CN106498056A - 一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 - Google Patents
一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106498056A CN106498056A CN201610953331.6A CN201610953331A CN106498056A CN 106498056 A CN106498056 A CN 106498056A CN 201610953331 A CN201610953331 A CN 201610953331A CN 106498056 A CN106498056 A CN 106498056A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chicken
- snp site
- nramp1
- nramp1 gene
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 108091006619 SLC11A1 Proteins 0.000 title description 3
- 101100133798 Gallus gallus SLC11A1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 26
- 101150067862 NRAMP1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 19
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 abstract description 10
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100034559 Natural resistance-associated macrophage protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鸡NRAMP1基因的SNP位点，所述SNP位点与J亚型禽白血病抗性相关，该位点位于NRAMP1基因片段上125位点的核苷酸，该位点的核苷酸为C或T，NRAMP1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供了一种与J亚型禽白血病抗性相关的鸡NRAMP1基因的SNP位点，针对NRAMP1基因片段125位点的SNP位点，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，然后使用限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。本发明的鸡NRAMP1基因的SNP位点对于研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制具有非常重要的意义，有利于对鸡群个体进行有目的的选择，提高对后代鸡群对J‑ALV的抗性。
Description
技术领域
本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种鸡NRAMP1基因的SNP位点、其获取方法及应用。
背景技术
NRAMP1基因也称为溶质转运11成员1(Solute carrier family 11member1，SLC11A1)。该基因是一个较为保守的基因。Melder D C等研究发现，其与人类、小鼠及畜禽的抗病力相关，主要影响动物的固有免疫。Hu等克隆分析了鸡的NRAMP1基因，它由554个氨基酸所构成，有15个外显子，含有12个推定的转膜区域及2个糖基化位点，主要是起到离子通道以及转运的功能。NRAMP1基因与鸡、老鼠和人类有68％的同源性。经过Northern杂交实验表明：NRAMP1基因主要在网状内皮组织，如脾脏、肝脏、肺和胸腺的吞噬细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞及外周血细胞)中表达，这一点与老鼠和人类是一样的。该基因在哺乳动物的胸腺中不能表达，但在鸡胸腺中的表达量却很高。有研究发现，通过病菌侵染抗性与易感性小鼠，该基因功能丧失的小鼠在感染早期免疫力低下，在感染后期的免疫功能正常。这表明NRAMP1基因在早期巨噬细胞与病菌互作时可能发挥重要作用。研究发现，该基因与伤寒沙门氏菌、利什曼菌等多种胞内寄生病原菌和某些病毒性疾病的抵抗作用相关。
SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，单核苷酸多态性)，是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。SNP是疾病易感性、显现性、抵抗力、以及药物反应性等生物性状差异的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。SNP作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经多种发展成熟的检测技术，如DNA测序(Sanger测序法和焦磷酸测序法)、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。
经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见NRAMP1基因的多态性位点与J亚型禽白血病(J-ALV)抗性相关性的报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种与J亚型禽白血病抗性相关的鸡NRAMP1基因的SNP位点、其获取方法及应用。
本发明提供了一种鸡NRAMP1基因的SNP位点，所述SNP位点与J亚型禽白血病抗性相关，该位点位于NRAMP1基因片段上125位点的核苷酸，该位点的核苷酸为C或T，NRAMP1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种所述鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，该方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增鸡基因组DNA，得到PCR扩增产物；
(2)用限制性内切酶TscAI消化PCR扩增产物，再对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(3)根据电泳结果鉴定鸡NRAMP1基因的SNP位点。
进一步的，PCR扩增所用引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
