CN112662681A

CN112662681A - OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用

Info

Publication number: CN112662681A
Application number: CN202110044457.2A
Authority: CN
Inventors: 袁猛; 楚传亮
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112662681B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsNRAMP1基因在改良水稻抗病性中的应用。从水稻中克隆得到OsNRAMP1基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过对OsNRAMP1基因的生物学功能的研究证明，在水稻中敲除OsNRAMP1基因能使水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的多个不同致病小种均表现出抗病性增强的能力，而它们的农艺性状没有明显改变。

Description

OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsNRAMP1基因的应用，所述的基因为水稻OsNRAMP1基因，所述的基因可用于在培育增强广谱抗白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病的水稻品种中的应用。

背景技术

水稻在生产上遭受多种病害危害，其中真菌病害稻瘟病和稻曲病，细菌病害白叶枯病和细菌性条斑病，是影响水稻生产的最为重要的病害，对我国乃至世界稻米安全生产影响尤为严重。据研究报道稻瘟病可以造成水稻减产10-35％，稻曲病可以造成水稻减产25％左右，白叶枯病可以造成水稻减产20-30％，细菌性条斑病可以造成水稻减产20％左右。其中稻曲病不仅造成水稻减产，更产生对人畜有害的毒素，人畜食用被稻曲毒素污染的稻米后，稻曲毒素可强烈抑制人畜微管蛋白组装和细胞骨架形成，严重抑制人畜细胞正常发育，对人畜健康造成极大威胁。近几十年来，随着气候变化、优质杂交稻大面积推广、氮肥大量施加，这些真菌和细菌病害在我国各个水稻生产区大面积发生，且有逐年增加的趋势。因此，发掘并有效利用水稻自身的抗病基因，改良水稻品种，以提高水稻对不同病害抗病性迫在眉睫。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：主效抗病基因和抗病相关基因。但是主效抗病基因的资源有限，大多数的主效抗病基因仅仅对一个或少数几个致病小种有抗性，抗病范围有限。目前只有抗稻瘟病和白叶枯病的主效抗病基因被鉴定和克隆，尚无抗细菌性条斑病和稻曲病的主效抗病基因被发现或鉴定。除主效抗病基因以外所有参与抗病反应的基因都称为抗病相关基因，它们编码的蛋白质参于合成植物体内抗病信号分子、信号传导或防卫反应过程等。目前，已克隆得到一些抗病相关基因，这些基因编码不同类型的蛋白质，通过调控水稻体内不同反应途径参与水稻对不同病原菌的抗病过程。但是在有效利用这些抗病相关基因过程中发现部分抗病相关基因对水稻重要农艺性状有影响，在一定程度上限制了对这些基因的育种应用。

本发明研究发现，水稻中的OsNRAMP1基因受不同病原菌诱导表达，敲除OsNRAMP1基因可增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病的广谱抗病性，且对水稻重要农艺性状没有明显影响。本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病的改良上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过对OsNRAMP1基因的生物学功能的研究，发现其在水稻抗白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病上具有重要调控作用，通过调节OsNRAMP1基因表达水平影响水稻对白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病的广谱抗病性。因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病的改良上具有重要的意义。

本发明的技术方案如下所述：

本发明证实在水稻中敲除OsNRAMP1基因使水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的多个不同致病小种均表现出抗性增强的能力。通过系统研究，申请人发现OsNRAMP1基因在水稻抗白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病方面有着重要调控功能。

生物学功能验证证明本发明所提供的水稻OsNRAMP1基因具有以下特性：

1、OsNRAMP1基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列由水稻OsNRAMP1基因及其上下游非编码序列共4860个脱氧核糖核苷酸组成。SEQ ID NO:1所示序列中第1位至86位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的上游非编码序列；第87位至170位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第一个外显子序列；第171位至1214位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第一个内含子序列；第1215位至1293位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第二个外显子序列；第1294位至1362位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第二个内含子序列；第1363位至1403位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第三个外显子序列；第1404位至1534位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第三个内含子序列；第1535位至1613位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第四个外显子序列；第1614位至1694位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第四个内含子序列；第1695位至1799位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第五个外显子序列；第1800位至2039位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第五个内含子序列；第2040位至2149位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第六个外显子序列；第2150位至2330位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第六个内含子序列；第2331位至2512位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第七个外显子序列；第2513位至2729位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第七个内含子序列；第2730位至2799位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第八个外显子序列；第2800位至2886位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第八个内含子序列；第2887位至3060位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第九个外显子序列；第3061位至3193位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第九个内含子序列；第3194位至3298位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十个外显子序列；第3300位至3504位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十个内含子序列；第3505位至3636位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十一个外显子序列；第3637位至3882位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十一个内含子序列；第3883位至3978位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十二个外显子序列；第3979位至4093位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十二个内含子序列；第4094位至4393位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的第十三个外显子序列；第4394位至4860位的脱氧核糖核苷酸为OsNRAMP1基因的下游非编码序列。

