利用基于lamda-Red的基因重组方法(Lesic B,Rahme LG(2008)Use of thelambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonasaeruginosa.BMC Mol Biol 9:20–28)，实现在铜绿假单胞菌株 PAO1中rhlC的替换，利用克隆PCR方法对得到的基因工程重组菌株进行验证，验证正确的菌株命名为P2，其基因型为PAO1△rhlC::rhlAB-R：：Tn9。

此技术方案创新在于重组构建思路，方法步骤中采用的各基因工程手段都为本领域常规已有技术。

技术方案二、突变获得优势菌株P33

进一步对得到的重组菌株P2进行随机诱变。采用随机诱变方法(ARTP诱变)，利用基因工程获得的重组菌株P2进行随机诱变，控制致死率为90％以上。实施例4公开了具体过程和控制条件，最后，通过比较各突变菌株与出发菌株的Swarming运动能力，间接反应各突变菌株与野生菌株产鼠李糖脂的能力，进一步对Swarming运动能力强的菌株进行发酵验证，从中筛选出一株能够稳定高产单鼠李糖脂的菌株P33。

突变菌株P33为新品种，于2020年7月30日送交保藏，其保藏地址及保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020377，该生物材料样本的分类命名(中文和拉丁命名)：铜绿假单胞菌P33(Pseudomonas aeruginosa P33)；生物特性为一株铜绿假单胞菌，具备氯霉素抗性，且具备发酵生产单鼠李糖脂的能力；其在LB固体平板培养基上单克隆菌落形态为灰绿色，表面光滑湿润，边缘不规则，有金属光泽。

技术方案三应用方法

发酵生产单鼠李糖脂的方法

一种利用突变菌株P2发酵生产单鼠李糖脂的方法，其发酵过程需要参照已有传统铜绿假单胞菌(例如PAO1)在常规过程控制条件下即可发酵生产鼠李糖脂。举例而非限定，例如利用市售的金龙鱼葵花籽油作为底物，初始底物浓度为250g/L，在5L的生物反应器中，保持在37℃左右持续发酵总时程控制90 小时左右。发酵结束时，单鼠李糖脂的浓度达到36.8g/L，纯度达到91.17％。其中Rha-C₁₀-C₁₀的比例最大，占比为59.37％。

一种利用突变菌株P33发酵生产单鼠李糖脂的方法，其发酵过程需要参照已有传统铜绿假单胞菌(例如PAO1、P2)在常规过程控制条件下即可发酵生产鼠李糖脂。举例而非限定，例如利用市售的金龙鱼葵花籽油作为底物，初始底物浓度为250g/L，在5L的生物反应器中，保持在37℃左右持续发酵，前后总时程控制90小时左右。发酵结束时，单鼠李糖脂的浓度可达到62.7g/L，纯度达到95.16％，其中Rha-C₁₀-C₁₀的比例最大，占比为68.59％。

本发明的有益效果：利用本发明提供的稳定高产单鼠李糖脂的菌株P33以及单鼠李糖脂发酵方法进行发酵生产，显著高于现有技术中已知的单鼠李糖脂生产菌株的发酵水平，从而能够有效减少下游鼠李糖脂的分离提纯过程。

【附图说明】

无

【具体实施方式】

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按重量计算。

本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。其中出发菌，铜绿假单胞菌PAO1是典型的模式菌株，可以从商业渠道获得，也可以从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)获得。

实施例1高效生产单鼠李糖脂的基因工程菌株的构建

以铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组DNA为模板，分别利用引物rhlC-UF (SEQ IDNO:5)/rhlC-UR(SEQ ID NO:6)组合进行PCR扩增，利用引物rhlC- DF(SEQ ID NO:7)/rhlC-DR(SEQ ID NO:8)组合进行PCR扩增，切胶回收后获得rhlC基因(KEGG accessionno.PA1130)上下游的DNA片段rhlC-U (SEQ ID NO:1)和rhlC-D(SEQ ID NO:2)，长度均为700bp；以铜绿假单胞菌PAO1的基因组为模板，利用引物rhlA-F(SEQ ID NO:9)/rhlR-R(SEQ ID NO:10)组合进行PCR扩增并切胶回收后获得包括rhlAB-R基因簇及其rhlA上游的启动子和rhlR下游的终止子序列的DNA片段rhlAB-R(SEQ ID NO:3)，长度为3687bp(rhlAKEGG accession no.PA3479；rhlB KEGG accession no.PA3478；rhlR KEGG accessionno.PA3477)；以质粒pSTV28(购买自宝日医生物(大连)有限公司)为模板，利用引物Tn-F(SEQ ID NO:11)/Tn-R (SEQ ID NO:12)组合进行PCR扩增并切胶回收后获得氯霉素编码基因Tn9及其启动子和终止子序列(SEQ ID NO:4)，长度为965bp。以rhlC-U和rhlAB-R 片段作为模板，利用引物rhlC-UF(SEQ ID NO:5)/rhlR-R(SEQ ID NO:10) 组合进行PCR扩增；以Tn9和rhlC-D片段作为模板，利用引物Tn-F(SEQ ID NO:11)/rhlC-DR(SEQ ID NO:8)组合进行融合PCR，分别扩增16个循环后，各取1μL作为模板，利用引物rhlC-UF(SEQ ID NO:5)和rhlC-DR(SEQ ID NO:8)进行融合PCR，对目的产物进行切胶回收，获得rhlC-U-rhlAB-R-Tn9- rhlC-D(SEQ ID NO:13)。进一步利用基于lamda-Red的基因重组方法(Lesic B,RahmeLG(2008)Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutantsin Pseudomonas aeruginosa.BMC Mol Biol 9:20–28)，实现在铜绿假单胞菌株PAO1中rhlC的原位替换，转化后涂布于 LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠)固体培养基添加300 μg/mL的羧苄青霉素(购买自上海生工生物有限公司)和利用100μg/mL(购买自上海生工生物有限公司)的氯霉素进行筛选，进一步利用克隆PCR方法对得到的基因工程重组菌株进行验证，验证正确的菌株命名为P2。P2菌株的基因型为：PAO1△rhlC::rhlAB-R：：Tn9。同时，在不添加氯霉素抗性的条件下对基因工程菌株P2连续传代三次，并对每代的菌株进行PCR验证，基因型稳定。

