CN112626224A - 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 - Google Patents
一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112626224A CN112626224A CN202011357106.9A CN202011357106A CN112626224A CN 112626224 A CN112626224 A CN 112626224A CN 202011357106 A CN202011357106 A CN 202011357106A CN 112626224 A CN112626224 A CN 112626224A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- activity
- primer
- probe
- eggs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 title claims abstract description 70
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 title claims abstract description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 87
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 230000014155 detection of activity Effects 0.000 claims 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 101000836383 Homo sapiens Serpin H1 Proteins 0.000 description 11
- 102100027287 Serpin H1 Human genes 0.000 description 11
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 9
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 7
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 4
- 101150018337 Serpinh1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000835023 Homo sapiens Transcription factor A, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 102100026155 Transcription factor A, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 102100031649 Cytochrome c oxidase subunit 6B1 Human genes 0.000 description 2
- 101150097459 HSP90 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 description 2
- 101000922367 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 6B1 Proteins 0.000 description 2
- 101001080568 Homo sapiens Heat shock cognate 71 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 102000017946 PGC-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700038399 PGC-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000006677 mitochondrial metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000277334 Oncorhynchus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用。本申请的活性检测试剂包括第一引物探针组和/或第二引物探针组中的至少一组；第一引物探针组的上下游引物和探针分别为Seq ID No.1、2和3所示序列；第二引物探针组的上下游引物和探针分别为Seq ID No.4、5和6所示序列；两个探针5’端具有相同或不同的荧光基团，3’具有荧光淬灭基团。本申请的试剂和方法，只需对待测鲑科鱼发眼卵的核酸进行实时荧光PCR，即可检测鲑科鱼发眼卵的活性；相比于形态学鉴定，本申请的试剂和方法，能更准确的判断鱼卵活性。本申请的试剂和方法为鲑科鱼发眼卵活性检测提供了一种新方案和途径，对鲑科鱼养殖生产具有重要意义。
Description
技术领域
本申请涉及鱼卵活性检测技术领域，特别是涉及一种鲑科鱼发眼卵的活性 检测试剂、方法及应用。
背景技术
鲑科鱼类是大、中型的冷水鱼类，共有15属67种。根据2010年的统计数 据，全球鲑科鱼养殖品种主要涉及5属13种，养殖产量达到240万吨以上，且 每年稳步上升。其中大西洋鲑(Salmo salar)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是 最主要的种类，分别占总产量的61.7％和29.6％。