2、本发明涉及的OsNRAMP1基因可用于作物，特别是水稻抗病育种、转基因株系和基因新品种中应用。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

OsNRAMP1基因负向调控水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的广谱抗病性。

附图说明

图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsNRAMP1基因以及验证OsNRAMP1基因功能的流程图。

图2：用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术检测水稻品种中花11分别接种不同病原菌后OsNRAMP1基因的表达模式。附图标记说明：图2中的A图表示水稻接种白叶枯病菌后OsNRAMP1基因的表达量水平；图2中的B图表示水稻接种细菌性条斑病菌后OsNRAMP1基因的表达量水平。图2中的C图表示水稻接种稻瘟病菌后OsNRAMP1基因的表达量水平；图2中的D图表示水稻接种稻曲病菌后OsNRAMP1基因的表达量水平。每个样品中OsNRAMP1基因的表达量是相对于水稻中花11接种病原菌0小时的表达量。每个数据是平均值(3个重复)±标准差。

图3：本发明所用遗传转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH的起始载体图谱和重组载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsNRAMP1的图谱。附图标记说明：图3中的A图是本发明构建的起始载体pYLCRISPR/Cas9-MH图谱。图3中的B图是本发明构建的重组载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsNRAMP1图谱。图中P₃₅：HPT表示花椰菜花叶病毒的35S启动子启动表达的潮霉素磷酸转移酶基因，P_Ubi表示玉米泛素基因启动子，NLS表示核定位信号序列，T_nos表示根癌农杆菌终止子序列。

图4：OsNRAMP1基因敲除水稻株系靶位点的设计位点及基因型检测。附图标记说明：图4中的A图表示U3启动子引导gRNA和U6a启动子引导gRNA的设计位点；图4中的B图表示OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2与野生型相比缺失的脱氧核糖核苷酸数目及位置(方框中显示的即为缺失的脱氧核糖核苷酸)；图4中的C图表示琼脂糖凝胶电泳检测OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2的PCR产物与野生型相比明显变小。

图5：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同白叶枯病菌(PXO99、PXO61、PXO71、PXO112、PXO341、PXO347、Zhe173、KS1-21)后的病斑长度。附图标记说明：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同白叶枯病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变短。结果显示OsNRAMP1基因敲除水稻株系对不同白叶枯病菌表现出广谱抗病性的表型。

图6：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同细菌性条斑病菌(RH3、GX01、HNB8-47)后的病斑长度。附图标记说明：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同细菌性条斑病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变短。结果显示OsNRAMP1基因敲除水稻株系对不同细菌性条斑病菌表现出广谱抗病性的表型。

图7：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同稻瘟病菌(RB22、08T17)后的病斑长度。附图标记说明：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同稻瘟病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变短。结果显示OsNRAMP1基因敲除水稻株系对多个稻瘟病菌表现出抗病性增强的表型。

图8：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同稻曲病菌(WH13、TF14)后的每穗稻曲球数。附图标记说明：OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2接种不同稻曲病菌后的每穗稻曲球数与野生型植株相比显著性变少。结果显示OsNRAMP1基因敲除水稻株系对多个稻曲病菌表现出抗病性增强的表型。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是OsNRAMP1基因的核苷酸序列。序列长度为4860bp。

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。图1描述了鉴定和分离克隆OsNRAMP1基因以及验证OsNRAMP1基因功能的流程。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考：《Molecular Cloning:A Laborato；ry Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)或相关产品。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购的常规产品。