表1.本发明所使用得引物序列。

实施例2重组菌株P2发酵生产鼠李糖脂

对实施例1中得到的基因工程重组菌株P2进行发酵验证，首先将吸取100 μL重组菌株P2的甘油管菌液接种于100mL摇瓶中的25mL LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠)液体培养基中，于37℃,120rpm培养24h。转接5mL过夜培养的LB培养菌液至1L摇瓶中的200mL种子培养基中，于37℃,120rpm培养24h。种子培养基的组成为：125g/L葵花子油(市售金龙鱼葵花籽油)，1.5g/L NaNO₃,0.05g/L MgSO4·7H₂O,0.1g/L KCl,0.1M NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液,pH 6.5,1mL/L微量元素溶液(2.0g/L 二水合柠檬酸钠,0.28g/L FeCl₃·6H₂O,1.4g/L ZnSO₄·7H₂O,1.2g/L CoCl₂·6H₂O,1.2g/L CuSO₄·5H₂O,0.8g/L MnSO₄·H₂O)。发酵培养基的组成为：250g/L葵花子油(市售金龙鱼葵花籽油),15.0g/L NaNO₃,0.5g/L MgSO₄·7H₂O,1.0g/L KCl,0.3g/L K₂HPO₄,1mL/L微量元素溶液(2.0g/L 二水合柠檬酸钠,0.28g/L FeCl₃·6H₂O,1.4g/L ZnSO₄·7H₂O,1.2g/L CoCl₂·6H₂O,1.2g/L CuSO₄·5H₂O,0.8g/L MnSO₄·H₂O)，pH6.5。转接适量的种子培养液至5L发酵罐中的2L发酵液中，至发酵罐初始OD580 nm＝0.06。发酵过程中通过流加4M NaOH或4M H₃PO₄调控pH维持6.5。转速400rpm， 37℃，溶氧5％。发酵时间90小时。

实施例3重组菌株P2发酵生产单鼠李糖脂的浓度和纯度测定

将发酵液5000rpm离心10min，取上清，加浓盐酸调pH至2.0，加入等体积的氯仿/甲醇(v:v＝2:1)溶液，高速涡旋震荡1min，抽提两次，将收集到的有机相进行合并，真空挥发，最终得到鼠李糖脂产品，通过硫酸蒽酮法检测总的鼠李糖脂浓度。具体测定方法为：用甲醇稀释好的鼠李糖脂100μL溶液加入到1mL 0.1％的蒽酮溶液(用70％的硫酸配制而成)中，80℃处理30 min，然后冷却到室温，检测625nm吸光值，同时用不同浓度的鼠李糖做标准曲线，最后通过鼠李糖脂标准曲线得出所测液体鼠李糖的浓度，乘以相关系数 3.0算的鼠李糖脂的浓度。最后测定得到重组工程菌株P2发酵液的鼠李糖脂的浓度达到36.8g/L。

进一步利用LC-MS测定鼠李糖脂的纯度，得到的产物组成如下表2所示，从中可以看出重组工程菌株P2发酵生产的鼠李糖脂产物中已无双鼠李糖脂的生成，单鼠李糖脂的纯度达到91.17％，其中单鼠李糖脂的组成包括Rha-C₁₀- C₁₂/Rha-C₁₂-C₁₀,Rha-C₈-C₁₀/Rha-C₁₀-C₈以及Rha-C₁₀-C₁₀，其中Rha-C₁₀-C₁₀的比例最大，占比为59.37％。

表2.LC/MS分析铜绿假单胞菌重组P2菌株发酵生产的鼠李糖脂产品组成成分。

分子量	分子式	占比％
			329.130	C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>,C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>	0.0548
475.031	Rha-C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>,Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>	0.1323
			503.158	Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>10</sub>	0.5937
531.096	Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>12</sub>,Rha-C<sub>12</sub>-C<sub>10</sub>	0.1309
			621.125	Rha-Rha-C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>,Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>	ND
649.034	Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>10</sub>	ND
			677.083	Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>12</sub>,Rha-Rha-C<sub>12</sub>-C<sub>10</sub>	ND
Total		0.9117

