CN106086184A - 一种基因诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与J亚型禽白血病抗性密切相关的基因NRAMP1诊断试剂盒及其使用方法，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；使用方法以RFLP方法检测NRAMP1基因的基因型，PCR扩增位点所在片段，内切酶TscAI进行酶切反应；NRAMP1外显子C125T突变对J亚型禽白血病的抗性有影响，携带T等位基因的个体为J亚型禽白血病抗性群体，特别是携带T等位基因的公鸡对J亚型禽白血病抗性更强。

Description

一种基因诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明专利属于生物技术领域，利用PCR-RFLP技术检测提供一种对J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1(Natural Resistance Associated Macrophage protein)的C125T-SNP分型试剂盒。

背景技术

NRAMP1基因也称为溶质转运11成员1(Solute carrier family 11 member 1，SLC11A1)。该基因是一个较为保守的基因。MelderD C等研究发现，其与人类、小鼠及畜禽的抗病力相关，主要影响动物的固有免疫(Melder D C et al.,1995))。Hu等克隆分析了鸡的NRAMP1基因，它由554个氨基酸所构成，有15个外显子，含有12个推定的转膜区域及2个糖基化位点，主要是起到离子通道以及转运的功能(Hu et al.,1996)。NRAMP1基因与鸡、老鼠和人类有68％的同源性。经过Northern杂交实验表明：NRAMP1基因主要在网状内皮组织，如脾脏、肝脏、肺和胸腺的吞噬细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞及外周血细胞)中表达，这一点与老鼠和人类是一样的(Chery L H et al.,1999)。该基因在哺乳动物的胸腺中不能表达，但在鸡胸腺中的表达量却很高。有研究发现，通过病菌侵染抗性与易感性小鼠，该基因功能丧失的小鼠在感染早期免疫力低下，在感染后期的免疫功能正常(Chery L H et al.,1999)。这表明NRAMP1基因在早期巨噬细胞与病菌互作时可能发挥重要作用。研究发现，该基因与伤寒沙门氏菌、利什曼菌等多种胞内寄生病原菌和某些病毒性疾病的抵抗作用相关。说明NRAMP1基因是决定鸡是否是对J亚型禽白血病易感的一个重要因素，而它作为易感性评价的基础就是其SNP特性。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。SNP是疾病易感性、显现性、抵抗力、以及药物反应性等生物性状差异的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。SNP作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经多种发展成熟的检测技术，如DNA测序(Sanger测序法和焦磷酸测序法)、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。

经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有NRAMP1基因多态性位点与J亚型禽白血病抗性相关性的报道。

根据以上问题，本发明相较于以往传统方式，此位点对于研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制具有非常重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制的分析准确性。

本发明提供以下技术方案：包括：1.一种J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1诊断试剂盒，其特征是：包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；

NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物表示的信息为：

上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'

下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'

一种J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1诊断试剂盒的方法包括下列步骤：

1)PCR扩增SNP位点所在片段；

2)PCR产物的酶切鉴定；

PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤：

1)PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl 50ng/μl DNA模板、2μl10×PCR反应缓冲液、0.8ul2.5mM dNTP、0.8ul 5uM引物P和0.1μl 5U/ul rTaq DNA聚合酶，加水至20ul，充分混匀后短暂离心；

2)在PCR仪上设置如下PCR反应程序：先94℃变性4分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃30秒、56℃30秒、72℃30s；然后72℃延伸6分钟、最后4℃保存；PCR反应程序设置完毕后，将PCR薄壁管放入PCR仪进行反应扩增；

3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测扩增产物片段大小，以扩增产物片段为268bp，判定PCR扩增的片段是否正确；

PCR产物的酶切鉴定有以下步骤：

1)在200μl的PCR薄壁管中加入如下酶切反应体系，5μl PCR产物、1μl 10倍缓冲液、1ul 10U/ul TscAI酶加水至15μl，65℃消化2.5h；

2)酶切结果鉴定，全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型，分型依据为，酶切产物为119bp和101bp两条带则为TT基因型，酶切产物为225bp则为CC基因型，三条带的则为杂合型CT。

