CN112694960A - 一种富氢不伤肝酒精饮品及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物领域，具体是富氢不伤肝酒精饮品及其制备方法和应用。本发明直接将将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，减轻乙醇引起的肝损伤，尤其是针对本来存在酒精性和非酒精性脂肪肝损伤的人群，富氢酒精饮品在氢气浓度1ppm时就可达到较好的防治酒精性和非酒精性脂肪肝患者的进一步肝损伤；这种保护作用对于酒精含量38％(包括38％)以下的饮品尤其明显，甚至能达到和饮用水一样的效果。

Description

一种富氢不伤肝酒精饮品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，是一种富氢不伤肝酒精饮品及其制备方法和应用。
背景技术
长期暴露于环境有害因素、药物过度使用，过量使用酒精饮品都会对健康产生影响，尤其是对肝脏会产生化学性肝损伤。其中酒精性肝损伤最为常见，2010年酒精性肝损伤导致的肝硬化死亡人数更是占到了全球总死亡人数的0.9％。由于酒场文化和好客传统的影响，受到酒精性肝损伤的人员比例更甚。近年来，超重和肥胖人群的比例逐渐增多，这其中大部分人也遭受着非酒精性脂肪肝的困难，甚至存在着肝损伤。
很多酒精性和非酒精性肝损伤的人群出于应酬的需要，不得不多次摄入酒精饮品，因此研究一种不引起肝损伤的酒精饮品显得非常有意义。现今有多种物质可以有效保护肝脏免受酒精等的影响，如维生素E，维生素C，西药(戒酒硫)、姜黄素等，但这些物质要么不能直接加入到酒精饮品中，要么会影响饮品的口感。
多项研究表明酒精等引起肝损伤的机制主要以氧化应激反应和活性氧自由基等造成的氧化损伤为主。氢气作为一种抗氧化剂，在许多氧化应激损伤中发挥着重要的作用。上海第二军医大学的研究人员发现富氢生理盐水能够降低梗阻性黄疸小鼠的肝损伤程度，延长小鼠的存活周期(Liu Q,Shen W,Sun H,et al.Hydrogen-rich saline protectsagainst liver injury in rats with obstructive jaundice[J].LiverInternational,2010,30(7):958-968.)。其他研究人员发现富氢水通过清除过多的毒性ROS能够减轻大脑、小肠的因缺血再灌注导致的损伤，富氢水能够降低因电离辐射导致的细胞损伤，提高细胞的增殖活性{Kajiya M,Sato K,Silva M J B,et al.Hydrogen fromintestinal bacteria is protective for Concanavalin A-induced hepatitis,Biochemical and Biophysical Research Communications,2009,386(2):316-321.Buchholz B M,Kaczorowski D J,Sugimoto R,et al.Hydrogen InhalationAmeliorates Oxidative Stress in Transplantation Induced Intestinal GraftInjury,American Journal of Transplantation,2008,8(10):2015-2024.Zheng X,ZhengX,Mao Y,et al.Hydrogen-rich saline protects against intestinal ischemia/reperfusion injury in rats,Free Radical Research,2009,43(5):478-484.]Sun Q,Kang Z,Cai J,et al.Hydrogen-Rich Saline Protects Myocardium Against Ischemia/Reperfusion Injury in Rats,Experimental Biology and Medicine,2009,234(10):1212-1219.郑兴锋.富氢水对大鼠肠缺血再灌注损伤以及四氯化碳诱导的肝损伤的保护作用及其机制[D],第二军医大学,2010.申荣喜,氢生理盐水对大鼠放射性肝损伤的保护作用及机制研究[D],第二军医大学,2013.}。第二军医大学齐慧慧等人通过建立大鼠慢性酒精性肝损伤模型初步证实了富氢水能够减轻因乙醇诱导的大鼠肝脏损伤(齐慧慧，宋佳，陈岳祥，氢盐水对大鼠酒精性肝损伤的保护作用，世界华人消化杂志，2012)。但是到目前为止没有一篇文献报道有关富氢酒精饮品对于酒精性和非酒精性肝损伤的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富氢不伤肝酒精饮品及其制备方法和应用。本发明以酒精性和非酒精性脂肪肝为研究模型，探索富氢酒精饮品对于上述肝损伤的影响。
本发明的第一方面，提供富氢酒精饮品在制备不伤肝饮品中的应用，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
进一步优选的，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为1ppm。
进一步的，所述的酒精饮品包括啤酒、白酒、红酒、黄酒、威士忌、白兰地等包括酒精的饮品。
进一步的，所述的酒精饮品中酒精浓度为5％、15％、38％、53％。
进一步优选的，所述的酒精饮品中酒精浓度为38％，氢气的浓度为1ppm。
本发明的第二方面，提供富氢酒精饮品在制备防治脂肪肝患者进一步肝损伤的饮品中的应用，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
进一步的，所述的脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝。