ND：未检测到。

实施例4对P2菌株进行ARTP随机诱变获得优势菌株P33

对实施例1中获得的重组铜绿假单胞菌菌株P2进行ARTP随机诱变，控制致死率为90％以上。根据铜绿假单胞菌菌株的Swarming运动与其产鼠李糖脂的产量相关联，利用Swarming运动能力的比较对获得的随机诱变菌株进行筛选，具体做法为：首先接种各突变菌株和出发菌株P2于平板固体培养基(蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2，121℃灭菌30min)和液体培养基中(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2，121℃灭菌30min)，置于37℃静置或200rpm振荡培养12h后，吸取1μL菌液于营养肉汤半固体平板中(琼脂粉浓度为0.5％)，37℃过夜培养，比较出发菌株P2与各突变菌株的 Swarming运动圈的直径，同时接种铜绿假单胞菌PAO1作为对照。共筛选了40 个突变株(P11-P50)，结果如表3所示，从中筛选出一株Swarming运动圈直径明显提高的突变菌株P33。

表3.铜绿假单胞菌PAO1、P2和各随机突变株的Swarming运动圈直径比较。

实施例5突变菌株P33发酵生产鼠李糖脂

对实施例4中随机诱变筛选得到的优势菌株P33进行发酵验证，首先将吸取100μLP33菌株的甘油管菌液接种于100mL摇瓶中的25mL LB(10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠)液体培养基中，于37℃,120 rpm培养24h。转接5mL过夜培养的LB培养菌液至1L摇瓶中的200mL种子培养基中，于37℃,120rpm培养24h。种子培养基的组成为：125g/L葵花子油(市售金龙鱼葵花籽油)，1.5g/L NaNO₃,0.05g/L MgSO4·7H₂O,0.1 g/L KCl,0.1MNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液,pH 6.5,1mL/L微量元素溶液(2.0 g/L二水合柠檬酸钠,0.28g/LFeCl₃·6H₂O,1.4g/L ZnSO₄·7H₂O,1.2g/L CoCl₂·6H₂O,1.2g/L CuSO₄·5H₂O,0.8g/LMnSO₄·H₂O)。发酵培养基的组成为：250g/L葵花子油(市售金龙鱼葵花籽油),15.0g/LNaNO₃,0.5g/L MgSO₄·7H₂O,1.0g/L KCl,0.3g/L K₂HPO₄,1mL/L微量元素溶液(2.0g/L 二水合柠檬酸钠,0.28g/L FeCl₃·6H₂O,1.4g/L ZnSO₄·7H₂O,1.2g/L CoCl₂·6H₂O,1.2g/LCuSO₄·5H₂O,0.8g/L MnSO₄·H₂O)，pH6.5。转接适量的种子培养液至5L发酵罐中的2L发酵液中，至发酵罐初始OD580 nm＝0.06。发酵过程中通过流加4M NaOH或4M H₃PO₄调控pH维持6.5。转速控制为400 rpm，37℃，溶氧5％。发酵时间90小时。发酵过程中通过流加消泡剂进行消泡。

实施例6突变菌株P33发酵生产单鼠李糖脂的浓度和纯度测定

收集突变菌株P33的发酵液，5000rpm离心10min，取上清，加浓盐酸调 pH至2.0，加入等体积的氯仿/甲醇(v:v＝2:1)溶液，高速涡旋震荡1min，抽提两次，将收集到的有机相进行合并，真空挥发，最终得到鼠李糖脂产品，通过硫酸蒽酮法检测总的鼠李糖脂浓度。具体测定方法为：用甲醇稀释好的鼠李糖脂100μL溶液加入到1mL 0.1％的蒽酮溶液(用70％的硫酸配制而成) 中，80℃处理30min，然后冷却到室温，检测625nm吸光值，同时用不同浓度的鼠李糖做标准曲线，最后通过鼠李糖脂标准曲线得出所测液体鼠李糖的浓度，乘以相关系数3.0算得鼠李糖脂的浓度。最后测定得到P33突变菌株发酵液的鼠李糖脂的浓度达到62.7g/L。

进一步利用LC-MS测定鼠李糖脂的纯度，得到的产物组成如下表4所示，从中可以看出突变菌株P33发酵生产的鼠李糖脂产物中同样无双鼠李糖脂的生成，单鼠李糖脂的纯度达到95.16％，其中单鼠李糖脂的组成包括Rha-C₁₀- C₁₂/Rha-C₁₂-C₁₀,Rha-C₈-C₁₀/Rha-C₁₀-C₈以及Rha-C₁₀-C₁₀，其中Rha-C₁₀-C₁₀的比例最大，占比为68.59％。

表4.LC/MS分析铜绿假单胞菌P33突变菌株发酵生产的鼠李糖脂产品组成成分。

分子量	分子式	占比％
			329.130	C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>,C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>	0.0148
475.031	Rha-C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>,Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>	0.1300
			503.158	Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>10</sub>	0.6859
531.096	Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>12</sub>,Rha-C<sub>12</sub>-C<sub>10</sub>	0.1209
			621.125	Rha-Rha-C<sub>8</sub>-C<sub>10</sub>,Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>8</sub>	ND
649.034	Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>10</sub>	ND
			677.083	Rha-Rha-C<sub>10</sub>-C<sub>12</sub>,Rha-Rha-C<sub>12</sub>-C<sub>10</sub>	ND
Total		0.9516

