CN112675218A - 一种复方胆膏注射液、制备方法及有效成分含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方胆膏注射液、制备方法及有效成分含量测定方法；所述注射液包括如下重量百分比的原料：胆膏1.0‑2.5％，黄芩提取物0.5‑2.0％，连翘提取物0.5‑1.5％，稳定剂0.1‑0.5％，余量为注射水；所述稳定剂由椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成。本方法制备的复方胆膏注射液用磷酸二氢钠调节pH于6.5‑7.0之间，更接近于动物体液PH值，接近等渗，刺激性小，与粉针联用，不产生沉淀，刺激性小；再加入了稳定剂，稳定性更好，能够延长保质期和药效。再利用高效液相色谱联用蒸发光检测器同时测定复方胆膏注射液五种成分的含量，不仅具有检测时间短、效率高、费用低、操作简单的优点，还能提高检测结果的准确度和灵敏性，使产品质量更加可控。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域，具体是一种复方胆膏注射液、制备方法及有效成分含量测定方法。
背景技术
目前在我国养殖业中，家畜家禽热性病时有发生，其症见：风热感冒、肺热咳嗽、热痢、粪便燥结、高热烦渴等。热性病在家畜家禽中发病率和病死率较高，可经过消化道、呼吸道、破损粘膜等途径传播，如不能及时控制将迅速在群体中扩散，给养殖业造成严重损失。现有技术中治疗热性病有中兽药、西药和中西药结合方法。
如专利201610276370.7公开了一种复方胆膏注射液及其制备方法，所述复方胆膏注射液，包括以下重量份的原料：胆膏1.5-2.5％，黄芩提取物1.5-2.0％，连翘提取物1.0-1.5％。其制备方法为：(1)原料溶解：取胆膏15-25g加200-800mL注射用水溶解，加入黄芩提取物15-20g，其后加入氢氧化钠溶液，搅拌使黄芩提取物溶解，再加入连翘提取物10-15g，搅拌使连翘提取物溶解；(2)定容：加注射用水定容至1000mL，调节pH为7.0-9.0；(3)成品：加药用炭，过滤，灌封，灭菌，即得复方胆膏注射液。发明人在研究和使用过程中发现，该复方胆膏注射液节pH为7.0-9.0(偏碱性)，与市面上常用的粉针抗菌药如注射用阿莫西林钠、注射用头孢噻呋钠联用(兽医临床常用复方胆膏注射液溶解上述粉针，然后肌肉注射给药，中西结合、标本兼治)，易出现配伍禁忌(主要表现浑浊、生成沉淀)，影响联合用药。同时，由于碱性较大(pH为7.0-9.0)，肌肉注射对局部注射部位的刺激性大，动物的应激大，影响动物福利，亦会影响疗效。
所述胆膏注射液由猪胆膏、黄芩提取物、连翘提取物三味中药制成，所述五种有效成分分别为胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷和连翘苷。当前对复方胆膏注射液的质量品控方法为：胆膏、黄芩提取物有效成分用HPLC分开检测，操作繁琐，质量不易控制；对连翘进行薄层鉴别，没有制订含量测定方法和含量限度，不易质控连翘苷。因此，当前有必要提供一种更加简单、省时省力，能够同时对五种成分进行含量测定，质量更可控，精准度更高的检测方法。
发明内容
本发明针对现有复方胆膏射液及其有效成分检测存在的不足，提供一种复方胆膏注射液、制备方法及有效成分含量测定方法。本方法制备的复方胆膏注射液用磷酸二氢钠将pH控制在6.5-7.0之间，更接近于动物体液PH值，接近等渗，刺激性小，与粉针联用，不产生沉淀，刺激性小；再加入了稳定剂，稳定性更好，能够延长保质期和药效。再利用高效液相色谱联用蒸发光检测器同时测定复方胆膏注射液五种成分的含量，不仅具有检测时间短、效率高、费用低、操作简单的优点，还能提高检测结果的准确度和灵敏性，使产品质量更加可控。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种复方胆膏注射液，包括如下重量百分比的原料：胆膏1.0-2.5％，黄芩提取物0.5-2.0％，连翘提取物0.5-1.5％，稳定剂0.1-0.5％，余量为注射水；所述稳定剂由椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成。
优选地，所述稳定剂中椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚的质量比为1-2∶3-5∶1-3。
优选地，所述胆膏为猪胆膏，为采用中国专利201310153520.1的方法纯化后的猪胆膏。
所述黄芩提取物和连翘提取物分别是市售产品，符合中国药典2015版一部标准。
本发明还提供复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取胆膏10-25g加入200-800mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物5-20g，加入氢氧化钠溶液，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物5-15g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂1-5g，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.5-7.0之间；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.1-0.5％的药用炭，经过滤，灌封，灭菌，即得复方胆膏注射液。
