CN104293905A - 一种用于检测鸡青胫性状连锁snp位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物、试剂盒及检测方法,属于生物检测技术领域。本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点,在其附近的DNA片段设计引物对P,PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切,若该突变位点为G,存在BamHI酶切序列GGATCC,则PCR产物酶切后片段为263bp;若该突变位点为T,不存在BamHI酶切序列GGATCC,则PCR产物酶切后片段为317bp。与SSCP和直接测序法相比,该检测方法操作简便,成本低、周期短,能大大提高SNP位点基因型判定的准确性,不需要特殊的仪器,易推广普及。试验表明该方法能有效判定鸡青胫性状SNP位点的基因型,可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择,为青胫鸡群的建立提供有效的分子标记。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物,以及包含该引物的试剂盒,同时还涉及检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,属于生物检测技术领域。
背景技术
随着城市卫生的规范管理和环境控制要求的严格,大中城市农贸市场活禽销售量将逐渐减少,白条鸡和分割鸡形式上市的肉鸡产品份额将不断增加。对于冷鲜鸡市场来说,优质鸡区别于快大肉鸡的显著标识显得异常重要。我国的地方鸡常具有青胫的特征,因此人们常常以白条鸡胫色来进行判定,所以青胫鸡在品种的培育中具有重要意义。
对于鸡青胫基因位点,青胫鸡分为纯合型和杂合型两种类型。我们在青胫鸡的育种中需要选育出纯合青胫基因型,来满足的育种需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体在青胫位点的基因型,这对我们育种来说是非常重要和必要的。
近年来,人们发展了多种用于探寻分子遗传标记的方法,最常见的有限制性内切酶片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、单链构象多态技术(SSCP)和直接测序技术等,但SSCP操作繁琐、耗时长,结果易造成误判;而直接测序技术的成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物。
同时,本发明还提供一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒。
最后,本发明还提供一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物,包括引物对P:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’(如SEQ ID NO.1所示),
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,主要包括引物对P:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
具体的,用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,还可以包括2×Taq PCRMaster Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+及缓冲液)、内切酶BamHI、1×NEBuffer3.1(含NaCl、Mg2+、BSA及缓冲液)、超纯水及DNA Marker等。
更具体的,用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,包括:引物对P20μL、2×Taq PCR Master Mix(含22mM Tris-HCl(pH8.4),55mM KCl,1.65mM MgCl2,220μMdGTP,220μM dATP,220μM dTTP,220μM dCTP,22U重组Taq DNA聚合酶/ml)1mL、10U/μL内切酶BamHI50μL、1×NEBuffer3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml BSA)200μL、灭菌超纯水500μL及DNA Marker(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)30μL。
一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,包括以下步骤:
(1)以待检测鸡全基因组DNA为模板,采用引物对P进行PCR扩增,得到扩增片段;
(2)取扩增片段进行BamHI酶切,酶切产物电泳后根据电泳结果判定鸡青胫基因型;
所述步骤(1)中引物对P为:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
所述步骤(1)中待检测鸡全基因组DNA可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。
所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系为:2×Taq PCR Master Mix6.25μL,ddH2O4.25μL,P-F0.5μL,P-R0.5μL,DNA模板1.0μL。
所述的2×Taq PCR Master Mix的组分为:22mM Tris-HCl(pH8.4)、55mM KCl、1.65mMMgCl2、220μM dGTP、220μM dATP、220μM dTTP、220μM dCTP、22U重组Taq DNA聚合酶/ml。
所述步骤(1)中PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
所述步骤(2)中BamHI酶切的反应体系为:步骤(1)的扩增片段10μL,1×NEBuffer3.11.5μL,10U/μL BamHI0.5μL,ddH2O3.0μL。
所述的1×NEBuffer3.1的组分为:100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA。
所述步骤(2)中BamHI酶切的反应条件为:温度37℃,酶切时间15min。
所述步骤(2)中电泳采用质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。
所述步骤(2)中电泳的条件为:电压120V,电泳时间40min。
所述步骤(2)中判定鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法为:TT基因型表现为317bp条带;TG基因型表现为317bp和264bp条带;GG基因型表现为264bp。
本发明的有益效果:
本发明针对鸡青胫性状特有的一个SNP位点,在其附近的DNA片段设计引物对P,PCR扩增后对扩增产物进行BamHI酶切,若该突变位点为G(如SEQ ID NO.3所示),存在BamHI酶切序列GGATCC,则PCR产物酶切后片段为263bp;若该突变位点为T(如SEQ ID NO.4所示),不存在BamHI酶切序列GGATCC,则PCR产物酶切后片段为317bp。
本发明用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒使用方便,便于携带,可根据PCR产物酶切后片段的电泳结果判定鸡青胫性状的基因型。对于鸡青胫性状连锁SNP位点为TT的个体,PCR产物酶切前后,片段为317bp;鸡青胫性状连锁SNP位点为TG的个体,PCR产物酶切前后,片段为317bp和263bp;SNP位点为GG的个体,PCR产物酶切前后,片段为263bp。
本发明通过对待测鸡进行翅静脉采血,提取基因组DNA,采用引物对P进行PCR扩增,对扩增产物进行BamHI37℃酶切15min,酶切产物电泳后根据电泳结果判定SNP位点的基因型。与SSCP和直接测法相比,本发明建立的分子生物学方法操作更加简便,成本低、周期短,能大大提高SNP位点基因型判定的准确性,不需要特殊的仪器,易推广普及。试验表明该方法能有效判定鸡青胫性状,可用于鸡青胫性状分子标记辅助选择,为青胫鸡群的建立提供有效的分子标记。