ND：未检测到。

SEQ ID NO:1铜绿假单胞菌PAO1菌株rhlC基因上游700bp DNA序列rhlC-U

CGCCCTGCTCGCCGGCCTGTTCCTCGAGGAAACCCTGCCCCCGACGCGACGCCGCCGCCTGGACCCGAGGCGGATGAATGCCTTGCGCTCGATCAGCGGCCTGGCTCGGCAACCGGGGGTCGGACGCCTGCTGGCGGT GCTTGCCCTGGTATTCCTCGGCTTGCAGGCGGTGATGGTGGTCTGGCCGTTCTTCGTGATCGAGAAGTT TCACTGGAGCAGCGCCTGGATCGGCTACTCGCTGGCCCTCTACGGCGTGCTCGCGGTGCTCGCCCAGAC CCTCGGCGTGAACCTCTGCAAGCGGCGCCTGGACGACGCCCGCCTGCTGCGCCTGGGCCTCGCCCTGCA AGGCTGCGGCCTGCTGCTGTTCGCCCTGGTCGACTCGTCATTCTGGCTGGTCTGCGCGCTGCTGCCCTT CGCGCTCGGCAGCCTCGCCACCCCGGCCATGCAGGGGCTGCTCTCGGCCCGCGTGCCGGTCGACCGCCA GGGCGAGTTGCAGGGCGTGCTGAGCAGCCTGATGAGCCTCGCCGCGATCGTCGGTCCGCCGCTGATGAG CGGCCTGTTCCACTGGGGCAGCGGTCCGCTCGCGCCGCTGCCCCTGGCCGGCGCGCCATTCCTCGCCGG CGCCCTTCTCGTTCTGGCCGGGCTGGTCCTGGCCTGGCAACTTCGACCTACGGGAGAAGAACGATCATG GACCGGATAG

SEQ ID NO:2铜绿假单胞菌PAO1菌株rhlC基因下游700bp DNA序列rhlC-D

CTAGTCGGCGAAACGCATTCCCGCATAGGGCGCTTGCCGGCACGCCGCGAGCCGGCTGCGCAGGTCGCCGACGTGGGCCTCCAGGCGATGGCCGTCCGGGTCGAGGAAGTAGAACGAATCGCCCTCGCTGCGGTTCTG CTTCCATTCGCGCACGCCATGCGCGCGCAGCTGCGCGGCGAAGCGGGCGAAATCCGCGGCGGCGATGCC GAAGGCGTAGTGCGTGTAGTCCGCGGCCGGCCCGCCGTACTGCGGCTCCCGGGACAGGCACAGCCACAG CGAACCCAGTTCGAGATAGGCGCCCTGGTCCCAGCGCGCTTCCAGGCGAAAGCCGAGAAGATCGCGGTA GAAGGCGATGCTGGCCGGCAGGTCGGCGACCGCCAGGGTCAGGTGATTGAGACCGGTAAGCATGGGGGC TCCTTGCAAGATGTGGCGGGAGGTCGATTCAGGCACGTCCCAGCCAGTCGCCGCGGATCATTTCCATCA GTTGGCGCAAGCCGGGTTGCGGCTGGCGTCGGCTCGGATAGTAGAGGCAGAACGGCGCGCCCATCGAGG TCCAGTCCGGCAATACCAGTTGCAGCCGGCCGCTACGCAGCTCCTCGGCGATTCCCACCTCCAGGCAGT AGGCCAGGCCGACACCGTCCAGGGCCGCGGCAACCGCCGTATTGCTTTCGTTGACGCTGAAGGGGCCGG GCACGTCGAC

SEQ ID NO:3铜绿假单胞菌PAO1菌株rhlAB-R基因簇DNA序列，包括rhlAB- R基因簇及其rhlA上游的启动子和rhlR下游的终止子序列的DNA片段，启动子和终止子序列分别用下划线标出

