CN112575011A - 一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法及生物酶 - Google Patents

一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法及生物酶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物合成及酶工程技术领域，尤其是一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法及生物酶，该方法由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物I，其反应路线为，

Description

一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法及生物酶
技术领域
本发明涉及药物合成及酶工程技术领域，具体领域是一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法。
背景技术
纳呋拉啡(Nalfurafine)，成品通常为其盐酸盐，2019年9月16日获得我国药品监督管理局批准，进入临床试验阶段。纳呋拉啡的分子量：476.6；CAS登记号：152657-84-6，其结构式如下所示：
Figure BDA0002834766580000011
Nalfurafine是原研公司是日本的Toray，是一款kappa opioid receptor(KOR)受体激动剂。其软胶囊剂型已自2009年起于日本出售，其口腔崩解片更方便患者服用，于2017年在日本获批并推出。血液透析患者所患的瘙痒症属于非发炎性，十分普遍且症状严重。包括抗组胺药在内的传统止痒剂在多数情况下无法抑制瘙痒。数据显示，尿毒症瘙痒在透析前患者中发病率为15％-49％，而在血液透析及腹膜透析患者中发病率为50％-90％。透析预后及实践模式研究(DOPPS)的结论表明：有约42％的透析病人受中度到重度皮肤瘙痒的困扰。这不仅严重影响到患者的生活质量，若干患者甚至出现焦虑、抑郁或失眠症状。盐酸纳呋拉啡可用于治疗血液透析相关尿毒症综合征瘙痒，同时在慢性肝病患者瘙痒症的治疗中也有应用。
纳呋拉啡中手性基团的引入至关重要，在专利WO2010144641中提及了一种手性氨基的引入方法，具体路线如下：
Figure BDA0002834766580000021
该方法中手性氨基的引入需要金属钌的参与，反应条件苛刻，使用大量有机溶剂，手性催化率不高，在经济成本增加的同时，对环境造成污染。因此需要开发出一种简单易行、条件温和、对环境友好的的合成路线。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种生物酶。
本发明的第二目的在于提供上述生物酶的制备方法。
本发明的第三目的在于提供采用上述生物酶进行纳呋拉啡中间体生物合成的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生物酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述生物酶的工程菌制备方法为：
以pET-28a质粒为载体，表达所述生物酶基因。生物酶基因连接到pET-28a质粒的EcoR I和Hind III位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
具体地，将所述生物酶基因进行全合成后设计上下游引物F1、R1(如SEQ ID NO：2-3所示)进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，57℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoRI，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因tra-07与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌：Escherichia coli工程菌TRA-07。
本发明所述生物酶的制备方法，具体未，将表达生物酶的Escherichia coli工程菌TRA-07，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液。将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导16h。发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。用pH7.0，0.2M的PB缓冲液重洗后重悬，超声破碎后冻干，获得冻干酶粉。
采用本发明所述的生物酶进行纳呋拉啡中间体生物合成的方法：
由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物I，其反应路线为，
Figure BDA0002834766580000031
其中，所述化合物II和生物酶的质量比为1:1～30，优选为1:20。
其中，所述氨基供体选自丙氨酸、三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、色氨酸、丁胺或α-氨基戊二酸中的一种或几种；优选为异丙胺或丙氨酸。
其中，所述化合物II与所述氨基供体的摩尔比为1:1～10；优选为1:1～5。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选的，所述缓冲液为0.1～0.2M、pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
其中，所述助溶剂选自乙酸丁酯、甲醇、乙醇、DMSO中的任意一种，优选为DMSO；
所述化合物II与助溶剂的质量体积比为1:10～100g/ml，优选为1:10～50g/ml；
所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100，优选为1:10。
其中，所述生物酶与辅酶PLP的质量比5～30:1，优选为10～30:1。
其中，所述化合物II经生物酶催化反应时，反应温度为0～60℃；优选为20～40℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了纳呋拉啡中间体的生物合成方法，该方法解决了现有技术中纳呋拉啡化学金属催化剂的使用，解决了反应时间长、合成工艺复杂等问题，对环境友好、无污染，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
生物酶(序列详见SEQ ID NO：1)的工程菌制备方法为：
具体地，将所述生物酶基因进行全合成后设计上下游引物F1、R1(如SEQ ID NO：2-3所示)进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，57℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoRI，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因tra-07与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌：Escherichia coli工程菌TRA-07。
将表达生物酶(序列详见SEQ ID NO：1)的Escherichia coli工程菌TRA-07，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液。将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18诱导16h。发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。用pH7.0，0.2M的PB缓冲液重洗后重悬，超声破碎后冻干，获得冻干酶粉。
实施例2化合物I的制备
Figure BDA0002834766580000051
将实施例1制备的冻干酶粉首先使用95mL的缓冲液(1M异丙胺盐酸盐，pH8.0)溶解混匀，粗酶液终浓度20g/L，反应时加入含有底物的55mLDMSO，使得反应体系中化合物II终浓度1g/L。最后加入终浓度为1mM的磷酸吡哆醛和终浓度为1g/L的丙氨酸，0.1％NaOH调节pH，体系pH值为8.0，30℃反应24h后，终止反应，乙酸乙酯萃取，经液相检测化合物I产率为83％，纯度为97.3％，ee值99.1％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种纳呋拉啡中间体的生物合成方法及生物酶
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcatgaatc agtctttcgt tgaaaaatcc aagcaatatc tgtggctgcc gtttacccaa 60
atgaaagatt acgatgaaaa cccgctgatc atcgaatccg gtcagggcat caaactgaaa 120
gatatcgatg gccgtgtgta ctatgacggt ttttcctctg tatggctgaa tgtgcacggt 180
catcgtaaaa aagagctgga cgaagcgatc aagaaacagc tgggcaaaat cgcccactct 240
accctgctgg gtatgaccaa tgttccggcc acggaactgg ctgaggtgct gatcaagatc 300
actccagaga atctgacccg tgtgttctac tctgacagcg gcgctaccgc tatggaaatc 360
gctctgaaga tggcttttca gtactggaaa aatatcggca aaccggaaaa gcagaagttc 420
atctccatga aaaacggcta ccacggtgat acgattggtg ctgtgtccgt tggcgccatc 480
gaactgttcc accatgttta cggtccgctg atgtttgaat ccttcaaggt taatgttccg 540
tatgtctatc gtagcaaatc cggtaacccg gatgagtgcc gtgacgagtg tctggctgaa 600
ctggagcgcc tgctgtctga acgtcatgac gaaatcgcag ctctgtctgt tgaaagcatg 660
gttcagggtg caagcggcat gattgttatg cctgaaggtt acctggcagg tgtgcgcgaa 720
ctgtgcacca aatacgacgt gctgatgatt gtggatgaag ttgcaacggg ctttggtcgt 780
actggcaaaa tgttcgcgtg cgaacatgaa cgtgttcagc cggatctgat ggcggcaggc 840
aaagctatta ccggcggtta cctgccgatc gctgttactt tcgcgactga agagatctac 900
gaagcgtttt atgatgacta caataaactg aaaacttttt tccacggcca ctcttacacg 960
ggcaaccagc tgggctgtgc tgttgcgctg gaaaacctgc gcctgtttga atctgaaaaa 1020
atcgtggcac aggttgcaga aaagtccaag atcctggaaa gcctgttcca cgatctggca 1080
gctctgccgc acgttggtga catccgtcag ctgggtttta tgagcggtat cgaactggta 1140
cagagcaagg aaacgcgtca accgtatcca ccggaagaac gtattggcta ccgtgtgtcc 1200
ctgaaaatgc gcgaactggg catgctgact cgtccactgg gtgacgttgt tgcgtttctg 1260
cctccgctgg cgtctactgc tgatgacctg cgcgccatgg tttccatcat gaaggaagct 1320
attcaggaag tgaccggtcg tgcttat 1347
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaattcatg aatcagtctt tcgttgaaaa atc 33
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaagcttt caataagcac gaccggtcac t 31