本发明的第三方面，提供氢气在制备不伤肝酒精饮品中的应用，所述的酒精饮品是将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
进一步的，所述的不伤肝酒精饮品是防治脂肪肝患者进一步肝损伤的酒精饮品。
本发明的第四方面，提供一种不伤肝酒精饮品，所述的不伤肝酒精饮品是将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
进一步优选的，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为1ppm。
进一步的，所述的酒精饮品包括啤酒、白酒、红酒、黄酒、威士忌、白兰地等包括酒精的饮品。
进一步的，所述的酒精饮品中酒精浓度为5％、15％、38％、53％。
进一步优选的，所述的酒精饮品中酒精浓度为38％，氢气的浓度为1ppm。
进一步的，所述将氢气溶解在酒精饮品中可采用常压溶解和高压强溶解等方式。
进一步的，所述的不伤肝酒精饮品的制备方法为：首先将啤酒、白酒、红酒、黄酒、威士忌或白兰地等酒精饮品装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将酒精饮品连铝袋放在4℃冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的酒精饮品，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h以上。
进一步的，本发明还提供所述的不伤肝酒精饮品的大批量制备方法(可采用大批量酒精饮品加氢设备)，所述的制备方法包括以下步骤：提前1小时对罐体设备制冷至4℃，并抽真空，以0.1-1Mpa压强从罐体顶部喷出酒精饮品，从罐体两侧壁喷孔喷出氢气，形成最大接触面积；当酒精饮品液面达到一定高度时停止输入，并喷出高压氢气，等最大压强达到1.0Mpa时，停止输入氢气；低温保存6h左右；罐装前氢气传感器测定氢气浓度大于等于1ppm时，进行罐装。
本发明的第五方面，提供一种大批量酒精饮品加氢设备，包括：
罐体，所述罐体顶部设有酒精饮品高压输入管，所述酒精饮品高压输入管管口处安装有酒精饮品喷口阀门；
高压氢气输入管道，所述高压氢气输入管道安装在罐体两侧壁且伸入所述罐体，所述高压氢气输入管道上安装有气体阀门；
富氢酒精饮品排出管道，所述富氢酒精饮品排出管道安装在罐体侧壁且位于所述高压氢气输入管道的下方；
传感器系统，包括压力传感器、水位传感器、氢气浓度传感器和温度传感器，分别设置在罐体侧壁；
低温制冷模块，安装在罐体侧壁。
所述的高压酒精饮品喷口，和高压氢气喷口形成交叉接触，使得接触面积最大，促使酒精饮品中的氢气快速达到饱和；
所述的水位传感器，一旦酒精饮品的体积超过水位传感器，下方两侧高压氢气输入管道会自动输入氢气，一旦达到设定压强就会自动停止；
所述的低温制冷模块从开始就对设备预先制冷，直到整个制备结束，维持罐体内温度为4℃，用于促进酒精饮品快速和最大程度的饱和。
本发明优点在于：
本发明直接将将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，减轻乙醇引起的肝损伤，尤其是针对本来存在酒精性和非酒精性脂肪肝损伤的人群，富氢酒精饮品在氢气浓度1ppm时就可达到较好的防治酒精性和非酒精性脂肪肝患者的进一步肝损伤；这种保护作用对于38％(包括38％)以下酒精含量的饮品尤其明显，甚至能达到和饮用水一样的效果。
附图说明
图1.富氢酒精饮品对酒精性脂肪肝小鼠体重的变化情况(A)和第八周各组小鼠体重比较(B)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与AFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与AFLD+38％Alc相比)AFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与AFLD+38％Alc+RH相比)。
图2.富氢酒精饮品对酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与AFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与AFLD+38％Alc相比)AFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与AFLD+38％Alc+RH相比)。
图3.富氢酒精饮品对酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A)、AST(B)、SOD(C)和MDA(D)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与AFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与AFLD+38％Alc相比)AFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与AFLD+38％Alc+RH相比)。
图4.相同氢浓度的不同浓度酒精对酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与AFLD+HRW相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(分别与各图内AFLD+5％Alc、AFLD+15％Alc、AFLD+38％Alc、或AFLD+53％Alc相比)。
图5.相同氢浓度的不同浓度酒精对酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A-D)和AST(E-H)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与AFLD+HRW相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(分别与各图内AFLD+5％Alc、AFLD+15％Alc、AFLD+38％Alc、或AFLD+53％Alc相比)。
