CN112525943B - 一种采用q1H-NMR技术定量分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用定量核磁共振技术(q1H‑NMR)分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，该方法通过使用氘代二甲基亚砜(DMSO‑d6)为溶剂，3‑(三甲基甲硅烷基)丙酸‑d4钠(TMSP)为内标，以乙醇(1.10ppm)、乙酸(1.80ppm)及TMSP(0.00ppm)峰为定量信号峰，采用内标法定量计算出乙醇和乙酸的含量，本发明所公开的定量分析方法一方面解决了发酵果蔬中乙醇和乙酸的性质及含量差异大导致无法同时进行准确测定的问题，另一方面避免了因类乙酸或类乙醇化合物(沸点或酸碱度相近)对检测结果的影响导致检测结果不准确的问题，与现有技术相比该技术操作高效简便、样品前处理简单，有效的减少样品处理对测定结果的影响，检测结果准确可靠，可同时测定样品中乙醇和乙酸的含量，广泛应用到发酵果蔬产品的质量控制、定量分析检测研究中。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的测定方法，具体是一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，属于分析检测领域。
背景技术
核磁定量试验，是利用定量峰面积与对应的质子数成正相关，其测定具有不破坏样品、不依赖标准物质、样品制备简单、测试结果高效准确等优势。早期，低灵敏度是q1H-NMR技术面临的主要问题，但随着高磁场与超低温探头技术的问世，这个问题已被逐步解决。1H-NMR可以提供不同化合物、不同化学环境下质子的信号峰，这些核磁信号峰与质子所处的空间化学环境相关，这为同时测定多种化合物提供了可能。q1H-NMR技术被多国药典收录，常用于多成分的含量测定，蜂蜜、咖啡等鉴别测试、代谢组学等方面的研究。
乙醇、乙酸作为常见的化合物，广泛存在于食品、医药、工业等领域。在发酵果蔬汁生产中，乙醇、乙酸常伴随着发酵而产生，其含量直接影响发酵产品的品质、口感、香气等评价指标。在果蔬汁发酵生产中，乙醇的含量可能会直接影响发酵菌株的活性、营养成分的溶出、产品的稳定性及产品分类；乙酸与产品口感、香味等因素息息相关，因此，合理的掌控产品乙醇、乙酸的含量无论从食品安全角度还是食品风味品质方面都具有至关重要的意义。
现有技术一般是采用高效液相色谱法对发酵果蔬汁中乙酸的含量进行测定，但乙酸极性较大且属于末端吸收，对色谱柱、流动相都有特殊的要求；乙醇多使用气相色谱内标法进行测定，但是其易挥发、极性较大，对毛细管色谱柱有特殊要求，若测试样品中存在与其沸点相近的化合物时会增大测试难度。也有采用重铬酸钾氧化、酸碱滴定、pH电位法等，这些检测方法样品前处理复杂，测试耗时长，目前还没有一种能够方便、快捷、检测结果准确可靠的检测技术，同时对发酵果饮中乙醇、乙酸的含量进行测定的方法。
假设针对发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的含量检测所存在的两个问题：(1)发酵果蔬中乙醇和乙酸的性质及含量差异大导致无法同时进行准确测定；(2)发酵果蔬汁通过微生物发酵产生了因类乙酸或类乙醇化合物(沸点或酸碱度相近)对检测结果的误导；提出一种操作高效简便、样品前处理简单，有效的减少样品处理对测定结果的影响，检测结果准确可靠是当前所亟需的。
发明内容
本发明的目的在于提出一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，能够解决发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的含量检测所面临的两个问题：(1)因发酵果蔬中乙醇和乙酸的性质及含量差异大导致无法同时进行准确测定；(2)发酵果蔬汁通过微生物发酵产生了因类乙酸或类乙醇化合物(沸点或或酸碱度相近)对检测结果的误导。
为解决上述技术问题，所采用的技术方案为：
一种采用q1H-NMR技术定量分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，所述的方法包括以下步骤：
A.精密称取30-100μL测试样品到内径为5mm核磁管中，精确称取内标物TMSP1.00mg，加入溶剂480-600μL，混匀后得到分析样品；
B.通过q1H-NMR对步骤A中得到分析样品进行数据采集采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为SW:8-20ppm、O1:3-8ppm，采样次数NS为8-32次，298K恒温测试，采样时间AQ为≥4.50s，弛豫延迟时间D1为≥20s，采样点数为64K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW:8-20ppm，O1:3-8ppm，F2维谱宽SW:8-20ppm，O1:3-8ppm，弛豫延迟时间D1为2s，采样次数NS为4-8次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW:8-20ppm，O1:3-8ppm；F1维(C)谱宽SW:150-250ppm，O1:70-115ppm；采样次数NS为8-16次，空扫DS为32；
C.将步骤B所采集得到的数据使用Topspin4.0.3软件进行傅里叶变换，定标、相位校正和五阶基线校正处理，选定内标和测试样品定量特征峰，放大后进行积分，取5次积分的平均值进行计算，计算公式为：