实施例1：分析不同病原菌处理水稻后OsNRAMP1基因的表达模式

为了验证OsNRAMP1基因是否参与调控水稻的抗病反应。申请人对孕穗期水稻品种中花11(或称ZH11，一种用于生物学实验的水稻模式品种，来源于中国农业科学院作物科学研究所惠赠)的叶片分别接种白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌，对稻穗接种稻曲病菌，采用qRT-PCR技术分析OsNRAMP1基因响应病原菌的表达模式。结果显示OsNRAMP1基因都能被白叶枯病菌、细菌性条斑病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌诱导表达。这一结果提示：OsNRAMP1基因可能参与调控水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抵抗反应，敲除OsNRAMP1基因的表达可能会提高水稻的抗病性。具体结果见图2。

实施例2：OsNRAMP1基因敲除水稻材料的获得

(1)OsNRAMP1基因敲除载体的构建

本实施例是关于pYLCRISPR/Cas9-MH-OsNRAMP1载体构建的一个通用说明。具体步骤为：设计引物OsNRAMP1 U3F(5’-GGCATGAGAACCCCGGTCCACACGTTTTAGAGCTAG-3’)和OsNRAMP1 U3R(5’-GTGTGGACCGGGGTTCTCATGCCACGGATCATCTGC-3’)(即，SEQ ID NO:1所示序列中第2081位至2103位的脱氧核糖核苷酸)，OsNRAMP1 U6aF(5’-GCCGGAGGTTGTGGTCGCGCTATGTTTTAGAGCTAG-3’)和OsNRAMP1 U6aR(5’-ATAGCGCGACCACAACCTCCGGCAGCCAAGCCAGCAC-3’)(即，SEQ ID NO:1所示序列中第2342位至2364位的脱氧核糖核苷酸)位点(如图4中的A图所示)。做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)/OsNRAMP1 U3R和OsNRAMP1 U3F/gRNA-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)以pYLgRNA-OsU3载体(KR029104)为DNA模版做PCR反应得到产物①和②，以及用U-F/OsNRAMP1 U6aR和OsNRAMP1 U6aF/gRNA-R以pYLgRNA-OsU6a载体(KR029105)为模版做PCR反应得到产物③和④；第二轮为重叠PCR，即，用引物Up-T1(5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T1(5’-CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以①和②为模版做PCR反应得到产物⑤，以及引物Up-T2(5’-GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T2(5’-CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以③和④为模版做PCR反应得到产物⑥。用BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9-MH载体(见图3)；将PCR产物⑤、⑥和BsaI酶切好的pYLCRISPR/Cas9-MH载体按照2：2：1体积比混合，用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)50℃反应15分钟，将反应产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，从验证正确的克隆中提取质粒，并进一步测序验证。从而获得植物遗传转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsNRAMP1。

(2)OsNRAMP1基因敲除水稻株系的获得和鉴定

申请人将植物遗传转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsNRAMP1通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11。获得了多个独立的转基因家系，选取家系1和家系2，用引物OsNRAMP1CgF(5’-TATCGGCTAATCTTGGAG-3’)和OsNRAMP1 CgR(5’-GTACACTGTCGCACTTGA-3’)PCR扩增野生型(即非转基因株系)和OsNRAMP1基因敲除水稻株系的家系1和家系2，鉴定基因被敲除情况。OsNRAMP1基因敲除水稻株系的家系1在两个设计靶位点之间缺失了272个脱氧核糖核苷酸，家系2在两个设计靶位点之间缺失了272个脱氧核糖核苷酸。结果见图4中的B图。PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示OsNRAMP1基因敲除水稻株系的家系1和家系2在基因组水平均存在大片段的脱氧核糖核苷酸缺失。结果见图4中的C图。

实施例3：OsNRAMP1基因敲除水稻株系的抗病性分析

(1)OsNRAMP1基因敲除水稻株系抗白叶枯病表型分析

在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsNRAMP1基因敲除水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种试验。结果显示，本发明的OsNRAMP1基因敲除水稻株系在孕穗期接种不同白叶枯病菌致病小种(例如PXO99、PXO61、PXO71、PXO112、PXO341、PXO347，来自菲律宾国际水稻研究所，为公开使用的菌种；Zhe173、KS1-21，来自于中国水稻研究所，为公开使用的菌种)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。见图5。以上结果表明，OsNRAMP1基因敲除后的水稻株系能增强水稻对白叶枯病菌多个致病小种的广谱抗病性。

(2)OsNRAMP1基因敲除水稻株系抗细菌性条斑病表型分析

在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsNRAMP1基因敲除水稻株系及野生型对照进行细菌性条斑病菌接种试验。结果显示，本发明的OsNRAMP1基因敲除水稻株系在分蘖期接种不同细菌性条斑病菌致病小种(例如：RH3、GX01、HNB8-47，上海交通大学陈功友教授惠赠，为公开使用的菌种)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。见图6。以上结果表明，OsNRAMP1基因敲除后的水稻株系能增强水稻对细菌性条斑病菌多个致病小种的抗病性。