图6.不同氢浓度酒精溶液对酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+38％Alc+Vehicle相比)。
图7.不同氢浓度酒精溶液对酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A)和AST(B)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+38％Alc+Vehicle相比)。
图8.富氢酒精饮品对非酒精性脂肪肝小鼠体重的变化情况(A)和第十四周各组小鼠体重比较(B)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与NAFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与NAFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与NAFLD+38％Alc相比)NAFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与NAFLD+38％Alc+RH相比)。
图9.富氢酒精饮品对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与NAFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与NAFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与NAFLD+38％Alc相比)NAFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与NAFLD+38％Alc+RH相比)。
图10.富氢酒精饮品对非酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标水平的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A)、AST(B)、SOD(C)和MDA(D)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与Control相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与NAFLD相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(与NAFLD+Vehicle相比),^p<0.05,^^p<0.01,^^^p<0.001(与NAFLD+38％Alc相比)NAFLD,@p<0.05,@@p<0.01,@@@p<0.001(与NAFLD+38％Alc+R相比)。
图11.相同氢浓度的不同浓度酒精对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与NAFLD+Vehicle相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与NAFLD+HRW相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(分别与各图内NAFLD+5％Alc、NAFLD+15％Alc、NAFLD+38％Alc、或NAFLD+53％Alc相比)。
图12.相同氢浓度的不同浓度酒精对非酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标水平的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A-D)和AST(E-H)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+Vehicle相比),#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001(与NAFLD+HRW相比),&p<0.05,&&p<0.01,&&&p<0.001(分别与各图内NAFLD+5％Alc、NAFLD+15％Alc、NAFLD+38％Alc、或NAFLD+53％Alc相比)。
图13.不同氢浓度酒精溶液对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症病理评分影响。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+38％Alc+Vehicle相比)。
图14.不同氢浓度酒精溶液对非酒精性脂肪肝小鼠肝功能相关生化指标的影响。测定的生化指标包括肝脏ALT(A)和AST(B)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001(与AFLD+38％Alc+Vehicle相比)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：制备富氢黄酒
首先将需要制备的黄酒装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将黄酒连铝袋放在4度冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的黄酒，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h甚至更长。
实施例2：制备富氢啤酒