优选地，所述氢氧化钠浓度为5-10％，用量为15-25mL。
优选地，所述灭菌为流通蒸汽灭菌法，在温度100℃下灭菌30-45min。
本发明的另一目的：提供一种复方胆膏注射液有效成分含量测定方法，所述复方胆膏注射液中胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷和连翘苷五种有效成分的含量是采用高效液相色谱联用蒸发光检测器同时测定；具体的操作包括如下步骤：
(1)确定色谱条件：
所选的柱温：30℃；
所选的流动相由A相乙腈-甲醇(70∶30)，B相0.1％冰乙酸水溶液组成；
流速为1mL/min，进样量10μL；
蒸发光检测器：漂移管温度105℃，空气载气量2.8L/min；
梯度洗脱时间及流动相比例如下表所示：
(2)标准溶液的配制：
S1：配制猪去氧胆酸标准品溶液、鹅去氧酸标准品溶液、胆酸标准品溶液、黄芩苷标准品溶液、连翘苷标准品溶液；
S2：配制一定浓度的混合标准品溶液，称取适量的胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷以及连翘苷标准品置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得；
S3：精密吸取复方胆膏注射液5mL，50mL具塞锥形瓶中，加15mL氢氧化钠乙醇溶液，称重，加热回流1h，称重，甲醇补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)确定蒸发光检测器漂移管温度、载气量以及各标准物质的出峰时间：
A：控制载气量，调整漂移管温度，以基线平整无杂峰干扰以及气体正常排出且不在漂移管内冷凝蓄积为指标筛选载气量与漂移管温度参数，最终确定蒸发光检测器空气载气量为2.8L/min，漂移管温度为105℃。
B：按所述色谱条件进样混合标准品10uL，确定各标定物质之间色谱峰保留时间无干扰且具有较好的分离度。
C：按所述色谱条件分别进样胆酸标准品溶液、猪去氧胆酸标准品溶液、鹅去氧胆酸标准品溶液、连翘苷标准品溶液、黄芩苷标准品溶液各10uL，确定各单一标准物质的保留时间。
D：按上述色谱条件进样供试品溶液10uL，确定供试品中各成分之间有较好的分离度且相互无干扰，最终确定胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷和连翘苷等成分的保留时间。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明在复方胆膏注射液制备中加入椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成的稳定剂，能够提高注射液的稳定性，使其长期保存不产生沉淀；用磷酸二氢钠将pH控制在6.5-7.0之间，更接近于动物体液PH值，接近等渗，刺激性小，与粉针联用，不产生沉淀，刺激性小，能够增强药效。
2、本发明采用利用高效液相色谱联用蒸发光检测器同时测定复方胆膏注射液四种成分的含量，不仅具有检测时间短、效率高、费用低、操作简单的优点，还能提高检测结果的准确度和灵敏性，使产品质量更加可控。
附图说明
图1为胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、连翘苷、黄芩苷标准曲线图；
图2为胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、连翘苷、黄芩苷混合标准品色谱图；
图3为复方胆膏注射液供试品色谱图；
图4为连翘苷色谱图；
图5为黄芩苷色谱图；
图6为胆酸色谱图；
图7为猪去氧胆酸色谱图；
图8为鹅去氧胆酸色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
实施例1
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏22g加入600mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物17g，加入浓度为10％的氢氧化钠溶液20mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物13g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂3g，所述稳定剂由质量比为2∶4∶1的椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.8；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.3％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌40min，即得复方胆膏注射液。
实施例2