进一步的，步骤(1)中，PCR扩增的反应体系为：50ng/μl DNA模板1μl、10×PCR反应缓冲液2μl、2.5mM dNTP 08μl、5μM引物0.8μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.1μl，加水至20μl。
进一步的，步骤(1)中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。
进一步的，步骤(2)中，TscAI酶切的反应体系为：PCR产物5μl、10×缓冲液1μl、10U/μl TscAI酶1μl，加水至15μl。
进一步的，步骤(3)中，酶切产物为151bp和119bp两条带则为TT基因型；酶切产物为225bp一条带的则为CC基因型；出现151bp、119bp和225bp三条带的则为杂合型CT，对J-ALV易感性较强。
本发明还提供了上述鸡在鸡J亚型禽白血病抗性选择育种的应用。
当SNP位点为TT基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病抗性最强；当SNP位点为CC基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病抗性较强；当SNP位点为CT基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病易感性较强。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与J亚型禽白血病抗性相关的鸡NRAMP1基因的SNP位点，针对NRAMP1基因片段125位点的SNP位点，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，然后使用限制性内切酶进行酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。本发明的鸡NRAMP1基因的SNP位点对于研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制具有非常重要的意义，有利于对鸡群个体进行有目的的选择，提高对后代鸡群对J-ALV的抗性。
附图说明
图1是本发明鸡NRAMP1基因的DNA片段扩增后的电泳图谱；
图2是本发明鸡NRAMP1基因PCR扩增产物酶切反应后的电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。
本发明与J亚型禽白血病抗性相关的鸡NRAMP1基因的SNP位点位于NRAMP1基因片段上125位点的核苷酸，该位点的核苷酸为C或T，NRAMP1基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
针对上述NRAMP1基因的125位点的SNP，本发明还公开了其获取的方法，其中用于扩增所述NRAMP1基因和检测该基因位点的正反向引物对序列如下：
上游引物 5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'(SEQ ID NO:2)
下游引物 5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'(SEQ ID NO:3)
本发明的鸡NRAMP1基因的SNP位点在优化鸡育种繁殖中的应用，其用于筛选抗J亚型禽白血病的鸡个体。
本发明的获取鸡NRAMP1基因的SNP位点的方法，包括以下步骤：
1、样品的采集及DNA的提取
采集固始鸡的血液，基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提，具体步骤为：
(1)取上述全血30μl置于1.5ml离心管，分别加入470μl 1×SET缓冲液、12.5μl20％SDS(十二烷基硫酸钠)和6μl的10mg/ml蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5ml离心管，加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μl氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1ml冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1ml 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μl灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；将DNA原液1：100稀释并进行分光光度计检测浓度，OD值为1.85-1.94。
(8)将DNA浓度稀释到50ng/μl，存放于-20℃冰箱中保存备用。
2、PCR扩增
扩增包含C125T位点的片段：根据NRAMP1基因序列设计包含该位点的正反向引物。所述引物的核苷酸序列如SEQNO:2-3所示以上述固始鸡基因组的DNA为模板，在包含待测位点序列的正反向引物、rTaq DNA聚合酶、缓冲环境、dNTPs存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为268bp。
所述引物对序列如下：
上游引物序列为：5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'(SEQ ID NO:2)
下游引物序列为：5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'(SEQ ID NO:3)
PCR扩增反应的具体步骤为：
1)PCR扩增反应体系准备：50ng/μl DNA模板1μl、2mM dNTP 2μl、10×PCR反应缓冲液(100mM KCl、80mM(NH4)SO4，pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和质量体积比为0.5％的Tergitol-type NP-40)2μl、2.5mM dNTP 0.8μl、5μM上下游引物各0.4μl、5U/μlrTaq DNA聚合酶0.1μl，加ddH2O至总体积20μl。
2)PCR扩增反应程序设置：在Perkin-Elmer GeneAmp PCR Systems 9600上进行扩增反应，PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；35个循环(94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s)；72℃延伸6min，得到PCR扩增产物，在4℃保存。
3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测扩增产物片段大小，以扩增产物片段为268bp，判定PCR扩增是否成功；
3、酶切反应的具体步骤为：