大西洋鲑(S.salar)俗称“三文鱼”，属于鲑科(Salmonidae)鲑属(Salmo)。 自然栖息地是大西洋北部，即北美东北部、欧洲的斯堪的纳维亚半岛沿岸，是 一种营养价值高的养殖鱼类。挪威、智利、加拿大、法罗群岛及俄罗斯等都是 大西洋鲑的主要养殖地。
虹鳟（O.mykiss）属于鲑科（Salmonidae）太平洋鲑属（Oncorhynchus）。自然栖息地是北美洲的太平洋沿岸及堪察加半岛一带。美国、日本、丹麦等是虹鳟主要的养殖地。
鲑科鱼发眼卵的卵径多为4.2～6.5mm，重70～120mg，颜色为橘红色至鲜红 色，可见两淡黑色眼点。质量较好的鱼卵一般卵径较大，大小均匀，色泽鲜亮。 鲑科鱼发眼卵对高温敏感，一般最适合的孵化温度为7-13℃。鲑鱼卵的发育情 况常用积温来表示，即温度×天数，积温达到一定数量才会孵化；因此，在孵化 温度合适的前提下，温度越高，时间越短。但是，温度过高又会引起鲑科鱼发 眼卵的活性下降，甚至死亡。
鲑科鱼发眼卵在长期运输过程中，保证低温是重要的环节，因为即使是室 温25℃，对于鲑科鱼卵也是热激温度，易引起活性的下降和死亡的增加。目前， 国内外关于鲑科鱼卵活性的研究较少。现有普遍采用的鲑科鱼卵检测主要是形 态学鉴定，通过观察鱼卵的色泽、大小、状态等判断鱼卵的活性。形态学鉴定 存在很强的主观性，对检测人员的技术和经验要求也较高；因此，亟需研发一 种更加有效的鲑科鱼发眼卵活性检测方案，以满足日益增长的鲑科鱼养殖和生 产需求。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂，其包括第一引 物探针组和/或第二引物探针组；第一引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq IDNo.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；第二引物探针组 的上下游引物分别为SeqID No.4和Seq ID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6 所示序列；
Seq ID No.1：5’-GAGGTCAGCGACCCAAAGAC-3’
Seq ID No.2：5’-GCCGTAGAGGCGGTTACTGAT-3’
Seq ID No.3：5’-CGGAACGTCACATGGA-3’
Seq ID No.4：5’-TTGGATGACCCTCAGACACACT-3’
Seq ID No.5：5’-CGTCAATACCCAGGCCTAGCT-3’
Seq ID No.6：5’-CCGAATCTACCGGATGAT-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的探针和Seq ID No.6所示序列的探针，两者的 5’端具有相同或不同的荧光基团，两者的3’具有荧光淬灭基团。
需要说明的是，本申请的试剂可以直接通过第一引物探针组和第二引物探 针组，对待测对象的HSP47(即SERPINH1)、HSP90，两个基因进行检测，根 据这两个基因的表达情况，判断鲑科鱼发眼卵的活性。与现有的形态学鉴定相 比，采用本申请的试剂进行活性判断，只需要进行实时荧光PCR操作即可，对 检测人员的技术或经验要求较低；并且，直接根据实时荧光PCR的结果进行鲑 科鱼发眼卵活性判断，结果更准确，解决了形态学鉴定的主观依赖性问题。
还需要说明的是，本申请的第一引物探针组和第二引物探针组，两者可以 单独用于鱼卵活性检测；因此，两者探针的荧光基团可以相同；至于淬灭基团 根据相应的荧光基团进行常规选择即可。当然，如果两者用于同一反应进行多 重实时荧光PCR；则两者探针的荧光基团必须不同，才能有效区分两者的荧光 信号；在此不作具体限定。
本申请的一种实现方式中，本申请的活性检测试剂还包括第三引物探针组， 第三引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列，探 针为Seq IDNo.9所示序列；
Seq ID No.7：5’-CCAAAGCCAACAGGGAGAAG-3’
Seq ID No.8：5’-AGGGACAACACTGCCTGGAT-3’
Seq ID No.9：5’-TGACCCAGATCATGTTT-3’
Seq ID No.9所示序列的探针的5’端具有与Seq ID No.3所示序列的探针和 SeqID No.6所示序列的探针相同或不同的荧光基团，Seq ID No.9所示序列的探 针的3’具有荧光淬灭基团。
需要说明的是，本申请的第三引物探针组是内参基因β-Actin的特异性检测 引物和探针，一方面，增加内参基因的检测，可以判断实时荧光PCR扩增的有 效性，增加检测结果的准确性；另一方面，内参基因检测配合本申请的第一引 物探针组和第二引物探针组的靶标基因检测，可以计算靶标基因的相对表达量， 从而更有效的进行鲑科鱼发眼卵活性判断。
本申请的另一方面公开了本申请的活性检测试剂在鲑科鱼发眼卵活性检测 中的应用。
本申请的再一方面公开了一种鲑科鱼发眼卵的活性检测方法，包括采用本 申请的活性检测试剂对提取自待测鲑科鱼发眼卵的核酸进行实时荧光PCR检 测，根据实时荧光PCR检测结果判断待测鲑科鱼发眼卵的活性。
本申请的一种实现方式中，本申请的活性检测方法还包括根据第一引物探 针组、第二引物探针组和第三引物探针组的检测Ct值判断待测鲑科鱼发眼卵的 活性，具体的，
条件1，第三引物探针组的检测Ct值小于或等于25；
条件2，第二引物探针组的检测Ct值小于或等于30；
条件3，第一引物探针组的检测Ct值减去第三引物探针组的检测Ct值，两 者的差小于或等于2；
条件1不成立，则实验不成立，需要重新进行检测；