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏12g加入400mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物8g，加入浓度为8％的氢氧化钠溶液25mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物10g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂4.2g，所述稳定剂由质量比为1∶3∶2的椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.5；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.2％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌30min，即得复方胆膏注射液。
实施例3
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏15g加入200mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物10g，加入浓度为10％的氢氧化钠溶液25mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物15g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂2.0g，所述稳定剂由质量比为2∶2∶1的椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至7.0；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.1％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌45min，即得复方胆膏注射液。
实施例4
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏25g加入800mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物8g，加入浓度为10％的氢氧化钠溶液15mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物12g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂5.0g，所述稳定剂由质量比为1∶5∶3的椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.8；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.3％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌45min，即得复方胆膏注射液。
对比例1
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏22g加入600mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物17g，加入浓度为10％的氢氧化钠溶液20mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物13g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.8；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.3％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌40min，即得复方胆膏注射液。
对比例2
一种复方胆膏注射液的制备方法，包括如下步骤：
(1)取猪胆膏22g加入600mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物17g，加入浓度为10％的氢氧化钠溶液20mL，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物13g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂3g，所述稳定剂由质量比为2∶4∶1的椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至9.0；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.3％的药用炭，经过滤，灌封，在温度100℃下灭菌40min，即得复方胆膏注射液。
注射液稳定性试验
参照《中华人民共和国兽药典》2015年版一部“兽药稳定性试验指导原则”技术指导原则的要求，拟定了注射液的质量考察项目，考察复方胆膏注射液在强光照射、加速试验和长期试验的稳定性。其中长期试验结果如下所示：
(1)长期稳定性试验：