1)在200μl的PCR薄壁管中加入如下酶切反应体系：PCR产物5μl、10×缓冲液1μl、10U/μl TscAI酶(MBI公司)1μl，加水至总体积15μl，65℃消化2.5h；
2)酶切结果鉴定：全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型，分型依据为，酶切产物为151bp和119bp两条带则为TT基因型，对应检测样品个体J-ALV抗性最强；酶切产物为225bp则为CC基因型，对应检测样品个体J-ALV抗性较强；出现151bp、119bp和225bp三条带的则为杂合型CT，对J-ALV易感性较强。
实施例：
运用上述方法对100只阴性的和100只自然感染J-ALV的固始鸡NRAMP1基因C125T-SNP位点进行分型。
1、样品
采集100只阴性的和100只自然感染J-ALV的固始鸡的血液，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50ng/μl。
2、PCR扩增反应及结果
PCR扩增及检测结果按照上述方法步骤进行，NRAMP1基因PCR产物大小为268bp，与预计的结果一致(见图1)。需要说明的是，100只确定J-ALV为阴性的固始鸡血液样品，仅有4只扩增出NRAMP1基因，100只阳性自然感染个体有91只扩增出NRAMP1基因，更进一步证明目的基因与J-ALV具有抗性相关性(见表1)。
3、NRAMP1基因PCR扩增产物的酶切鉴定
NRAMP1基因PCR产物酶切产物的检测结果判断依据为：酶切产物为151bp和119bp两条带则为TT基因型，对应检测样品个体J-ALV抗性最强；酶切产物为225bp则为CC基因型，对应检测样品个体J-ALV抗性较强；出现151bp、119bp、225bp三条带的则为杂合型CT，对J-ALV较易感(见图2)。
100只阴性个体中有4个个体扩增出目的基因的和100只阳性个体中有91个体扩增出目的基因的，其中TT基因型的有80只，CC基因型的有8只，CT杂合型的有3只(见表1)。
表2固始鸡100只阴性个体和100阳性个体NRAMP1基因扩增及酶切
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种鸡NRAMP1基因的SNP位点、其获取方法及应用
<160> 3
<210> 1
<211> 268
<212> DNA
<213> 鸡（pullus）
<400> 1
tcgtaggtct gggcttacca tggggcagag ccctgtgccc ttgccaccac cccatgtgtc 60
ctctaagggt gtcaccccag gtccttccac agccatgggg actttgtgag gtgcagcctg 120
attctaacca acactaagct ccccagtctt tggggtgagg gtgtctccca ccccagcacc 180
cagcactctc cagaaccccc ctccgagccc ggggtgcatt ttgccctgct cacgtgcttg 240
tgcaatccac gctgcttcct cctcactc 268
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccttggata tgtgtttgca ga 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggctccaa tgatgcca 18
Claims (9)
1.一种鸡NRAMP1基因的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点与J亚型禽白血病抗性相关，该位点位于NRAMP1基因片段上125位点的核苷酸，该位点的核苷酸为C或T，NRAMP1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种获取权利要求1所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增鸡基因组DNA，得到PCR扩增产物；
(2)用限制性内切酶TscAI消化PCR扩增产物，再对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；
(3)根据电泳结果鉴定鸡NRAMP1基因的SNP位点。
3.根据权利要求2所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增所用引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求3所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增的反应体系为：50ng/μl DNA模板1μl、10×PCR反应缓冲液2μl、2.5mM dNTP 0.8μl、5μM引物0.8μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.1μl，加水至20μl。
5.根据权利要求2所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸6min。
6.根据权利要求2所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，其特征在于，步骤(2)中，TscAI酶切的反应体系为：PCR产物5μl、10×缓冲液1μl、10U/μl TscAI酶1μl，加水至15μl。
7.根据权利要求2所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点的获取方法，其特征在于，步骤(3)中，酶切产物为151bp和119bp两条带为TT基因型；酶切产物为225bp为CC基因型；酶切产物为151bp、119bp和225bp三条带为CT基因型。
8.权利要求1所述的鸡NRAMP1基因的SNP位点在鸡J亚型禽白血病抗性选择育种的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，当SNP位点为TT基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病抗性最强；当SNP位点为CC基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病抗性较强；当SNP位点为CT基因型，判断所述鸡对J亚型禽白血病易感性较强。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610953331.6A CN106498056A (zh) | 2016-11-03 | 2016-11-03 | 一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610953331.6A CN106498056A (zh) | 2016-11-03 | 2016-11-03 | 一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106498056A true CN106498056A (zh) | 2017-03-15 |