首先将需要制备的啤酒装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将啤酒连铝袋放在4度冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的啤酒，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h甚至更长。
实施例3：制备富氢白酒
首先将需要制备的白酒装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将白酒连铝袋放在4度冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的白酒，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h甚至更长。
实施例4：制备富氢威士忌
首先将需要制备的威士忌装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将威士忌连铝袋放在4度冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的威士忌，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h甚至更长。
实施例5：制备富氢饮用水
首先将需要制备的饮用水装入铝袋中，减压脱气，抽出气体。将饮用水连铝袋放在4度冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的饮用水，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h甚至更长。
实施例6：大批量含氢酒精饮品制备
提前1小时对设备制冷至4度，并抽真空，以0.1-1Mpa压强从顶部喷出酒精饮品，从上面两侧喷孔喷出氢气，形成最大接触面积。当酒精饮品液面达到一定高度时水位传感器报警，停止输入酒精饮品，并喷出高压氢气，等最大压强达到1.0Mpa时，停止输入氢气。低温保存6h左右。罐装前氢气传感器测定氢气浓度大于等于1ppm时，进行罐装。
实施例7：富氢不伤肝酒精饮品的酒精性脂肪肝动物实验研究
(1)实验方法
实验一：富氢不伤肝酒精饮品对酒精性脂肪肝的作用
采取随机分组的方法将小鼠分为5组，分别为对照组(Control)、酒精性脂肪肝模型组(Alcoholic fatty liver disease，AFLD)、酒精性脂肪肝+溶剂对照组(AFLD+溶剂对照(饮用水)，AFLD+Vehicle)及酒精性脂肪肝+38％酒精溶液组)组(AFLD+38％Alcohol，AFLD+38％Alc)酒精性脂肪肝+富氢38％酒精溶液(38度)组(AFLD+38％Alcohol+richhydrogen，AFLD+38％Alc+RH)，氢气浓度2ppm，酒精性脂肪肝+富氢饮用水组(AFLD+hydrogen rich water，AFLD+HRW)，氢气浓度2ppm。适应性饲养3天后，AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH、AFLD+RH各组自由饮食标准型Lieber-De Carli酒精液体饲料(配方见表1)14天(每天下午7点-19点之间清洁液体喂养瓶，并更换液体饲料)；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃31.5％(vol/vol)的酒精溶液；Control组小鼠自由饮食标准型相应的对照液体饲料14天(每天下午7点-19点之间清洁液体喂养瓶，并更换液体饲料)；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃0.45g/ml的糊精溶液。灌胃9小时后，AFLD和Control组小鼠眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。其余各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，白酒，富氢白酒，富氢饮用水，每天一次，连续6周，正常饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
表1.Lieber-DeCarli酒精液体饲料和相应的对照液体饲料配方
Figure BDA0002825384770000081
实验二：相同氢浓度的不同浓度酒精对酒精性脂肪肝的作用
采取随机分组的方法将小鼠分为9组，分别为酒精性脂肪肝+溶剂对照组[AFLD+溶剂对照(饮用水)，AFLD+Vehicle]；酒精性脂肪肝+5％酒精溶液组(模拟啤酒度数5度，AFLD+5％Alcohol，AFLD+5％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢5％酒精溶液组(AFLD+5％Alcohol+richhydrogen，AFLD+5％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+15％酒精溶液组(模拟黄酒度数15度，AFLD+15％Alcohol，AFLD+15％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢15％酒精溶液组(AFLD+15％Alcohol+rich hydrogen，AFLD+15％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+38％酒精溶液组(模拟低度白酒度数38度，AFLD+38％Alcohol，AFLD+38％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢38％酒精溶液组(AFLD+38％Alcohol+rich hydrogen，AFLD+38％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+53％酒精溶液组(模拟高度白酒度数53度，AFLD+53％Alcohol，AFLD+53％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢53％酒精溶液组(AFLD+53％Alcohol+rich hydrogen，AFLD+53％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+富氢饮用水组(AFLD+hydrogen rich water，AFLD+HRW)。