3个批次的复方胆膏注射液样品进行了长期稳定性试验，试验结果详见表4-3。试验目前共进行了11个月，根据长期稳定性试验9个月时的检测数据分析，长期稳定性试验进行到9个月时，中试样品的性状、鉴别、可见异物、有关物质、无菌等考察项目均在拟制订复方胆膏注射液质量标准要求范围内；样品的pH值略有下降；主要有效成分连翘苷、黄芩苷、胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量均有所下降，连翘苷下降了1.35％～1.38％，黄芩苷下降了0.545％～0.95％，胆酸下降了0.65％～0.85％，猪去氧胆酸下降了0.64％～0.91％，鹅去氧胆酸下降了0.79％～1.13％。但仍在拟制定的复方胆膏注射液质量标准要求范围内。综合上述稳定性数据，结果表明复方胆膏注射液在温度长期试验条件下(25±2℃、相对湿度60±10％)，至少可保持9个月的稳定性。
表1复方胆膏注射液长期稳定性试验结果
PH对药效的影响试验
该复方胆膏注射液原pH为7.0-9.0(偏碱性)，与市面上常用的粉针抗菌药如注射用阿莫西林钠、注射用头孢噻呋钠联用(兽医临床常用复方胆膏注射液溶解上述粉针，然后肌肉注射给药，中西结合、标本兼治)，易出现配伍禁忌(主要表现浑浊、生成沉淀)，影响联合用药。同时，由于碱性较大(pH为7.0-9.0)，肌肉注射对局部注射部位的刺激性大，动物的应激大，影响动物福利，亦会影响疗效。本方法制备的复方胆膏注射液用磷酸二氢钠将pH控制在6.5-7.0之间，更接近于动物体液PH值，接近等渗，刺激性小，与粉针联用，不产生沉淀，刺激性小；再加入了稳定剂，稳定性更好，能够延长保质期和药效。
复方胆膏注射液联合阿莫西林钠溶液对家兔肌肉刺激性试验结果显示对照组(0.9％氯化钠注射液)吸收完全，无残留迹象。剖检对比对照组与试验组(注射复方胆膏注射液与阿莫西林钠的混合溶液)家兔左侧股四头肌，发现两者左侧股四头肌无明显差异；复方胆膏注射液与阿莫西林钠的混合溶液对肌肉刺激小且吸收良好。具体试验实施步骤如下：
1.材料
药物：复方胆膏注射液(按实施例1制得)、注射液用阿莫西林钠、0.9％氯化钠注射液；
动物：新西兰大白兔；
器材：1mL一次性注射器、手术剪、镊子、酒精棉球；
试验条件：单笼饲养，自由饮水、摄食，饲料为全价颗粒营养饲料，动物房温度为22至24℃，相对湿度为40％～70％，自由通风，自然采光。
2.方法
操作步骤：
家兔共分两组，每组3只。一组为对照组注射0.9％氯化钠注射液，一组为试验组。
第一组为对照组：在家兔左侧股四头肌内以无菌操作按0.25mL/kg注射0.9％氯化钠注射液，48h后处死动物，通过无菌操作剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。
第二组为试验组：在家兔左侧股四头肌内以无菌操作按0.25mL/kg注射复方胆膏注射液联合阿莫西林钠混合注射液，48h后处死动物，通过无菌操作剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。
注射部位肌肉的刺激反应，按表计算相应的反应级，并进行局部组织病理学检查。
表2家兔左侧股四头肌刺激反应分级标准
表3家兔给药剂量及结果
复方胆膏注射液治疗猪热结症的临床疗效试验
目的验证复方胆膏注射液对猪热结症的临床疗效
方法采用自然发病猪作为试验对象，试验药物设高、中、低三个剂量组，并以大承气散作为对照药物进行疗效对比试验。
结果复方胆膏注射液高、中、低剂量组对猪热结症的治愈率分别为72.5％、62.5％、45％，总有效率分别为92.5％、85.0％、65.0％；大承气散的治愈率为52.5％，总有效率为77.5％。统计学分析结果比较，复方胆膏注射液高、中、低剂量组、大承气散对照组与阳性对照组比较，其治愈率、总有效率差异均具有极显著意义；复方胆膏注射液高、中、低剂量组与大承气散对照组比较，其治愈率、总有效率差均无显著意义。
结论复方胆膏注射液对猪热结症的有良好的疗效且与大承气散相当，而推荐剂量的疗效上优于大承气散。
1.材料与方法
1.1药品
试验药物：复方胆膏注射液，规格：10ml/支(每1ml相当于生药0.5g)按照本发明实施案例1制备；对照药物：大承气散(《中华人民共和国兽药典》二零一五版二部收载)，处方：大黄60g、厚朴30g，枳实30g、玄明粉180g，功能：攻下热结，破结通肠。主治：结症，便秘。
1.2试验动物：选择自然发生热结症的母猪200头为试验猪。品种：大约克×长白二元杂；体重150kg左右；年龄：1～2岁。
1.3热结症诊断标准
(1)症状：拱腰努责，粪便硬结，排便困难或完全不能排便，口津粘，舌红苔黄燥，口渴贪饮、结膜潮红，鼻盘干燥。
(2)诊断：具备(1)条件者，即可确诊。
(3)纳入标准：符合(2)的非传染病母猪。
1.4饲养条件：固定栏猪舍，定时自由采食，自由饮水，饲料由该养殖场饲料车间另行配制的不含任何药物的全价大猪饲料。
1.5动物分组、投药剂量及给药方式：将符合纳入标准列入临床研究的病例，采用完全随机方法设立5个组，每组均为40头，其中3个复方胆膏注射液剂量组，1个药物对照组，1个阳性对照组，即：
(1)高剂量组：每一次量，每一头，肌内注射复方胆膏注射液20ml，每天2次；
(2)中剂量组：每一次量，每一头，肌内注射复方胆膏注射液10ml，每天2次；
(3)低剂量组：每一次量，每一头，肌内注射复方胆膏注射液5ml，每天2次；
(4)药物对照组：每一次量，每一头，口服大承气散100g，每天2次；
(5)阳性对照组：发病不给药。
每一个治疗组的动物给药1～6次为一个疗程，在这一疗程中，病症消除即停止给药，病症未消除者继续给药，给药满6次则根据第6次给药12小时后的情况做疗效判断。