Family
ID=58322358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610953331.6A Pending CN106498056A (zh) | 2016-11-03 | 2016-11-03 | 一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106498056A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662681A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-04-16 | 华中农业大学 | OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106086184A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-09 | 王乾 | 一种基因诊断试剂盒及其使用方法 |
-
2016
- 2016-11-03 CN CN201610953331.6A patent/CN106498056A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106086184A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-09 | 王乾 | 一种基因诊断试剂盒及其使用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HU JX ET AL: "Resistance to salmonellosis in the chicken is linked to NRAMP1 and TNC", 《GENOME RESEARCH》 * |
| 乔彩霞等: "禽白血病研究进展", 《动物医学进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662681A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-04-16 | 华中农业大学 | OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用 |
| CN112662681B (zh) * | 2021-01-14 | 2022-02-11 | 华中农业大学 | OsNRAMP1在改良水稻抗病性中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | Genome sequencing of the extinct Eurasian wild aurochs, Bos primigenius, illuminates the phylogeography and evolution of cattle | |
| CN103667429B (zh) | Snp检测筛选鸡的丝羽性状的方法 | |
| CN108251539A (zh) | 一种与鸡屠体性状相关的snp标记及其应用、检测引物、检测试剂盒 | |
| CN110551828A (zh) | 一种与鸡背部毛孔密度相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN108103208A (zh) | 一种影响湖羊产羔性状的snp标记及其应用 | |
| CN104293905A (zh) | 一种用于检测鸡青胫性状连锁snp位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN103602745B (zh) | 一种用于检测鸡pmel17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN102534006B (zh) | 一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法 | |
| CN103233001B (zh) | 秦川牛FoxO1基因单核苷酸多态性分子标记的检测方法与应用 | |
| CN107988385A (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
| CN108588235B (zh) | 与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记及其应用 | |
| CN110564867A (zh) | 一种秦川牛cfl1基因的snp分子标记及其检测方法 | |
| CN102816759B (zh) | 北京鸭stmn1基因单核苷酸多态性及其分子标记的检测方法 | |
| CN103374629B (zh) | 利用微卫星标记鉴定北京油鸡的方法 | |
| CN102220410B (zh) | 一种辅助鉴定具有不同体重性状鸡的方法 | |
| CN102703440B (zh) | 山羊sh2b1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法 | |
| CN117025797B (zh) | 与奶牛乳房炎抗性相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN104498611A (zh) | 检测黄牛 Notch1 基因 SNP 位点的 RFLP 方法及试剂盒 | |
| CN106498056A (zh) | 一种鸡nramp1基因的snp位点、其获取方法及应用 | |
| CN103695416B (zh) | 一种检测秦川牛cfl2基因的单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN103602744B (zh) | 一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN105603099B (zh) | 肉鸭otxr基因单核苷酸多态性及其检测方法和应用 | |
| WO2011106904A1 (zh) | 辅助鉴定五指山小型猪近交系的方法及其专用引物 | |
| CN102094081B (zh) | 一种检测黄牛sh2b1基因单核苷酸多态性的方法 | |
| CN115820866A (zh) | 绵羊双肌表型性状相关的分子标记、引物对、试剂盒及鉴别方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170315 |