在条件1成立的前提下，条件2和条件3同时成立，则说明待测鲑科鱼发 眼卵曾受热激，活性受到影响；
在条件1成立的前提下，条件2或条件3不成立，则说明待测鲑科鱼发眼 卵的活性没有受到影响。
本申请的有益效果在于：
本申请的鲑科鱼发眼卵活性检测试剂和方法，只需要对待测鲑科鱼发眼卵 的核酸进行实时荧光PCR，即可进行鲑科鱼发眼卵的活性判断；相比于形态学 鉴定，本申请的试剂和方法，能够更准确的判断鱼卵活性。本申请的试剂和方 法为鲑科鱼发眼卵活性检测提供了一种新的方案和途径，对鲑科鱼的养殖生产 具有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中对照组发眼卵的形态观察图；
图2是本申请实施例中热处理组发眼卵的形态观察图；
图3是本申请实施例中热处理组各基因相对表达量的分析结果；
图4是本申请实施例中发眼卵死亡10h的形态观察图；
图5是本申请实施例中发眼卵死亡20h的形态观察图；
图6是本申请实施例中发眼卵死亡10h和20h的鱼卵mRNA降解情况分析 结果。
具体实施方式
目前的鲑科鱼发眼卵活性检测仍然以形态学鉴定为主，形态学鉴定可以区 分已经死亡一段时间的鱼卵跟具有活性的鱼卵；但是，对于活性较低，或者新 鲜死亡的鲑科鱼发眼卵则无法判断。例如，本申请的一种实现方式中，对于死 亡10h内的鲑科鱼发眼卵，其形态特征几乎与正常活性鱼卵没有区别；根本无 法将死亡鱼卵有效的区分开来。因此，如何更有效、准确的鉴定鲑科鱼发眼卵 的活性，对于鲑科鱼的养殖生产具有重要意义。
基于以上研究和认识，本申请创造性的提出，可以根据具有活性的鲑科鱼 发眼卵与死亡鱼卵之间某些基因表达差异，判断鲑科鱼发眼卵的活性。因此， 本申请研发了一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂，其包括第一引物探针组和/或 第二引物探针组；第一引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；第二引物探针组的上下游引物分 别为Seq ID No.4和Seq ID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列。
采用本申请的试剂，对鲑科鱼发眼卵的HSP47、HSP90，两个基因进行检测， 根据这两个基因的表达情况，判断鲑科鱼发眼卵的活性。采用本申请的试剂进 行鲑科鱼发眼卵活性检测，即便是新鲜死亡的鲑科鱼发眼卵也能准确有效的鉴 定出来，对鲑科鱼的养殖生产具有重要意义。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。以下实施例中，除非特别限定 或说明，其它未明确指出的步骤或试剂，可参考现有技术。
实施例
一、材料与方法
1.样品来源
本例采用的虹鳟的发眼卵进行活性研究，虹鳟发眼卵由青海省渔业环境监 测站惠赠。
2.样品的处理
虹鳟发眼卵于8℃放置24h后，分成对照组和热处理组。对照组一直置于 8℃，热处理组于25℃放置3h，从两组中随机挑取各30颗进行试验，剩余的发 眼卵置于8℃，隔日观察孵化情况。对于死亡的发眼卵，取死亡10h和20h的发 眼卵作形态学和mRNA降解情况分析。其中，死亡10h和20h仍然是置于25℃ 的环境下。
3.引物探针
本例根据虹鳟的热激蛋白基因HSP47(即SERPINH1)、HSC71、HSP90， 和线粒体基因TFAM、PGC-1α、COX6B1，设计特异性检测引物和探针；并设 计内参基因β-Actin的特异性检测引物和探针。本例设计的引物和探针序列如表 1所示，所有引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1各基因的特异性检测引物和探针
表1中，SERPINH1-F表示SERPINH1基因的上游引物，SERPINH1-R表示 SERPINH1基因的下游引物，SERPINH1-P表示SERPINH1基因的探针，其余类 同。
4.mRNA提取与cDNA合成
剖取发眼卵中的胚胎，每2条作为1个样品。mRNA的提取采用Trizol法。 提取好的mRNA使用NanoDrop 2000测浓度和纯度，质量通过后，取1μg去除 基因组DNA后，使用Qubit4测mRNA完整性，完整性评分大于8.5的，进行 反转录合成cDNA。去除基因组DNA和反转录均使用PrimeScriptRTreagentKit with gDNAEraser(Takara)。
5.实时荧光PCR
实时荧光PCR试剂盒使用ThunderbirdProbe qPCRMix(TOYOBO)，设备 使用ABIQuantStudio 3。20μL反应体系包括：cDNA2μL、qPCRMix 10μL、Rox reference Dye 0.4μL、10μM的F/R引物各0.6μL、10μM的探针0.4μL、ddH2O 6μL。 反应条件：95℃1min；然后进入40个循环：95℃15s，56℃30s；在56℃时收 集荧光。每个样品做3个重复。
6.数据处理
以β-Actin作为内参基因，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。采用 SPSS23.0对数据进行统计分析，采用卡方检验分析孵化率的差异显著性，采用 t检验分析基因表达量的差异显著性。
二、结果
1.形态变化
本例从形态学上观察对照组和热处理组的发眼卵，结果如图1和图2所示， 图1为对照组的发眼卵，图2为热处理组的发眼卵。图1和图2的结果显示， 从发眼卵的形状、色泽来看，对照组和热处理组没有明显的差异。
2.孵化情况
统计分析了热处理7天后的孵化情况，结果如表2所示。采用卡方检验分 析孵化率，结果如表3所示。
表2对照组和热处理组孵化情况
表3对照组和热处理组孵化率
| 孵化 | 死亡 | 总计 | |
| 热处理组 | 90(90％) | 10(10％) | 100 |