1.6.试验动物安全性试验：另选用5头健康猪进行安全性试验，肌内注射复方胆膏注射液试验中剂量的5倍量即：一次量，50ml/头，1日两次，连用三天，观察将康动物对受试药物的反应情况。
1.7.临床观察：仔细观察和记录各组猪的注射部位的刺激症状，临床症状，特别是粪便性状。第一次给药后连续观察4天。
1.8.疗效判断标准
(1)治愈治疗后患猪精神、食欲恢复正常，口渴贪饮、结膜潮红等热证体征消失，粪便质地正常。根据治愈数所占该组总数比例计算治愈率。
(2)有效治疗后患猪精神、食欲恢复正常，口渴贪饮、结膜潮红等热证体征减轻，粪便质地有所软化。根据治愈数和有效总数所占该组总数比例计算总有效率。
(3)无效治疗后患猪精神、食欲恢复正常，口渴贪饮、结膜潮红等热证没有体征减轻甚至加重或者死亡。根据无效数所占该组总数的比例计算无效率。
1.9数据处理和分析：用生物统计学(卡方检验)进行数据的差异性检验。
2.结果：复发胆膏注射液临床试验结果见表1，疗效情况见表2。安全试验组：具体数据见表3。各试验组受试猪的注射部位无红肿现象。
复方胆膏注射液高中低剂量组对猪热结症的治愈率分别为72.5％、62.5％和45.0％，总有效率分别为92.5％、85.0％和65.0％，大承气散对照组治愈率为52.5％，总有效率77.5％；阳性对照组自愈率为77.5％。且具体数据见表1：
表4复方胆膏注射液临床试验结果
3.讨论：
从安全性试验结果可知，供试的5头试验猪，在第一天用了二次药后，次日有一头所拉的粪便呈黑色的烂泥巴样，其余4头粪便表面湿润、软化，但能成形。而呼吸、体温均正常。第3天、第4天供试的5头猪的粪便全部呈黑色的烂泥巴样，表明复方胆膏注射液味苦性寒，用量和使用疗程应注意掌握尺度，这与中兽医学“热者寒之”，但过用则“苦寒败味”的理论一致。
从临床试验结果可知，复方胆膏注射液对猪热结症的总体疗效与大承气散相当，高、中剂量的疗效表现上略优于大承气散。复方胆膏注射液临床使用时安全的，其对肌内注射的刺激性不大，适宜肌内注射给药。建议复方胆膏注射液治疗成年猪热结症的剂量为每一次、每一头10～20ml，一日2次，疗程为1～3天，其具体用药次数应根据病情而定。
复方胆膏注射液有效成分含量测定方法
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。
实施例：
1、色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-35μm，4.6×250mm；
流动相A：乙腈/甲醇(70∶30)；
流动相B：超纯水(含0.1％冰乙酸)；
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：10μL；
蒸发光检测器：漂移管温度105℃，空气载气量2.8L/min；
分析时间：50min；
梯度洗脱流动相比例如下表所示：
2.溶液配制
(1)单一标准品溶液的配制
精密称取胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、连翘苷、黄芩苷对照品5mg，分别加甲醇配制成浓度为1mg/mL的单一对照品溶液，置4℃冰箱保存备用。
(2)配制混合标准溶液的配制
紧密称取胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、连翘苷、黄芩苷对照品各10mg，加甲醇配制成浓度为1mg/ml的混合标准品溶液，置置4℃冰箱保存备用。
(3)供试品溶液的制备
精密吸取复方胆膏注射液5mL，50mL具塞锥形瓶中，加15ml 10％氢氧化钠乙醇溶液，称重，加热回流1h，称重，甲醇补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(4)测定方法
外标法精密称取混合对照品溶液、各单一标准品溶液以及供试品溶液各10uL，注入液相色谱仪，记录色谱图。混合标准品色谱图见图2，复方胆膏注射液供试品色谱图见图3，连翘苷色谱图见图4，黄芩苷色谱图见图5，胆酸色谱图见图6，猪去氧胆酸色谱图见图7，鹅去氧胆酸色谱图见图8。
3.方法学考察
(1)标准曲线
将上述混合标准品加甲醇稀释成0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL，将上述不同浓度混合标准品按所述色谱条件进样10uL，记录峰面积。随后以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得直线回归方程。其标准曲线见图1、回归方程、最低检测限及线性范围见表7。
表7标准曲线及线性范围、最低检测限
(2)精密度、稳定性、重复性试验
精密度试验为将混合标准品溶液，连续进样6次，记录峰面积；稳定性实是将供同一份试品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24h内进样，记录峰面积；重复性试验为平行制备6份复方胆膏注射液供试品溶液，连续进样，记录峰面积。按外标法求得各化合物的回收率，并计算RSD值，精密度试验结果见表8，稳定性试验结果见表9，重复性试验结果表10。结果表明，该方法准确、稳定、重复性高，可以用于复方胆膏注射液含量测定。
表8复方胆膏注射液含量测定精密度试验结果
表9复方胆膏注射液含量测定稳定性试验结果