Ws＝Wr×(As/Ar)×(Es/Er)
其中Wr:内标物的重量，As:测试样品特征峰值，Ar:内标峰的振幅值，Es:测试样品的质子当量重量，Er:内标物的质子当量重量，根据Ws和称样量，计算乙醇和乙酸在样品中的含量，其中所述的质子当量重量以分子量除以特征峰的质子数计算得到。
其中步骤A中所述的测试样品前处理方式是称取试样和内标直接溶解得到澄清的液体。
其中步骤A中所述的溶剂是由氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为3-5:1混合后的液体，优选比例为4:1；步骤A中所述的溶剂的体积是测试样品体积的5-20倍。
步骤B采集数据优选参数为所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为SW:10.96ppm、O1:5.06ppm，采样次数NS为16次，测试温度298K，采样时间AQ为4.50s，弛豫延迟时间D1为20s，采样点数为64K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW:10.96ppm，O1:4.37ppm，F2维谱宽SW:10.96ppm，O1:4.37ppm，弛豫延迟时间D1为2s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW:10.96ppm，O1:4.37ppm；F1维(C)谱宽SW:200ppm，O1:95ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
所述的测试样品包括发酵果蔬汁，发酵果酒，发酵果醋，果蔬酵素其中的一种或多种混合物。
采用q1H-NMR技术进行含量测定时，内标物应选纯度高、易称量、与待测物不发生反应的化合物，在1H-NMR图谱中可以完全分离、互不干扰，发酵果蔬汁中含水与乙醇、乙酸发生质子交换，活泼氢不出峰。乙酸只出现甲基的质子信号(CH3-)，化学位移为1.80ppm(s,CH3-)可作为定量峰；乙醇出现两个信号峰，化学位移分别为1.10ppm(t,CH3-)、3.49ppm(q,-CH2-)，为计算方便、提高测定结果的准确度本试验选择化学位移1.10ppm(t)作为乙醇定量峰；3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠(TMSP)化学位移为0.00ppm(s)；三者不重叠、分离度良好且不受样品中其他杂质信号影响，见图1，故TMSP可作为本测试的内标。考虑到发酵果蔬汁经过微生物发酵后代谢产物的特殊性，选用醇类氘代溶剂和极性较小的氘代溶剂可能会对测试准确度有一定的影响，因此，选用DMSO-d6与超纯水混合溶剂能充分溶解样品和内标，溶剂信号峰在1H-NMR谱图中与TMSP、乙醇、乙酸的信号峰完全分离，不影响其检测结果。
影响定量核磁共振测定结果准确度与重复性的参数主要有弛豫时间(D1)、扫描次数(NS)及信噪比(S/N值)等。D1的设定依据是由待测物与内标物中待定量质子的纵向弛豫时间T1决定，只有待测质子完全弛豫后，相应的峰面积比值才会保持相对恒定，从而确保测试结果的准确度，从大量的检测结果可知当D1≥5T1时测定结果的准确度得到保障。因此，本发明分别取适量乙醇、乙酸和TMSP溶于核磁管中，采用反转恢复法(设置Vdlist参数为0.01,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,15.00,30.00s)测得乙醇、乙酸和TMSP化合物的T1分别为4.04s，2.16s，2.51s；故本发明中D1优选设置为20s，加上样品采集时间AQ＝4.50s，满足AQ+D1>5T1。在q1H-NMR测试中，信噪比(S/N)与扫描次数(NS)成正相关，通常情况下增加扫描次数，能够获得足够高的信噪比；但随着扫描次数增加测试实验时间也会延长，降低检测效率。本发明设置扫描次数(NS)8、16、32进行考察，对测试结果进行对比分析，无明显的差异变化，为保障测试结果的稳定性，故本发明优选设置扫描16次即可完全满足测试要求。
本发明的有益效果体现在以下几个方面：
(1)本发明与现有技术色谱法或滴定法相比，从样品前处理角度分析，本发明前处理简单易操作，减少了因复杂的前处理对分析检测结果的影响，节省了人力和物力成本；
(2)从数据的检测范围角度分析，解决了发酵果蔬汁中因乙醇或乙酸差异大，且乙醇具有一定的挥发性且属于末端吸收导致无法同时检出二者的问题；
(3)本发明采用q1H-NMR技术测定，通过乙酸信号1.80ppm(s,CH3-)与乙醇信号1.10ppm(t,CH3-)不受试样中其它化合物的干扰，可作为二者的专属测定峰，避免了发酵果蔬汁因微生物发酵而产生的类乙酸或类乙醇化合物(沸点或或酸碱度相近)对检测结果的影响。
(4)本发明所公开的方法可同时检测出发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的含量，发酵果蔬汁中成分繁杂，存在与二者沸点相近的化合物，使用现有公开的色谱法进行检测，不论是样品稀释后检测，还是将样品蒸馏、稀释后检测，二者都不能同时测得。
为验证本发明所公开方法的准确性，发明人通过直接使用乙醇、乙酸标准品配制3个不同浓度的验证样品，利用气相色谱法(GC)验证。
气相色谱参数设置：毛细管色谱柱为HP-INNOWAX(30m×320μm,0.25μm)，进样口温度:220℃，FID检测器温度:220℃；采用程序升温:起始温度为30℃，保持8min，以10℃/min的速率升温至70℃，再以25℃/min的速率升温至220℃，维持3min。进样量1μL，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，柱流量为1.00mL/min。