| 对照组 | 88(98.9％) | 1(1.1％) | 89 |
表2和表3的结果显示，热处理组在后续的孵化速度较对照组增快，特别 是第3天，孵化率是对照组的2.1倍，但到第5天孵化率已经基本持平，最终孵 化率比对照组低，经卡方检验，结果如表3所示，P＜0.05，显示热处理组的孵 化率仅为90％和对照组98.9％的最终孵化率有显著性差异。
3.基因表达
对于HSP90基因，在对照组(n＝15)均未检出，在热处理组(n＝15)均检 出，且Ct＜30。对于其它基因的表达情况，统计分析结果如图3所示，图3为 热处理组各基因相对表达量数据，表示为均值+标准误，“*”表示P＜0.01。图3 的结果显示，SERPINH1的表达量相当于对照组显著性升高到6.96±1.15倍，P ＜0.01；HSC71升高到3.75±1.73倍，无显著性差异；而TFAM、PGC-1α与COX6B1 的变化不明显，且无显著性差异。
4.死亡鱼卵分析
对死亡的鱼卵进行形态观察，结果显示，死亡10h鱼卵的形态与对照组无 明显差异，如图4所示；但是，死亡20h的鱼卵可见颜色明显发白，透明度降 低，个别出现破裂、内容物溢出现象，如图5所示。
以β-Actin、TFAM和SERPINH1的mRNA作为研究指标，发现三个基因的 mRNA的降解程度相近，趋势一致。对于死亡10h，三个基因相对对照组的量分 别为29％±6％，40％±1％和39％±4％；对于死亡20h，三个基因相对对照组的量 分别为1.7％±0.23％，2.4％±0.18％和0.97％±0.16％，如图6所示。
三、讨论和结论
鲑科鱼发眼卵的活性是很复杂的综合性指标，本试验选取了在实际运输过 程中常见的温度影响因素加以研究，作为影响其活性的研究出发点。
从实验结果可以看出，热处理，即25℃放置3h，引起了孵化情况的较大变 化，鱼卵的孵化速度有所增加，因为鲑科鱼发眼卵的孵化需要的是积温，即温 度×时间，温度的提高能缩短所需的时间，但最终孵化率呈显著性下降，从98.9％ 降至90％，说明热处理会对鲑科鱼发眼卵的活性造成较大影响。从形态上观察， 热处理组与对照组没有明显的变化，因此不能以此作为判断方法。在基因表达 量变化方面，本研究选取了热激蛋白基因以及线粒体代谢相关基因作为研究对 象。结果表明，热激蛋白基因表达均有增加，其中SERPINH1基因是显著性增 加，HSP90基因仅在热处理组有检出，而线粒体代谢相关基因则没有显著性的 变化。这说明采用本例的引物和探针检测SERPINH1和HSP90，这两个基因的 表达情况，能够作为鲑科鱼发眼卵活性参考依据。
因此，本例将检测SERPINH1和HSP90的引物探针组作为鲑科鱼发眼卵的 活性检测试剂。理论来说，检测这两个基因的引物探针组可以单独使用，单独 检测这两个基因都能够起到活性检测的目的；但是，为了确保活性检测的准确 性和有效性，建议两个基因同时进行检测，可以起到相互印证的作用；并且， 配合参考基因β-Actin的检测引物探针组，可以更好的对两个基因的相对表达量 进行分析，从而提高发眼卵活性检测结果的准确性和有效性。此外，参考基因 β-Actin的检测，还可以判断整个试验过程是否有效。
根据SERPINH1、HSP90和β-Actin对鱼卵的检测情况，本例进一步的提出 按照以下方法进行活性判断：
条件1，β-Actin的检测Ct值小于或等于25；
条件2，HSP90的检测Ct值小于或等于30；
条件3，SERPINH1的检测Ct值减去β-Actin的检测Ct值，两者的差小于或 等于2；
条件1不成立，则实验不成立，需要重新进行检测；
在条件1成立的前提下，条件2和条件3同时成立，则说明待测鲑科鱼发 眼卵曾受热激，活性受到影响；
在条件1成立的前提下，条件2或条件3不成立，则说明待测鲑科鱼发眼 卵的活性没有受到影响。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认 定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳海关动植物检验检疫技术中心
<120> 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用
<130> 20I30866
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaggtcagcg acccaaagac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccgtagagg cggttactga t 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggaacgtca catgga 16
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttggatgacc ctcagacaca ct 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgtcaatacc caggcctagc t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgaatctac cggatgat 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaaagccaa cagggagaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agggacaaca ctgcctggat 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgacccagat catgttt 17