Claims (10)

1.一种生物酶，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的生物酶的制备方法，其特征在于：将表达生物酶的Escherichiacoli工程菌TRA-07，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；
将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导16h；发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.0，0.2M的PB缓冲液重洗后重悬，超声破碎后冻干，获得冻干酶粉。
3.根据权利要求2所述的生物酶的制备方法，其特征在于：Escherichia coli工程菌TRA-07的制备方法具体为，将所述生物酶基因进行全合成后设计上下游引物F1、R1，如SEQID NO：2-3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，57℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoR I，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因tra-07与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌，即Escherichia coli工程菌TRA-07。
4.采用权利要求1所述的生物酶进行纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物I，其反应路线为，
Figure FDA0002834766570000021
5.根据权利要求4所述的纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：所述化合物II和生物酶的质量比为1:1～30，优选为1:20。
6.根据权利要求4所述的纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：所述氨基供体选自丙氨酸、三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、色氨酸、丁胺或α-氨基戊二酸中的一种或几种；优选为异丙胺或丙氨酸。
7.根据权利要求6所述的纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：所述化合物II与所述氨基供体的摩尔比为1:1～10；优选为1:1～5。
8.根据权利要求4所述的纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选的，所述缓冲液为0.1～0.2M、pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求4所述的纳呋拉啡中间体生物合成的方法，其特征在于：所述助溶剂选自乙酸丁酯、甲醇、乙醇、DMSO中的任意一种，优选为DMSO；
所述化合物II与助溶剂的质量体积比为1:10～100g/ml，优选为1:10～50g/ml；
所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100，优选为1:10；
所述生物酶与辅酶PLP的质量比5～30:1，优选为10～30:1。
10.根据权利要求4所述的纳呋拉啡中间体的生物合成方法，其特征在于：所述化合物II经生物酶催化反应时，反应温度为0～60℃；优选为20～40℃。
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Address after: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province

Applicant after: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province

Applicant before: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
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