表10复方胆膏注射液含量测定重复性试验结果
(3)加样回收率
精密量取已知含量的复方胆膏注射液(猪去氧胆酸含量：4.31mg/mL，鹅去氧胆酸含量：4.43mg/mL，胆酸含量：7.14mg/mL，连翘苷含量：2.53mg/mL，黄芩苷含量：4.09mg/mL)1mL，平行6份，每份精密加入浓度为1mg/mL混合标准品溶液1mL，按照上述色谱条件进样检测，记录峰面积，计算加样供试品溶液各化合物的浓度，以(测得量-原有量)/加标量×100％计算回收率，并按外标法求得各化合物的加样回收率，并计算RSD值，结果见表5。结果显示，各化合物的加样回收率均在81.88％-97.07％之间，RSD值均小于5％。
表11加样回收率结果
4.样品测试
取三批复方胆膏注射液，称取1mL，按供试品制备方法制备样品，按所述色谱条件进行HPLC-ELSD测定，测定胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、连翘苷、黄芩苷含量。结果如表12所示。
表12三批复方胆膏注射液含量测定(n＝3)
Claims (7)
1.一种复方胆膏注射液，其特征在于：包括如下重量百分比的原料：胆膏1.0-2.5％，黄芩提取物0.5-2.0％，连翘提取物0.5-1.5％，稳定剂0.1-0.5％，余量为注射水；所述稳定剂由椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚组成。
2.根据专利要求1所述复方胆膏注射液，其特征在于：所述稳定剂中椰子油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇脱氢枞酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚的质量比为1-2∶3-5∶1-3。
3.根据权利要求1所述复方胆膏注射液，其特征在于：所述胆膏为猪胆膏。
4.一种如权利要求1-3任一项所述复方胆膏注射液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取胆膏10-25g加入200-800mL注射用水溶解，再加入黄芩提取物5-20g，加入氢氧化钠溶液，搅拌使黄芩提取物完全溶解，再加入连翘提取物5-15g，充分搅拌使其完全溶解，得混合液；
(2)往混合液中加入稳定剂1-5g，搅拌混合均匀后，用注射水定容至1000mL，再用磷酸二氢钠调节pH至6.5-7.0之间；
(3)往步骤(2)制得的注射液加入其质量0.1-0.5％的药用炭，经过滤，灌封，灭菌，即得复方胆膏注射液。
5.根据权利要求4所述复方胆膏注射液的制备方法，其特征在于：所述氢氧化钠浓度为5-10％，用量为15-25mL。
6.根据权利要求4所述复方胆膏注射液的制备方法，其特征在于：所述灭菌为流通蒸汽灭菌法，在温度100℃下灭菌30-45min。
7.如权利要求1-7任一项所述一种复方胆膏注射液有效成分含量测定方法，其特征在于：所述复方胆膏注射液中胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷和连翘苷五种有效成分的含量是采用高效液相色谱联用蒸发光检测器同时测定；具体的操作包括如下步骤：
(1)确定色谱条件：
所选的柱温：25℃-35℃；
所选的流动相A相为乙腈-甲醇(70：30)，B相为0.1％醋酸水溶液；
流速为1mL/min，进样量10μL；
蒸发光检测器：漂移管温度105℃，空气载气量2.8L/min；
梯度洗脱时间段及流动相比例如下表所示：
(2)标准溶液的配制：
S1：配制猪去氧胆酸标准品溶液、鹅去氧酸标准品溶液、胆酸标准品溶液、黄芩苷标准品溶液、连翘苷标准品溶液；
S2：配制一定浓度的混合标准品溶液，称取适量的胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷以及连翘苷标准品置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得；
S3：精密吸取复方胆膏注射液5mL，50mL具塞锥形瓶中，加15mL氢氧化钠乙醇溶液，称重，加热回流1h，称重，甲醇补足失重，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)确定蒸发光检测器漂移管温度、载气量以及各标准物质的保留时间：
A：控制载气量，调整漂移管温度，以基线平整无杂峰干扰以及气体正常排出且不在漂移管内冷凝蓄积为指标筛选载气量与漂移管温度参数，最终确定蒸发光检测器空气载气量为2.8L/min，漂移管温度为105℃。
B：按所述色谱条件进样混合标准品10uL，确定各标定物质的色谱峰之间保留时间无干扰且具有较好的分离度。
C：按所述色谱条件分别进样胆酸标准品溶液、猪去氧胆酸标准品溶液、鹅去氧胆酸标准品溶液、连翘苷标准品溶液、黄芩苷标准品溶液各10uL，记录色谱图，确定各单一标准物质的保留时间。
D：按上述色谱条件进样供试品溶液10uL，记录色谱图，确定供试品中各成分色谱峰之间有较好的分离度且相互无干扰，最终确定供试品溶液中胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷和连翘苷的保留时间。
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