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttagggacg ccaagatgga 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagcctccca ccaggacaa 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aagcccaggt ccacgac 17
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acatcttcat ggcagaacac tttga 25
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agtcctcccg cagcatct 18
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcttgccctg cgtggtcgtc cct 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcaccgagct gctcaagtac 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgctcttggc ttcgctgg 18
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
accgccaccg acgacatcct cctcc 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gccccgtgtg actggtataa g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcgtcccatt tctggatcca 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tctacaaatc actgtgccc 19
Claims (5)
1.一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂，其特征在于：包括第一引物探针组和/或第二引物探针组；
所述第一引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；
所述第二引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.4和Seq ID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-GAGGTCAGCGACCCAAAGAC-3’
Seq ID No.2：5’-GCCGTAGAGGCGGTTACTGAT-3’
Seq ID No.3：5’-CGGAACGTCACATGGA-3’
Seq ID No.4：5’-TTGGATGACCCTCAGACACACT-3’
Seq ID No.5：5’-CGTCAATACCCAGGCCTAGCT-3’
Seq ID No.6：5’-CCGAATCTACCGGATGAT-3’
Seq ID No.3所示序列的探针和Seq ID No.6所示序列的探针，两者的5’端具有相同或不同的荧光基团，两者的3’具有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的活性检测试剂，其特征在于：还包括第三引物探针组，所述第三引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列，探针为Seq IDNo.9所示序列；
Seq ID No.7：5’-CCAAAGCCAACAGGGAGAAG-3’
Seq ID No.8：5’-AGGGACAACACTGCCTGGAT-3’
Seq ID No.9：5’-TGACCCAGATCATGTTT-3’
Seq ID No.9所示序列的探针的5’端具有与Seq ID No.3所示序列的探针和Seq IDNo.6所示序列的探针相同或不同的荧光基团，Seq ID No.9所示序列的探针的3’具有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1或2所述的活性检测试剂在鲑科鱼发眼卵活性检测中的应用。
4.一种鲑科鱼发眼卵的活性检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1或2所述的活性检测试剂对提取自待测鲑科鱼发眼卵的核酸进行实时荧光PCR检测，根据实时荧光PCR检测结果判断待测鲑科鱼发眼卵的活性。
5.根据权利要求4所述的活性检测方法，其特征在于：包括根据第一引物探针组、第二引物探针组和第三引物探针组的检测Ct值判断待测鲑科鱼发眼卵的活性，具体的，
条件1，第三引物探针组的检测Ct值小于或等于25；
条件2，第二引物探针组的检测Ct值小于或等于30；
条件3，第一引物探针组的检测Ct值减去第三引物探针组的检测Ct值，两者的差小于或等于2；
条件1不成立，则实验不成立，需要重新进行检测；
在条件1成立的前提下，条件2和条件3同时成立，则说明待测鲑科鱼发眼卵曾受热激，活性受到影响；
在条件1成立的前提下，条件2或条件3不成立，则说明待测鲑科鱼发眼卵的活性没有受到影响。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011357106.9A CN112626224A (zh) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011357106.9A CN112626224A (zh) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112626224A true CN112626224A (zh) | 2021-04-09 |