(3)OsNRAMP1基因敲除水稻株系抗稻瘟病表型分析

在中国，湖北，武汉的春季温室对OsNRAMP1基因敲除水稻株系及野生型对照进行稻瘟病菌接种试验。结果显示，本发明的OsNRAMP1基因敲除水稻株系在分蘖期接种不同稻瘟病菌致病小种(例如：RB22、08T17，分别由中国农科院植物保护研究所王国梁研究员和华南农业大学陈乐天教授惠赠，为公开使用的菌种)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。见图7。以上结果表明，OsNRAMP1基因敲除后的水稻株系能增强水稻对稻瘟病菌多个致病小种的抗病性。

(4)OsNRAMP1基因敲除水稻株系抗稻曲病表型分析

在中国，湖北，武汉的秋季温室对OsNRAMP1基因敲除水稻株系及野生型对照在孕穗期进行稻曲病菌接种实验。结果显示，本发明的OsNRAMP1基因敲除水稻株系在孕穗期接种不同稻曲病菌致病小种(例如：WH13、TF14，华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室从湖北省黄冈市团风县的水稻病圃中分离，为公开使用的菌种)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsNRAMP1基因敲除后的水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2每穗稻曲球数均显著性少于野生型对照(p<0.01)。见图8。以上结果表明，OsNRAMP1基因敲除水稻株系能增强水稻对稻曲病菌多个致病小种的抗病性。

实施例4：OsNRAMP1基因敲除水稻株系的农艺性状分析

在中国，湖北，武汉华中农业大学校内科研基地，夏季种植野生型(非转基因，下同)和OsNRAMP1基因敲除水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2。每份材料种植100株，按正常水肥管理。于秋季成熟后收获水稻，调查农艺性状。

表1转基因水稻株系与野生型水稻株系水稻农艺性状考察及统计分析

上述农艺性状包括株高、分蘖数、穗长、剑叶长、剑叶宽、粒长、粒宽、每穗实粒数、千粒重、结实率、单株产量。结果显示与非转基因野生型对照相比，OsNRAMP1基因敲除后的水稻株系osnramp1-1和osnramp1-2的上述农艺性状没有明显差异(见表1)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用

<141> 2021-01-13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4860

<212> DNA

<213> 水稻(oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(4860)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (4394)..(4860)

<220>

<221> exon

<222> (4094)..(4393)

<220>

<221> Intron

<222> (3979)..(4093)

<220>

<221> exon

<222> (3883)..(3978)

<220>

<221> Intron

<222> (3637)..(3882)

<220>

<221> exon

<222> (3505)..(3636)

<220>

<221> Intron

<222> (3300)..(3504)

<220>

<221> exon

<222> (3194)..(3298)

<220>

<221> Intron

<222> (3061)..(3193)

<220>

<221> exon

<222> (2887)..(3060)

<220>

<221> Intron

<222> (2800)..(2886)

<220>

<221> exon

<222> (2730)..(2799)

<220>

<221> Intron

<222> (2513)..(2729)

<220>

<221> exon

<222> (2331)..(2512)

<220>

<221> Intron

<222> (2150)..(2330)

<220>

<221> exon

<222> (2040)..(2149)

<220>

<221> Intron

<222> (1800)..(2039)

<220>

<221> exon

<222> (1695)..(1799)

<220>

<221> Intron

<222> (1614)..(1694)

<220>

<221> exon

<222> (1535)..(1613)

<220>

<221> Intron

<222> (1404)..(1534)

<220>

<221> exon

<222> (1363)..(1403)

<220>

<221> Intron

<222> (1294)..(1362)

<220>

<221> exon

<222> (1215)..(1293)

<220>

<221> Intron

<222> (171)..(1214)

<220>

<221> exon

<222> (87)..(170)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(86)