CGCCAGAGCGTTTCGACACCGGAAACCGGGCCTGGCGCCCGGTTTTTTCATGCCTTTTCCGCCAACCC CTCGCTGTTCCCCGCCGGCCGCTCTGGCACGCCTTATCGCGGGCGGGCAGGGGCTTATGCGCAGGCGGCCGCCCGT CCTGTGAAATCTGGCAGTTACCGTTAGCTTTCGAATTGGCTAAAAAGTGTTCATCGGCTACGCGTGAACACGGACG CCAATCGTTTGCGCAGGCCGATCTGCAAGACCCACACAAGCCCCTCGCCTGAAGGGGTACGCATCCGCCGTGGCTG GTCCGCGCGGATGGCCGCTGAGTTACTTGTCTGCCGTTCGAACAATAAGAACGAACTCTACGTAATGCCGGGATAC CCGTGGCAGCGATAGCTGTTTGCCTGTTCGAAAATTTTTGGGAGGTGTGAAATGCGGCGCGAAAGTCTGTTGGTATCGGTTTGCAAGGGCCTGCGGGTACATGTCGAGCGC GTTGGGCAGGATCCCGGGCGCAGCACGGTGATGCTGGTCAACGGCGCGATGGCGACCACCGCCTCGTTC GCCCGGACCTGCAAGTGCCTGGCCGAACATTTCAACGTGGTGCTGTTCGACCTGCCCTTCGCCGGGCAG TCGCGTCAGCACAACCCGCAGCGCGGGTTGATCACCAAGGACGACGAGGTGGAAATCCTCCTGGCGCTG ATCGAGCGCTTCGAGGTCAATCACCTGGTCTCCGCGTCCTGGGGCGGTATCTCCACGCTGCTGGCGCTG TCGCGCAATCCGCGCGGCATCCGCAGCTCGGTGGTGATGGCATTCGCCCCTGGACTGAACCAGGCGATG CTCGACTACGTCGGGCGGGCGCAGGCGCTGATCGAGCTGGACGACAAGTCGGCGATCGGCCATCTGCTCAACGAGACCGTCGGCAAATACCTGCCGCAGCGCCTGAAAGCCAGCAACCATCAGCACATGGCTTCGCTG GCCACCGGCGAATACGAGCAGGCGCGCTTTCACATCGACCAGGTGCTGGCGCTCAACGATCGGGGCTAC TTGGCTTGCCTGGAGCGGATCCAGAGCCACGTGCATTTCATCAACGGCAGCTGGGACGAATACACCACC GCCGAGGACGCCCGCCAGTTCCGCGACTACCTGCCGCACTGCAGTTTCTCGCGGGTGGAGGGCACCGGG CATTTCCTCGACCTGGAGTCCAAGCTGGCAGCGGTACGCGTGCACCGCGCCCTGCTCGAGCACCTGCTG AAGCAACCGGAGCCGCAGCGGGCGGAACGCGCGGCGGGATTCCACGAGATGGCCATCGGCTACGCCTGA ACCCTTGACCTGCGAAGACCCGGCCTGGCCGGGCTTTGCGGTTGCATAACGCACGGAGTAGCCCCATGC ACGCCATCCTCATCGCCATCGGCTCGGCCGGCGACGTATTTCCCTTCATCGGCCTGGCCCGGACCCTGA AACTGCGCGGGCACCGCGTGAGCCTCTGCACCATCCCGGTGTTTCGCGACGCGGTGGAGCAGCACGGCA TCGCGTTCGTCCCGCTGAGCGACGAACTGACCTACCGCCGGACCATGGGCGATCCGCGCCTGTGGGACC CCAAGACGTCCTTCGGCGTGCTCTGGCAAGCCATCGCCGGGATGATCGAGCCGGTCTACGAGTACGTCT CGGCGCAGCGCCATGACGACATCGTGGTGGTCGGCTCGCTATGGGCGCTGGGCGCACGCATCGCTCACG AGAAGTACGGGATTCCCTACCTGTCCGCGCAGGTCTCGCCATCGACCCTGTTGTCGGCGCACCTGCCGC CGGTACACCCCAAGTTCAACGTGCCCGAGCAGATGCCGCTGGCGATGCGCAAGCTGCTCTGGCGCTGCA TCGAGCGCTTCAAGCTGGATCGCACCTGCGCGCCGGAGATCAACGCGGTGCGCCGCAAGGTCGGCCTGG AAACGCCGGTGAAGCGCATCTTCACCCAATGGATGCATTCGCCGCAGGGCGTGGTCTGCCTGTTCCCGG CCTGGTTCGCGCCGCCCCAGCAGGATTGGCCGCAACCCCTGCACATGACCGGCTTCCCGCTGTTCGACG GCAGTATCCCGGGGACCCCGCTCGACGACGAACTGCAACGCTTTCTCGATCAGGGCAGCCGGCCGCTGG TGTTCACCCAGGGCTCGACCGAACACCTGCAGGGCGACTTCTACGCCATGGCCCTGCGCGCGCTGGAAC GCCTCGGCGCGCGTGGGATCTTCCTCACCGGCGCCGGCCAGGAACCGCTGCGCGGCTTGCCGAACCACG TGCTGCAGCGCGCCTACGCGCCACTGGGAGCCTTGCTGCCATCGTGCGCCGGGCTGGTCCATCCGGGCG GTATCGGCGCCATGAGCCTAGCCTTGGCGGCGGGGGTGCCGCAGGTGCTGCTGCCCTGTGCCCACGACC AGTTCGACAATGCCGAACGGCTGGTCCGGCTCGGCTGCGGGATGCGCCTGGGCGTGCCGTTGCGCGAGC AGGAGTTGCGCGGGGCGCTGTGGCGCTTGCTCGAGGACCCGGCCATGGCGGCGGCCTGTCGGCGTTTCA TGGAATTGTCACAACCGCACAGTATCGCTTGCGGTAAAGCGGCCCAGGTGGTCGAACGTTGTCATAGGGAGGGGGATGCTCGATGGCTGAAGGCTGCGTCCTGAACGGTGCTGGCATAACAGATAGGGTTGCCATGAT TTTGCCGTATCGGCAAGGCTGCGCGCTTGACAGCGTCATACCCCGGGCCAATTCTGCTGTGATGCATTT TATCGATCAGGGCTTACTGCAATGAGGAATGACGGAGGCTTTTTGCTGTGGTGGGACGGTTTGCGTAGC GAGATGCAGCCGATCCACGACAGCCAGGGCGTGTTCGCCGTCCTGGAAAAGGAAGTGCGGCGCCTGGGC TTCGATTACTACGCCTATGGCGTGCGCCACACGATTCCCTTCACCCGGCCGAAGACCGAGGTCCATGGC ACCTATCCCAAGGCCTGGCTGGAGCGATACCAGATGCAGAACTACGGGGCCGTGGATCCGGCGATCCTC AACGGCCTGCGCTCCTCGGAAATGGTGGTCTGGAGCGACAGCCTGTTCGACCAGAGCCGGATGCTCTGG AACGAGGCTCGCGATTGGGGCCTCTGTGTCGGCGCGACCTTGCCGATCCGCGCGCCGAACAATTTGCTC AGCGTGCTTTCCGTGGCGCGCGACCAGCAGAACATCTCCAGCTTCGAGCGCGAGGAAATCCGCCTGCGG CTGCGTTGCATGATCGAGTTGCTGACCCAGAAGCTGACCGACCTGGAGCATCCGATGCTGATGTCCAAC CCGGTCTGCCTGAGCCATCGCGAACGCGAGATCCTGCAATGGACCGCCGACGGCAAGAGTTCCGGGGAA ATCGCCATCATCCTGAGCATCTCCGAGAGCACGGTGAACTTCCACCACAAGAACATCCAGAAGAAGTTC GACGCGCCGAACAAGACGCTGGCTGCCGCCTACGCCGCGGCGCTGGGTCTCATCTGAAGCGCAGGGCGCGCC GGTCGGCGCGCCCTACCAGATCTGGCAGGTTGCCTGCCGTTCATCCTCCTTTAGTCTTCCCCCTCATGTGTGTGCTG GTATGTCCTCCGACTGAGAGGGCCCAGGAGTATCAGGGTAGGGATGCCGCCTTTTTTTTCTCGGCCGGCACGACACG GGGACTTGGTC