Family
ID=75307392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011357106.9A Pending CN112626224A (zh) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112626224A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2098482A1 (en) * | 1991-01-08 | 1992-07-09 | Per O. Heggelund | Transporting, incubating, and growing of aquatic creatures |
| CN103270987A (zh) * | 2013-06-04 | 2013-09-04 | 山东省海水养殖研究所 | 一种斑点鳟的苗种培育方法 |
| CN103493769A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-08 | 通威股份有限公司 | 中性杀菌电化水在孵化鱼卵中的应用 |
| CA2967261A1 (en) * | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Aqua Gen As | Method for predicting resistance |
| CN106282377A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-01-04 | 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 | 一种转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测引物、检测方法和试剂盒 |
| WO2018089391A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Dots Technology Corp. | Allergen detection agents and assays |
| CN109554488A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-04-02 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 雌性施氏鲟特异dna片段及应用 |
-
2020
- 2020-11-27 CN CN202011357106.9A patent/CN112626224A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2098482A1 (en) * | 1991-01-08 | 1992-07-09 | Per O. Heggelund | Transporting, incubating, and growing of aquatic creatures |
| CN103270987A (zh) * | 2013-06-04 | 2013-09-04 | 山东省海水养殖研究所 | 一种斑点鳟的苗种培育方法 |
| CN103493769A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-08 | 通威股份有限公司 | 中性杀菌电化水在孵化鱼卵中的应用 |
| CA2967261A1 (en) * | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Aqua Gen As | Method for predicting resistance |
| CN106282377A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-01-04 | 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 | 一种转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光PCR检测引物、检测方法和试剂盒 |
| WO2018089391A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Dots Technology Corp. | Allergen detection agents and assays |
| CN109554488A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-04-02 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 雌性施氏鲟特异dna片段及应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| AKBARZADEH A 等: "Developing specific molecular biomarkers for thermal stress in salmonids", 《BMC GENOMICS》, vol. 19, no. 1, 16 October 2018 (2018-10-16), pages 4, XP021261608, DOI: 10.1186/s12864-018-5108-9 * |