适应性饲养3天后，各组自由饮食标准型Lieber-De Carli酒精液体饲料14天(每天下午7点-19点之间清洁液体喂养瓶，并更换液体饲料)；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃31.5％(vol/vol)的酒精溶液)；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃0.45g/ml的糊精溶液。灌胃9小时后，各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，不同浓度酒精溶液，富氢不同浓度酒精溶液，富氢水(富氢不同浓度酒精溶液和富氢水中氢气浓度调整到2ppm)，每天一次，连续6周，正常饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
实验三：不同氢浓度酒精对酒精性脂肪肝的作用
采用氧化还原滴定法测定酒精中氢气浓度，调定氢气浓度分别为：0.25ppm，0.5ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm。
采取随机分组的方法将小鼠分为5组，分别为酒精性脂肪肝+溶剂对照组(AFLD+溶剂对照(饮用水)，AFLD+Vehicle)及酒精性脂肪肝+不同富氢酒精溶液(38度，模拟白酒度数)组(酒精溶液压入尽量多的氢气后，调整氢气浓度分别为0.25ppm，0.5ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm HRW)。适应性饲养3天后，各组自由饮食标准型Lieber-De Carli酒精液体饲料14天(每天下午7点-19点之间清洁液体喂养瓶，并更换液体饲料)；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃31.5％(vol/vol)的酒精溶液；最后一次喂养隔夜正常饮食条件下，以1.5ml/100g的剂量灌胃0.45g/ml的糊精溶液。灌胃9小时后，各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，和不同富氢浓度酒精溶液，每天一次，连续6周，正常饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
(2)统计分析
采用GraphPad Prism8软件进行分析，数据结果以均值±标准差(SD)的形式展现，多组数据比较采用ANOVA分析，两小组之间的显著性比较使用Tukey进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。
(3)实验结果
①富氢酒精饮品对酒精性脂肪肝的作用
各组小鼠在开始实验时体重没有明显差异(图1A)，在实验结束时，AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH、AFLD+RH组小鼠体重均高于Control组；AFLD和AFLD+Vehicle组小鼠体重均高于AFLD+38％Alc组；AFLD+38％Alc+RH组小鼠的体重高于AFLD+38％Alc组，低于Control和AFLD+HRW组，与AFLD、AFLD+Vehicle组没有明显差异(图1B)。
AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH、AFLD+HRW组小鼠肝脏炎症病理评分均高于Control组；AFLD和AFLD+Vehicle组小鼠肝脏炎症病理评分均低于AFLD+38％Alc组，高于AFLD+HRW组；AFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏炎症病理评分低于AFLD+38％Alc组，高于Control和AFLD+HRW组，与AFLD、AFLD+Vehicle组没有明显差异(图2)。
AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均高于Control组；AFLD和AFLD+Vehicle组小鼠血清ALT和AST水平均低于AFLD+38％Alc组，高于AFLD+HRW组；AFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平低于AFLD+38％Alc组，高于Control和AFLD+HRW组，与AFLD、AFLD+Vehicle组没有明显差异，AFLD+HRW组小鼠血清ALT和AST水平与Control组没有明显差异(图3A，B)。
AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH、AFLD+HRW组小鼠肝脏SOD水平均低于Control组；AFLD和AFLD+Vehicle组小鼠肝脏SOD水平均高于AFLD+38％Alc组，低于AFLD+HRW组；AFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏SOD水平高于AFLD+38％Alc组，低于Control和AFLD+HRW组，与AFLD、AFLD+Vehicle组没有明显差异(图3C)。