<400> 1

ttgcagagat cggggttcgg cgccggcggc gagttgttga gaggcaaggc aaactcaggc 60

gactgagcta aagaagccgc actagtatgg gggtgacgaa ggcggaggcg gttgccggcg 120

acggcgggaa ggtggtggac gacatcgagg cgctcgccga tctcagaaag gttaattctc 180

tctgcaaata ctcctggttg ctcatactta aatctaccta tgaatgaggg atcgcatcga 240

tgtcgcagtt ggagttggac ggacaggagt gagaaattat tatctctgat ctgattcctg 300

ttggtatgca ctcttgctgt ttgtgaaaat gccccagagg atgcatccac aggacacggc 360

gccttcaata tttataagtt gattcaatga tgggtttctt tcatgtttct ttgctgaaaa 420

atcgtgttta gtagagtagt cttctatgtc tctattcaaa agaaaagtgg cattaagtta 480

taggagaaaa taaaagggag aagtcgtttt gttaattagg agcttctcct ttcgataact 540

atgacttaat agttcatttt tattatggaa caaagatgag atacaaaaca atagattgtg 600

atcacctcag tttttttgtt tgatatcaag tctgacaaac taaggcatta cggttctctg 660

ctcttgtttg acaaacgaag tctattgtac aatagaagtc tgttgtttaa tgtctctact 720

tttggtcatc tcttgtatgg tttagcctag atctcagttt atcttactat aggtcgccga 780

tagtacaata tgatttgttt ctccgccgta cctaatccaa aatcatatag cttgacatta 840

tctgcttcgc atagatgttc gttataagct tcaaattaca aatttcatat tgaaagttta 900

gcctcttctt gttggactat aatagcgagt ccatgtgaac atcatttctt acattaatat 960

acatttcttc acatttgtgg ctagttattt tacttgccct accattgtcg catttattta 1020

tatttccata actcattttc caatgcttag ttgaatgtat cattcactca ttcttgtatt 1080

gtttgtacgt ctttgagact ttgactgaaa atagtcttag ttttgtacct attttatatt 1140

ttgctttatg ttttaattat tttctttgac atgatgtgca tgcatattta ttactaattg 1200

gtcatgtaac acaggagcca gcatggaaaa ggtttttgtc ccacattgga ccaggcttta 1260

tggtctgttt ggcttacctc gatcctggaa atagtaatat tctctctcta aatttatttt 1320

ctcacactca tatggtttct cacgcttgac gaattgaaac agtggagact gatctacaag 1380

ctggtgccaa tcacaaatat gaggtacatt ctctagcctt ttctatatga cttttcctgc 1440

catttatcac agttgtcatg tcttttgtta cagcgagaag aaagaaacaa ttaactgata 1500

tgcttcttga tgtgctcttt catatgtttc ttagcttctt tgggtgattt tgattggcct 1560

gatctttgca ctgattatac aatcattatc ggctaatctt ggagtggtga caggtaataa 1620

atagacactt tcagcacaca attgatttaa catttcagtt ggaagtagca agtaatgaat 1680

gtcaattgat acagggcgcc atcttgctga gctgtgcaag actgaatatc cagtatgggt 1740

gaaaacctgc ttatggctgc tagcagaact agctgtgatt gcttccgata ttccagaagg 1800

ttggaaatag aatgatagat ctaaataaaa aaaagttaat gtttaactgt cacctttgag 1860

tttcagttga ttaagtttat aaactctctc actgatataa gtgtacgagc aacacttgca 1920

ctgattgtat acagtctctt atccactaaa cattatgata tgtagcactt tttctgagaa 1980

gaaagcaaca acatctaatc taatatttgg tgttttttac acatgtacct tttgtgcagt 2040

tataggtaca ggatttgctt tcaacctttt gttccacata ccagtgtgga ccggggttct 2100

cattgctggc tctagcacgc ttcttcttct tggactgcaa agatatgggg taaccaacta 2160

tttatgactg gatatatgat agatgtctgt ataaaatgtt ttaatgaatg tctaaacatc 2220

attgtattgt atttgatcat tactgtttgg tcattgtaaa tggtggtcat tacaaatggg 2280

tttgttgttg aattgacttg tttgcatttt tccttcatct atataactag gtaaggaaac 2340

tggaggttgt ggtcgcgcta ttggtgtttg tcatggcagg gtgcttcttc gtggagatga 2400

gcatagtcaa gcctccggtt aatgaggtcc ttcaaggatt attcatcccc aggctcagtg 2460

ggcccggtgc cacaggagac tccattgccc ttcttggggc tcttgtaatg ccgtaagcag 2520