| MAHANTY, A等: "hsp90 and hsp47 appear to play an important role in minnow Puntius sophore for surviving in the hot spring run-off aquatic ecosystem", 《FISH PHYSIOL BIOCHEM》, 13 August 2016 (2016-08-13) * |
| 常东洲 等: "《特种鱼类高效养殖指南》", 30 September 1999, pages: 9 * |
| 王艳妮: "热应激对虹鳟免疫指标及热休克蛋白基因HSP47 mRNA 表达的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (农业科技辑)》, no. 8, 15 August 2016 (2016-08-15), pages 37 * |
| 白海锋 等: "三倍体虹鳟鱼发眼卵的孵化与培育", 《水产养殖》 * |
| 白海锋 等: "三倍体虹鳟鱼发眼卵的孵化与培育", 《水产养殖》, vol. 39, no. 9, 1 September 2019 (2019-09-01), pages 5 * |
| 菅玉霞 等: "温度、 盐度对斑点鳟发眼卵孵化的影响", 《海洋科学》, vol. 38, no. 9, 15 September 2014 (2014-09-15), pages 1 - 2 * |
| 辛苑茹 等: "急性高温胁迫对虹鳟二倍体和三倍体幼鱼hsps基因表达的影响", 《中国海洋大学学报(自然科学版)》, vol. 49, no. 3, 2 February 2019 (2019-02-02) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106719114B (zh) | 暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法 | |
| CN102134593B (zh) | 半滑舌鳎性别特异微卫星标记及其在超雌鱼鉴定中的应用 | |
| CN101911918B (zh) | 牙鲆抗病优良品系选育方法 | |
| CN103898107A (zh) | 影响猪生长性状的主效snp标记及其在种猪生产性能遗传改良中的应用 | |
| CN106381331B (zh) | 草鱼生长速度相关的snp标记及其应用 | |
| CN113502333B (zh) | 一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c42257及其应用 | |
| CN111394445B (zh) | 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用 | |
| CN106818552B (zh) | 一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法 | |
| CN109337988A (zh) | 一种与enu诱变草鱼家系生长特性相关连的snp标记及检测引物 | |
| CN109997788B (zh) | 一种矮小型黄羽黄胫鸡的选育方法 | |
| Brown | Genetic management and selective breeding in farmed populations of gilthead seabream (Sparus aurata) | |
| CN107365872B (zh) | 鉴定绥芬河三块鱼不同洄游群体的方法 | |
| CN102382878B (zh) | 一种鉴别建鲤不同家系的分子标记方法 | |
| US20210189472A1 (en) | Sexual maturation in rainbow trout | |
| CN104962660B (zh) | 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用 | |
| CN108432671B (zh) | 一种利用回交育种创制黄颡鱼新品系的方法 | |
| CN112626224A (zh) | 一种鲑科鱼发眼卵的活性检测试剂、方法及应用 | |
| Çakmak et al. | Triploid Black Sea Trout (Salmo labrax Pallas, 1814) induced by heat shock and evaluation of triploidy with different techniques | |
| Sørensen et al. | Ichthyodinium identified in the eggs of European eel (Anguilla anguilla) spawned in captivity | |
| CN112280871B (zh) | 一种珠星三块鱼特异性dna分子标记及其应用 | |
| CN105969745B (zh) | 鱼类低氧耐受基因及其用途 | |
| CN113502334B (zh) | 一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c27449及其应用 | |
| CN105603097A (zh) | 用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用 | |
| CN109439762B (zh) | 鉴定珠星三块鱼和三块鱼的分子标记和方法 | |
| CN111593129A (zh) | 白梭吻鲈家系鉴定用引物及白梭吻鲈家系鉴定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210409 |