AFLD、AFLD+Vehicle、AFLD+38％Alc、AFLD+38％Alc+RH、AFLD+HRW组小鼠肝脏MDA水平均高于Control组；AFLD和AFLD+Vehicle组小鼠肝脏MDA水平均低于AFLD+38％Alc组，高于AFLD+HRW组；AFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏MDA水平低于AFLD+38％Alc组，高于Control和AFLD+HRW组，与AFLD、AFLD+Vehicle组没有明显差异(图3D)。
②相同氢浓度的不同浓度酒精对酒精性脂肪肝的作用
AFLD+5％Alc、AFLD+15％Alc、AFLD+38％Alc、AFLD+53％Alc组小鼠肝脏炎症病理评分均高于AFLD+Vehicle组；AFLD+5％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于AFLD+5％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+15％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于AFLD+15％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+38％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于AFLD+38％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+53％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于AFLD+53％Alc组，高于AFLD+Vehicle组(图4)。
AFLD+5％Alc、AFLD+15％Alc、AFLD+38％Alc、AFLD+53％Alc组小鼠血清ALT和AST水平均高于AFLD+Vehicle组；AFLD+5％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于AFLD+5％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+15％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于AFLD+15％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于AFLD+38％Alc组，与AFLD+Vehicle组没有明显差异；AFLD+53％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于AFLD+53％Alc组，高于AFLD+Vehicle组(图5)。
③不同氢浓度酒精溶液对酒精性脂肪肝的作用
AFLD+38％Alc+2ppmRH、AFLD+38％Alc+1.5ppmRH、AFLD+38％Alc+1ppm RH组小鼠肝脏炎症病理评分均低于AFLD+38％Alc+Vehicle组(图6)；AFLD+38％Alc+2ppmRH、AFLD+38％Alc+1.5ppmRH、AFLD+38％Alc+1ppm RH组小鼠血清ALT和AST水平均低于AFLD+38％Alc+Vehicle组(图7)。
综上所述，富氢酒精饮品在氢气浓度1ppm时就可达到较好的防治酒精性脂肪肝患者的进一步肝损伤；这种保护作用对于酒精含量38％(包括38％)以下的饮品尤其明显，甚至能达到和饮用水一样的效果。
实施例8：富氢不伤肝酒精饮品的非酒精性脂肪肝动物实验研究
(1)实验方法
实验一：富氢酒精饮品对非酒精性脂肪肝的作用
采取随机分组的方法将小鼠分为5组，分别为对照组(Control)、非酒精性脂肪肝模型组(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、非酒精性脂肪肝+溶剂对照组[NAFLD+溶剂对照(饮用水)，NAFLD+Vehicle]，非酒精性脂肪肝+38％酒精溶液(38度)组(NAFLD+38％Alcohol，NAFLD+38％Alc)，非酒精性脂肪肝+富氢38％酒精溶液(38度)组(NAFLD+38％Alcohol+rich hydrogen，NAFLD+38％Alc+RH)，氢气浓度2ppm，非酒精性脂肪肝+富氢饮用水组(NAFLD++hydrogen rich water，NAFLD+HRW)，氢气浓度2ppm。适应性饲养3天后，NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH、NAFLD+HRW各组自由进食高脂饲料(60％的卡路里来自脂肪)。Control各组自由进食正常鼠类饲料，实验总时长14周。Control和NAFLD组在第8周结束后，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。其余各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，白酒，富氢白酒，富氢饮用水，每天一次，连续6周，高脂饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
实验二：含氢不同浓度酒精对非酒精性脂肪肝的作用