SEQ ID NO:4氯霉素编码基因Tn9，含启动子和终止子序列，启动子和终止子序列用下划线标出，长度为965bp，

atacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagcc ctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataaga tcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggag aaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcattt cagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgta aagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccg gaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtt ttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttcta cacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgag aatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatg gacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccg ctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaa cagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacg cctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccgg

SEQ ID NO:13融合片段rhlC-U-rhlAB-R-Tn9-rhlC-D序列，长度为6052 bp，人工合成

CGCCCTGCTCGCCGGCCTGTTCCTCGAGGAAACCCTGCCCCCGACGCGACGCCGCCGCCTGGACCCGAGGCGGATGAATGCCTTGCGCTCGATCAGCGGCCTGGCTCGGCAACCGGGGGTCGGACGCCTGCTGGCGGT GCTTGCCCTGGTATTCCTCGGCTTGCAGGCGGTGATGGTGGTCTGGCCGTTCTTCGTGATCGAGAAGTT TCACTGGAGCAGCGCCTGGATCGGCTACTCGCTGGCCCTCTACGGCGTGCTCGCGGTGCTCGCCCAGAC CCTCGGCGTGAACCTCTGCAAGCGGCGCCTGGACGACGCCCGCCTGCTGCGCCTGGGCCTCGCCCTGCA AGGCTGCGGCCTGCTGCTGTTCGCCCTGGTCGACTCGTCATTCTGGCTGGTCTGCGCGCTGCTGCCCTT CGCGCTCGGCAGCCTCGCCACCCCGGCCATGCAGGGGCTGCTCTCGGCCCGCGTGCCGGTCGACCGCCA GGGCGAGTTGCAGGGCGTGCTGAGCAGCCTGATGAGCCTCGCCGCGATCGTCGGTCCGCCGCTGATGAG CGGCCTGTTCCACTGGGGCAGCGGTCCGCTCGCGCCGCTGCCCCTGGCCGGCGCGCCATTCCTCGCCGG CGCCCTTCTCGTTCTGGCCGGGCTGGTCCTGGCCTGGCAACTTCGACCTACGGGAGAAGAACGATCATG GACCGGATAGCGCCAGAGCGTTTCGACACCGGAAACCGGGCCTGGCGCCCGGTT TTTTCATGCCTTTTCCGCCAACCCCTCGCTGTTCCCCGCCGGCCGCTCTGGCACGCCTTATCGCGGGCGGGCAGGG GCTTATGCGCAGGCGGCCGCCCGTCCTGTGAAATCTGGCAGTTACCGTTAGCTTTCGAATTGGCTAAAAAGTGTTC ATCGGCTACGCGTGAACACGGACGCCAATCGTTTGCGCAGGCCGATCTGCAAGACCCACACAAGCCCCTCGCCTGA AGGGGTACGCATCCGCCGTGGCTGGTCCGCGCGGATGGCCGCTGAGTTACTTGTCTGCCGTTCGAACAATAAGAAC GAACTCTACGTAATGCCGGGATACCCGTGGCAGCGATAGCTGTTTGCCTGTTCGAAAATTTTTGGGAGGTGTGAAATGCGGCGCGAAAGTCTGTTGGTATCGGTTTGCAAGGGCCTGCGGGTACA TGTCGAGCGCGTTGGGCAGGATCCCGGGCGCAGCACGGTGATGCTGGTCAACGGCGCGATGGCGACCAC CGCCTCGTTCGCCCGGACCTGCAAGTGCCTGGCCGAACATTTCAACGTGGTGCTGTTCGACCTGCCCTT CGCCGGGCAGTCGCGTCAGCACAACCCGCAGCGCGGGTTGATCACCAAGGACGACGAGGTGGAAATCCT CCTGGCGCTGATCGAGCGCTTCGAGGTCAATCACCTGGTCTCCGCGTCCTGGGGCGGTATCTCCACGCT GCTGGCGCTGTCGCGCAATCCGCGCGGCATCCGCAGCTCGGTGGTGATGGCATTCGCCCCTGGACTGAA