tcaaacatgc atatataccc ccagttgtta atgtgtgcaa tgtctttttt gcgtcttaag 2580

attcttctag ggtagctgta aacatgcata aggttttcaa ctctccagta attacaaatc 2640

tccacaatgg tagttttagt ctttttttag attttgacaa aatgcactct tgttaatcat 2700

aagtgagcat tatcagttat taattacagg cacaatctat tcttgcactc tgccctggtg 2760

ctgtcgagga atacacccgc atcagcaaaa ggaatgaagg tgatcagatg tccgtgttct 2820

tgcattaaaa aagaaatggt actcctagtt ggctgataca tattccttca ttcttttgta 2880

ctccaggatg tctgtaggtt cttcctcttt gagagtggga tagctctttt cgtggctctg 2940

cttgtcaaca ttgcaatcat ctctgtctcc ggcactgtat gtaatgcaac caacctttca 3000

ccagaagatg ctgtaaaatg cagcgacctt acattggact cctcatcctt cctcctcagg 3060

gtactgcata tatgtgcaaa gttcatcacc atttatattt agttgtgtta ttttcttcac 3120

aaaaataaat tagtcatgtt atcattgacc atataatggt catttacaga attattattt 3180

attttttttt cagaatgtgc taggaaagtc aagtgcgaca gtgtacggtg tagcactctt 3240

ggcttctgga cagagctcga ccattactgg cacttatgct gggcaatatg ttatgcaggt 3300

atattttacc tgaactctaa ccttgtttac aaattaacca agtactatct gtgaactatt 3360

ttcttaatga ccagttcaag tggtatagta ttaaccacgc agtaaactag aagatctcca 3420

aaatggtgaa agaaatgaaa aaaagtttgc aatctatcaa gcttgaatgt atagtaacag 3480

tttttttttt ccatgtatct acaggggttc ctagacatca aaatgaaaca gtggcttcgg 3540

aacctgatga cacgcagcat tgccattgtg cctagcttaa tcgtctccat cattggaggg 3600

tctagtggcg ccggtcgtct catcgtcatt gcatcggtac aatcttttac tacaaatgaa 3660

aatatcagtt tgcccataag aacactcatt aaaaaaaact gccatacaat caaccatctt 3720

ctaattttct caataattag taagttattt gctaatcgaa atgcttcttt cttcaaaaaa 3780

tggacggtat gtaatttgtt gtacctcatt ccttctgatc atactgttaa aaagaatcaa 3840

aacctaatgc ttgttttggt ttggctgtta cgtttcatac agatgattct atcctttgag 3900

ctaccatttg ctctgatccc tcttctcaag ttcagcagca gcagcaacaa gatgggtgaa 3960

aacaagaact ccatctatgt aagcactccc ccatcaatca atcaatcctt ctttctagct 4020

tgtccacaca tagaaaacaa aaacaaaaaa aatcctggaa aactaataat gcattggtaa 4080

ttaaaacctg cagattgttg gattctcctg ggtgctgggg ttcgtcatca tcgggataaa 4140

catctacttc ctcagcacaa agctggtcgg ctggatcctc cacaacgcgc tcccgacatt 4200

cgccaacgtg ctcatcggca tcgtgctgtt cccgctcatg ctgctctacg tcgtcgccgt 4260

gatctacctg acgttcagga aggacaccgt caagttcgtg tctcgtcgtg agctgcaggc 4320

cggcgacgac accgagaaag cacaggtagc cacctgcgtc gccgacgagc acagcaaaga 4380

gccacccgtg tagtaccctt ccagaccggt taccggtgtt ggctggtttt tattggatag 4440

atgtttaggt ccaatttttt ttatataaaa aatccaatag atgtttaggt ccaaattttt 4500

gaattcaaaa accggttagc agtgataacc ggctgaaatt ttggcccatg ggagtagatt 4560

gttgcttttt ttcttagtga ttagttattg gcagattggc agaatgttgt agctaggcaa 4620

tctaattgta tggttagata tttagtcata aatccaagag tgagttttct tggatgcgag 4680

gacaaggaca atctaattgt atggttagat atttagtcat aaatccaaga gtgagttttc 4740

ttggatgcga ggacaaggac aaatataaat gtaaataaat gcagttaaag taacaccttg 4800

ctcaaatata aatgtaaata aatgcagtta aagtaacacc ttgctccttg tggacatcta 4860

Claims

1.水稻OsNRAMP1基因在增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病、稻瘟病和稻曲病抗性中的应用，所述OsNRAMP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。