附图说明
图1为本发明实施例3中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意图;
图2为实施例3中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点的PCR引物位置和扩增产物中突变位点位置的示意图;
图3为实施例3中各样本在鸡青胫性状连锁SNP位点的酶切电泳图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明,但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物,包括引物对P:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
实施例2
本实施例中用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,包括:引物对P20μL、2×Taq PCR Master Mix(含22mM Tris-HCl(pH8.4),55mM KCl,1.65mM MgCl2,220μMdGTP,220μM dATP,220μM dTTP,220μM dCTP,22U重组Taq DNA聚合酶/ml)1mL、10U/μL内切酶BamHI50μL、1×NEBuffer3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml BSA)200μL、灭菌超纯水500μL及DNA Marker(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)30μL;
所述的引物对P为:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
实施例3
本实施例中检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的技术流程示意图如图1所示,具体方法包括以下步骤:
(1)试样的制备与保存
河南农业大学种鸡场固始鸡24只、丝羽乌骨鸡24只、海赛克斯A系24只、丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系正交F1代24只和反交F1代24只,翅静脉采血,加1/3抗凝剂,用蛋白酶K法提取血液DNA,将DNA样品保存于4℃冰箱保存备用;
(2)以待检测鸡全基因组DNA为模板,采用引物对P进行PCR扩增,得到扩增片段;
引物对P为:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’;
PCR扩增的反应体系为:12.5μL体系,2×Taq PCR Master Mix(含22mM Tris-HCl(pH8.4),55mM KCl,1.65mM MgCl2,220μM dGTP,220μM dATP,220μM dTTP,220μM dCTP,22U重组Taq DNA聚合酶/ml)6.25μL,ddH2O4.25μL,P-F0.5μL,P-R0.5μL,DNA模板1.0μL;
PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存;
(3)取扩增片段进行BamHI酶切,酶切反应体系为:步骤(2)的扩增片段10μL,1×NEBuffer3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/ml BSA)1.5μL,10U/μL BamHI0.5μL,ddH2O3.0μL;酶切反应条件为:温度37℃,酶切时间15min;
(4)取8μL PCR扩增后的酶切产物,1.5%的琼脂糖凝胶电泳(电泳条件为:电压120V,电泳时间40min)点样,凝胶成像系统检测,电泳图谱详见图3(图中编号说明如下:2~5、7为TT基因型,1、6为TG基因型,8为GG基因型,M为DNA Marker);
(5)根据电泳图谱中出现的条带的大小判定鸡青胫基因位点的基因型:若只有263bp的片段,则为黄(白)胫纯合子(表型为黄(白)胫);若只有317bp的片段,则为青胫纯合子(表型为青胫);若既有263bp又有317bp的片段,则为青胫杂合子(表型为青黄(白)胫);试验结果如下表1所示。
表1待测鸡在青胫位点的判型结果
注:S×A正交为丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系正交F1代;A×S反交为丝羽乌骨鸡与海赛克斯A系反交F1代。
Claims (10)
1.一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的引物,其特征在于:包括引物对P:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
2.一种用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,其特征在于:主要包括引物对P:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,其特征在于:还包括2×Taq PCR Master Mix、内切酶BamHI、1×NEBuffer3.1、超纯水及DNAMarker。
4.根据权利要求3所述的用于检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的试剂盒,其特征在于:包括引物对P20μL、2×Taq PCR Master Mix1mL、10U/μL内切酶BamHI50μL、1×NEBuffer3.1200μL、灭菌超纯水500μL及DNA Marker30μL。
5.一种检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)以待检测鸡全基因组DNA为模板,采用引物对P进行PCR扩增,得到扩增片段;
(2)取扩增片段进行BamHI酶切,酶切产物电泳后根据电泳结果判定鸡青胫基因型;
所述步骤(1)中引物对P为:
上游引物P-F:5’-AATCCAACCAACCAACCAA-3’,
下游引物P-R:5’-TTGCTGTTACACCATCATCT-3’。
6.根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:所述步骤(1)中PCR扩增的反应体系为:2×Taq PCR Master Mix6.25μL,ddH2O4.25μL,P-F0.5μL,P-R0.5μL,DNA模板1.0μL。
7.根据权利要求6所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:所述步骤(1)中PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
8.根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:所述步骤(2)中BamHI酶切的反应体系为:步骤(1)的扩增片段10μL,1×NEBuffer3.11.5μL,10U/μL BamHI0.5μL,ddH2O3.0μL。
9.根据权利要求8所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:所述步骤(2)中BamHI酶切的反应条件为:温度37℃,酶切时间15min。
10.根据权利要求5所述的检测鸡青胫性状连锁SNP位点基因型的方法,其特征在于:所述步骤(2)中判定鸡青胫基因型的方法为:TT基因型表现为317bp条带;TG基因型表现为317bp和264bp条带;GG基因型表现为264bp。
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CN104293905B (zh) | 2016-06-01 |
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