CCAGGCGATGCTCGACTACGTCGGGCGGGCGCAGGCGCTGATCGAGCTGGACGACAAGTCGGCGATCGG CCATCTGCTCAACGAGACCGTCGGCAAATACCTGCCGCAGCGCCTGAAAGCCAGCAACCATCAGCACAT GGCTTCGCTGGCCACCGGCGAATACGAGCAGGCGCGCTTTCACATCGACCAGGTGCTGGCGCTCAACGATCGGGGCTACTTGGCTTGCCTGGAGCGGATCCAGAGCCACGTGCATTTCATCAACGGCAGCTGGGACGA ATACACCACCGCCGAGGACGCCCGCCAGTTCCGCGACTACCTGCCGCACTGCAGTTTCTCGCGGGTGGA GGGCACCGGGCATTTCCTCGACCTGGAGTCCAAGCTGGCAGCGGTACGCGTGCACCGCGCCCTGCTCGA GCACCTGCTGAAGCAACCGGAGCCGCAGCGGGCGGAACGCGCGGCGGGATTCCACGAGATGGCCATCGG CTACGCCTGAACCCTTGACCTGCGAAGACCCGGCCTGGCCGGGCTTTGCGGTTGCATAACGCACGGAGT AGCCCCATGCACGCCATCCTCATCGCCATCGGCTCGGCCGGCGACGTATTTCCCTTCATCGGCCTGGCC CGGACCCTGAAACTGCGCGGGCACCGCGTGAGCCTCTGCACCATCCCGGTGTTTCGCGACGCGGTGGAG CAGCACGGCATCGCGTTCGTCCCGCTGAGCGACGAACTGACCTACCGCCGGACCATGGGCGATCCGCGC CTGTGGGACCCCAAGACGTCCTTCGGCGTGCTCTGGCAAGCCATCGCCGGGATGATCGAGCCGGTCTAC GAGTACGTCTCGGCGCAGCGCCATGACGACATCGTGGTGGTCGGCTCGCTATGGGCGCTGGGCGCACGC ATCGCTCACGAGAAGTACGGGATTCCCTACCTGTCCGCGCAGGTCTCGCCATCGACCCTGTTGTCGGCG CACCTGCCGCCGGTACACCCCAAGTTCAACGTGCCCGAGCAGATGCCGCTGGCGATGCGCAAGCTGCTC TGGCGCTGCATCGAGCGCTTCAAGCTGGATCGCACCTGCGCGCCGGAGATCAACGCGGTGCGCCGCAAG GTCGGCCTGGAAACGCCGGTGAAGCGCATCTTCACCCAATGGATGCATTCGCCGCAGGGCGTGGTCTGC CTGTTCCCGGCCTGGTTCGCGCCGCCCCAGCAGGATTGGCCGCAACCCCTGCACATGACCGGCTTCCCG CTGTTCGACGGCAGTATCCCGGGGACCCCGCTCGACGACGAACTGCAACGCTTTCTCGATCAGGGCAGC CGGCCGCTGGTGTTCACCCAGGGCTCGACCGAACACCTGCAGGGCGACTTCTACGCCATGGCCCTGCGC GCGCTGGAACGCCTCGGCGCGCGTGGGATCTTCCTCACCGGCGCCGGCCAGGAACCGCTGCGCGGCTTG CCGAACCACGTGCTGCAGCGCGCCTACGCGCCACTGGGAGCCTTGCTGCCATCGTGCGCCGGGCTGGTC CATCCGGGCGGTATCGGCGCCATGAGCCTAGCCTTGGCGGCGGGGGTGCCGCAGGTGCTGCTGCCCTGT GCCCACGACCAGTTCGACAATGCCGAACGGCTGGTCCGGCTCGGCTGCGGGATGCGCCTGGGCGTGCCG TTGCGCGAGCAGGAGTTGCGCGGGGCGCTGTGGCGCTTGCTCGAGGACCCGGCCATGGCGGCGGCCTGT CGGCGTTTCATGGAATTGTCACAACCGCACAGTATCGCTTGCGGTAAAGCGGCCCAGGTGGTCGAACGT TGTCATAGGGAGGGGGATGCTCGATGGCTGAAGGCTGCGTCCTGAACGGTGCTGGCATAACAGATAGGG TTGCCATGATTTTGCCGTATCGGCAAGGCTGCGCGCTTGACAGCGTCATACCCCGGGCCAATTCTGCTGTGATGCATTTTATCGATCAGGGCTTACTGCAATGAGGAATGACGGAGGCTTTTTGCTGTGGTGGGACGG TTTGCGTAGCGAGATGCAGCCGATCCACGACAGCCAGGGCGTGTTCGCCGTCCTGGAAAAGGAAGTGCG GCGCCTGGGCTTCGATTACTACGCCTATGGCGTGCGCCACACGATTCCCTTCACCCGGCCGAAGACCGA GGTCCATGGCACCTATCCCAAGGCCTGGCTGGAGCGATACCAGATGCAGAACTACGGGGCCGTGGATCC GGCGATCCTCAACGGCCTGCGCTCCTCGGAAATGGTGGTCTGGAGCGACAGCCTGTTCGACCAGAGCCG GATGCTCTGGAACGAGGCTCGCGATTGGGGCCTCTGTGTCGGCGCGACCTTGCCGATCCGCGCGCCGAA CAATTTGCTCAGCGTGCTTTCCGTGGCGCGCGACCAGCAGAACATCTCCAGCTTCGAGCGCGAGGAAAT