氢气浓度为2ppm。采取随机分组的方法将小鼠分为9组，分别为酒精性脂肪肝+溶剂对照组[NAFLD+溶剂对照(饮用水)，NAFLD+Vehicle]；酒精性脂肪肝+5％酒精溶液组(模拟啤酒度数-5度，NAFLD+5％Alcohol，NAFLD+5％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢5％酒精溶液组(NAFLD+5％Alcohol+rich hydrogen，NAFLD+5％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+15％酒精溶液组(模拟黄酒度数-15度，NAFLD+15％Alcohol，NAFLD+15％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢15％酒精溶液组(NAFLD+15％Alcohol+rich hydrogen，NAFLD+15％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+38％酒精溶液组(模拟低度白酒度数-38度，NAFLD+38％Alcohol，NAFLD+38％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢38％酒精溶液组(NAFLD+38％Alcohol+rich hydrogen，NAFLD+38％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+53％酒精溶液组(模拟高度白酒度数-53度，NAFLD+53％Alcohol，NAFLD+53％Alc)及酒精性脂肪肝+富氢53％酒精溶液组(NAFLD+53％Alcohol+rich hydrogen，NAFLD+53％Alc+RH)；酒精性脂肪肝+富氢饮用水组(NAFLD+hydrogen rich water，NAFLD+HRW)。适应性饲养3天后，各组自由进食高脂饲料(60％的卡路里来自脂肪)。第8周结束后，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。其余各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，酒精溶液，富氢酒精溶液，富氢饮用水(富氢不同浓度酒精溶液和富氢水中氢气浓度调整到2ppm)，每天一次，连续6周，高脂饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
实验三：不同氢浓度酒精对非酒精性脂肪肝的作用
采用氧化还原滴定法测定酒精中氢气浓度，调定氢气浓度分别为：0.25ppm，0.5ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm。
采取随机分组的方法将小鼠分为5组，分别为非酒精性脂肪肝+溶剂对照组[NAFLD+溶剂对照(饮用水)，AFLD+Vehicle]及非酒精性脂肪肝+不同富氢酒精饮料(38度，模拟白酒度数)组(氢气浓度分别为0.25ppm，0.5ppm，1ppm，1.5ppm，2ppm)。适应性饲养3天后,各组自由进食高脂饲料(60％的卡路里来自脂肪)。第8周结束后，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。其余各组分别按照10ml/kg灌胃饮用水，酒精溶液，富氢酒精溶液，富氢饮用水，每天一次，连续6周，高脂饲料饲养，眼球取血，静置离心后进行血清检测；处死小鼠，收集肝脏标本。
(2)统计分析
采用GraphPad Prism8软件进行分析，数据结果以均值±标准差(SD)的形式展现，多组数据比较采用ANOVA分析，两小组之间的显著性比较使用Tukey进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。
(3)实验结果
①富氢不伤肝酒精饮品对非酒精性脂肪肝的作用
各组小鼠在开始实验时体重没有明显差异(图8A)，在实验结束时，NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH、NAFLD+HRW组小鼠体重均高于Control组；NAFLD和NAFLD+Vehicle组小鼠体重均高于NAFLD+38％Alc组，低于NAFLD+HRW组；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠的体重高于NAFLD+38％Alc组，低于Control，NAFLD+HRW组，与NAFLD、NAFLD+Vehicle组没有明显差异(图8B)。
NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH、NAFLD+HRW组小鼠肝脏炎症病理评分均高于Control组；NAFLD和NAFLD+Vehicle组小鼠肝脏炎症病理评分均低于NAFLD+38％Alc组，高于NAFLD+HRW组；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏炎症病理评分低于NAFLD+38％Alc组，高于Control和NAFLD+HRW组，与NAFLD、NAFLD+Vehicle组没有明显差异(图9)。
NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均高于Control组；NAFLD和NAFLD+Vehicle组小鼠血清ALT和AST水平均低于NAFLD+38％Alc组，高于NAFLD+HRW组；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平低于NAFLD+38％Alc组，高于Control和NAFLD+RH组，与NAFLD、NAFLD+Vehicle组没有明显差异，NAFLD+HRW组小鼠血清ALT和AST水平与Control组没有明显差异(图10A,B)。
NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH、NAFLD+HRW组小鼠肝脏SOD水平均低于Control组；NAFLD和NAFLD+Vehicle组小鼠肝脏SOD水平均高于NAFLD+38％Alc组，高于NAFLD+HRW组；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏SOD水平高于NAFLD+38％Alc组，低于Control和NAFLD+HRW组，与NAFLD、NAFLD+Vehicle组没有明显差异(图10C)。