附图说明

图1为本发明的结构图；

附图说明：1、盒体；2、衬垫；3、上游引物混合物P；4、限制性内切酶；5、DNA Tag酶；6、下游引物混合物P；

图2为本发明的NRAMP1基因PCR产物扩增检测结果图

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：

实施例1：在实际中，本试剂盒由1、盒体；2、衬垫；3、上游引物混合物P；4、限制性内切酶；5、DNATag酶；6、下游引物混合物P，其中上下游引物混合物P详细信息如下：

上下游引物混合物P表示用于NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下：

上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'

下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'

本试剂盒使用方法：

1PCR扩增SNP位点所在片段

1)PCR扩增反应体系准备

PCR的反应体系为20μl，其中包括：

模板DNA(约50ng) 1μl

扩增缓冲液(10×buffer) 2μl

2.5mM dNTP 0.8μl

引物P(5uM) 0.8μl

5U/ul DNA聚合酶(rTaq) 0.1μl

加水补至 20μl

在200μl的PCR薄壁管中，按照以上反应体系加入试剂，充分混匀后短暂离心。

2)PCR扩增反应程序设置

在eppendorfPCR仪上设置如表1所述，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。

表1 PCR扩增反应程序

3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测反应是否成功。

2PCR产物的酶切鉴定

1)酶切反应体系15ul，如下

PCR产物 5μl

10倍缓冲液 1μl

10U/ul TscAI(MBI公司) 1ul

用水补至 15μl

65℃消化 2.5h

2)酶切结果检测

全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型。

实施例2：运用本试剂盒对100只阴性的和100只自然感染J-ALV的固始鸡NRAMP1基因C125T-SNP位点进行分型。

1.样品

采集100只阴性的和100只自然感染J-ALV的固始鸡的血液，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50ng/μl。

2.PCR扩增反应及结果

PCR扩增及检测结果按照试剂盒使用方法步骤1进行，NRAMP1基因PCR产物大小为268bp，与预计的结果一致(见图2)

3.NRAMP1基因PCR扩增产物的酶切鉴定

NRAMP1基因PCR产物酶切鉴定按照试剂盒使用方法步骤2进行，检测结果判断依据为，酶切产物为119bp和101bp两条带则为TT基因型，酶切产物为225bp则为CC基因型，三条带的则为杂合型CT。

本发明设计优点主要有：为了给J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1基因C125T-SNP的检测提供一种准确性高、快速、价格低廉的基因分型试剂盒。

Claims (4)

1.一种基因诊断试剂盒，其特征是：包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；

所述NRAMP1基因PCR扩增的上游引物和下游引物的混合物表示的信息为：

所述上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'

所述下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3' 。

2.一种基因诊断试剂盒使用方法，其特征是，所述方法包括下列步骤：

1)PCR扩增SNP位点所在片段；

2)PCR产物的酶切鉴定。

3.根据权利要求2所述基因诊断试剂盒使用方法，其特征是，所述PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤：

1)PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl 50ng/μl DNA模板、2μl10×PCR反应缓冲液、0.8ul2.5mM dNTP、0.8ul 5uM引物P和0.1μl 5U/ul rTaq DNA聚合酶，加水至20ul，充分混匀后短暂离心；

2)在PCR仪上设置如下PCR反应程序：先94℃变性4分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃30秒、56℃30秒、72℃30s；然后72℃延伸6分钟、最后4℃保存；所述PCR反应程序设置完毕后，将所述PCR薄壁管放入所述PCR仪进行反应扩增；

3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测扩增产物片段大小，以扩增产物片段为268bp，判定PCR扩增的片段是否正确。

4.根据权利要求3所述基因诊断试剂盒使用方法，其特征是，所述PCR产物的酶切鉴定有以下步骤：

1)在200μl的所述PCR薄壁管中加入如下酶切反应体系，5μl PCR产物、1μl10倍缓冲液、1ul10U/ul TscAI酶加水至15μl，65℃消化2.5h；

2)酶切结果鉴定，全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型，分型依据为，酶切产物为119bp和101bp两条带则为TT基因型，酶切产物为225bp则为CC基因型，三条带的则为杂合型CT。