CCGCCTGCGGCTGCGTTGCATGATCGAGTTGCTGACCCAGAAGCTGACCGACCTGGAGCATCCGATGCT GATGTCCAACCCGGTCTGCCTGAGCCATCGCGAACGCGAGATCCTGCAATGGACCGCCGACGGCAAGAG TTCCGGGGAAATCGCCATCATCCTGAGCATCTCCGAGAGCACGGTGAACTTCCACCACAAGAACATCCA GAAGAAGTTCGACGCGCCGAACAAGACGCTGGCTGCCGCCTACGCCGCGGCGCTGGGTCTCATCTGAAGCGCAGGGCGCGCCGGTCGGCGCGCCCTACCAGATCTGGCAGGTTGCCTGCCGTTCATCCTCCTTTAG TCTTCCCCCTCATGTGTGTGCTGGTATGTCCTCCGACTGAGAGGGCCCAGGAGTATCAGGGTAGGGATGCCGCCTT TTTTTTCTCGGCCGGCACGACACGGGGACTTGGTCatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcc tggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggt tccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaagg aagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttga tatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataacca gaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggc ctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtga gctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatc gctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtta cggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctg ggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctg tgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggc gtaattttttta aggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaatt cgaaagcaaattcgacccggCTAGTCGGCGAAACGCATTCCCGCATAGGG CGCTTGCCGGCACGCCGCGAGCCGGCTGCGCAGGTCGCCGACGTGGGCCTCCAGGCGATGGCCGTCCGG GTCGAGGAAGTAGAACGAATCGCCCTCGCTGCGGTTCTGCTTCCATTCGCGCACGCCATGCGCGCGCAG CTGCGCGGCGAAGCGGGCGAAATCCGCGGCGGCGATGCCGAAGGCGTAGTGCGTGTAGTCCGCGGCCGG CCCGCCGTACTGCGGCTCCCGGGACAGGCACAGCCACAGCGAACCCAGTTCGAGATAGGCGCCCTGGTC CCAGCGCGCTTCCAGGCGAAAGCCGAGAAGATCGCGGTAGAAGGCGATGCTGGCCGGCAGGTCGGCGAC CGCCAGGGTCAGGTGATTGAGACCGGTAAGCATGGGGGCTCCTTGCAAGATGTGGCGGGAGGTCGATTC AGGCACGTCCCAGCCAGTCGCCGCGGATCATTTCCATCAGTTGGCGCAAGCCGGGTTGCGGCTGGCGTC GGCTCGGATAGTAGAGGCAGAACGGCGCGCCCATCGAGGTCCAGTCCGGCAATACCAGTTGCAGCCGGC CGCTACGCAGCTCCTCGGCGATTCCCACCTCCAGGCAGTAGGCCAGGCCGACACCGTCCAGGGCCGCGG CAACCGCCGTATTGCTTTCGTTGACGCTGAAGGGGCCGGGCACGTCGAC。

Claims

1.一株能够高效生产高纯度的单鼠李糖脂的生产菌株P2，其特征在于，其基因型为PAO1△rhlC::rhlAB-R：：Tn9。

2.一种获得权利要求1菌株P2的重组方法，其特征在于，以铜绿假单胞菌PAO1菌株作为出发菌株，利用同源重组的方法将其自身的rhlC基因替换为rhlAB-R基因簇，rhlC基因被阻断从而阻止双鼠李糖脂的合成，同时加强单鼠李糖合成基因簇的表达rhlAB-R以加强单鼠李糖脂的合成，通过以上重组构建方法获得能够专一性生产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌菌株。

3.一种突变菌株，其特征在于，基于权利要求1菌株通过诱变获得能高效生产高纯度的双鼠李糖脂的生产菌株P33，该菌株微生物保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020377。

4.一种利用重组菌株P2发酵生产单鼠李糖脂的方法。

5.一种利用突变菌株P33发酵生产单鼠李糖脂的方法。

6.如权利要求4或者5所述的方法，其特征在于，发酵过程参照已有传统铜绿假单胞菌在常规过程及常规控制条件下即可发酵生产单鼠李糖脂。