NAFLD、NAFLD+Vehicle、NAFLD+38％Alc、NAFLD+38％Alc+RH、NAFLD+HRW组小鼠肝脏MDA水平均高于Control组；NAFLD和NAFLD+Vehicle组小鼠肝脏MDA水平均低于NAFLD+38％Alc组，高于NAFLD+HRW组；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠的肝脏MDA水平低于NAFLD+38％Alc组，高于Control和NAFLD+HRW组，与NAFLD、NAFLD+Vehicle组没有明显差异(图10D)。
②含氢不同浓度酒精对非酒精性脂肪肝的作用
NAFLD+5％Alc、NAFLD+15％Alc、NAFLD+38％Alc、NAFLD+53％Alc组小鼠肝脏炎症病理评分均高于VAFLD+Vehicle组；NAFLD+5％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于NAFLD+5％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+15％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于NAFLD+15％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于NAFLD+38％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+53％Alc+RH组小鼠肝脏炎症病理评分均小于NAFLD+53％Alc组，高于NAFLD+Vehicle组(图11)。
NAFLD+5％Alc、NAFLD+15％Alc、NAFLD+38％Alc、NAFLD+53％Alc组小鼠血清ALT和AST水平均高于NAFLD+Vehicle组；NAFLD+5％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于NAFLD+5％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+15％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于NAFLD+15％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+38％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于AFLD+38％Alc组，与NAFLD+Vehicle组没有明显差异；NAFLD+53％Alc+RH组小鼠血清ALT和AST水平均小于NAFLD+53％Alc组，高于NAFLD+Vehicle组(图12)。
③不同氢浓度酒精对非酒精性脂肪肝的作用
NAFLD+38％Alc+2ppmRH、NAFLD+38％Alc+1.5ppmRH、NAFLD+38％Alc+1ppmRH组小鼠肝脏炎症病理评分均低于NAFLD+Vehicle组(图13)；NAFLD+38％Alc+2ppmRH、NAFLD+38％Alc+1.5ppmRH、NAFLD+38％Alc+1ppmRH组小鼠血清ALT和AST水平均低于NAFLD+Vehicle组(图14)。
综述所述，富氢酒精饮品在氢气浓度1ppm时就可达到较好的防治非酒精性脂肪肝患者的进一步肝损伤；这种保护作用对于酒精含量38％(包括38％)以下的饮品尤其明显，甚至能达到和饮用水一样的效果。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.富氢酒精饮品在制备不伤肝饮品中的应用，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为1ppm；所述的酒精饮品包括但不限于啤酒、白酒、红酒、黄酒、威士忌、白兰地。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的酒精饮品中酒精浓度为5％、15％、38％、53％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的酒精饮品中酒精浓度为38％，氢气的浓度为1ppm。
5.富氢酒精饮品在制备防治脂肪肝患者进一步肝损伤的饮品中的应用，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的脂肪肝为酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝。
7.氢气在制备不伤肝酒精饮品中的应用，所述的酒精饮品是将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
8.一种不伤肝酒精饮品，其特征在于，所述的不伤肝酒精饮品是将氢气溶解在酒精饮品中形成富氢酒精饮品，所述的富氢酒精饮品中氢气的浓度为0.25-20ppm。
9.根据权利要求8所述的不伤肝酒精饮品，其特征在于，所述的不伤肝酒精饮品的制备方法为：首先将酒精饮品装入铝袋中，减压脱气，抽出气体；将酒精饮品连铝袋放在4℃冰箱预先冷却1-2h后，抽出20％的酒精饮品，充入氢气，在0.4Mpa大气压下助溶26h以上。
10.根据权利要求8所述的不伤肝酒精饮品，其特征在于，所述的不伤肝酒精饮品的大批量制备方法包括以下步骤：提前1小时罐体设备4℃制冷，并抽真空，以0.1-1Mpa压强从罐体顶部喷出酒精饮品，从罐体两侧壁喷孔喷出氢气，形成最大接触面积；当酒精饮品液面达到一定高度时停止输入，并喷出高压氢气，等最大压强达到1.0Mpa时，停止输入氢气；低温保存6h左右；罐装前氢气传感器测定氢气浓度大于等于1ppm时，进行罐装。
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