目前挥发性物质常用的检测手段GC对定量核磁共振测试乙醇、乙酸的含量进行验证。因发酵果蔬汁中存在与乙醇沸点相近的物质难以实现分离，无法进行定量测定。故此，本发明直接使用乙醇、乙酸标准品配制3个不同浓度的验证样品，使用上述优选的检测参数，分别使用GC与q1H-NMR技术其进行含量测定，GC测试谱图见图2，测得结果如表2，结果无显著性差异(P＞0.05)。
表1验证试验结果(n＝3)
附图说明
图1检测样品添加内标后的1H-NMR谱图
图2气相色谱法(GC)验证测试谱图
图3:实施例1样品1H-13C HSQC、1H-1H COSY谱图
具体实施例
下面结合附图及具体实施例对本发明所公开的定量分析方法的准确性，稳定性，专属性进行分析说明。
实施例1
精密称取30μL刺梨发酵液到内径为5mm核磁管中，精确称取内标物TMSP 1.00mg，加入溶剂至480μL(氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为4:1)，混匀后得到分析样；
核磁采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为SW:8ppm、O1:3.51ppm，采样次数NS为8次，测试温度298K，采样时间AQ为4.50s，弛豫延迟时间D1为20s，采样点数为64K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW:8ppm，O1:3.51ppm，F2维谱宽SW:8ppm，O1:3.51ppm弛豫延迟时间D1为2s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW:8ppm，O1:3.51ppm；F2维(C)谱宽SW:150ppm，O1:70ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
实施例2
精密称取50μL野木瓜发酵液到内径为5mm核磁管中，精确称取内标物TMSP1.00mg，加入溶剂至550(氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为4:1)，混匀后得到分析样；
核磁采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为SW:15ppm、O1:6.5ppm，采样次数NS为16次，测试温度298K，采样时间AQ为4.50s，弛豫延迟时间D1为20s，采样点数为64K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW:15ppm，O1:6.5ppm，F2维谱宽SW:15ppm，O1:6.5ppm弛豫延迟时间D1为2s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW:15ppm，O1:6.5ppm；F1维(C)谱宽SW:200ppm，O1:95ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
实施例3
精密称取100μL天麻发酵液到内径为5mm核磁管中，精确称取内标物TMSP 1.00mg，加入溶剂至600μL(氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为4:1)，混匀后得到分析样；
核磁采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为SW:20ppm、O1:8ppm，采样次数NS为32次，测试温度298K，采样时间AQ为4.50s，弛豫延迟时间D1为20s，采样点数为64K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW:20ppm、O1:8ppm，F2维谱宽SW:20ppm、O1:8ppm，弛豫延迟时间D1为2s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW:20ppm、O1:8ppm；F1维(C)谱宽SW:250ppm，O1:115ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
(1)检测结果：
分别对实施例1，实施例2，实施例3测试样品进行检测，每个样品测3份平行，通过计算得到乙醇和乙酸的含量见表2。
表2样品测定结果(n＝3)
(2)重复性试验
在优化条件下对实施例1中的样品重复测定6次，采集的数据处理后计算乙醇、乙酸的含量，以乙醇、乙酸的含量计算其相对标准偏差RSD值，分别为0.11％、0.99％，显示该测试方法重复性良好。
(3)稳定性试验
将实施例1中检测样品后存放在4℃冰箱于0,6,12,24,48h时间点测试，分别测得发酵果饮中乙醇、乙酸的含量，计算RSD值乙醇区间范围为0.15％～1.32％，乙酸的区间范围为0.24％～1.86％，结果显示供试品溶液在48h内稳定性良好。
(3)专属性试验
将实施例1中检测样品，采用二维核磁技术1H-13C HSQC、1H-1H COSY标准试验对方法的专属性进行考察。1H-1H COSY结果显示乙醇δ1.10(t,CH3-)与δ3.49(q,-CH2-)相关，且无其它杂质信号干扰；乙酸δ1.80(s,CH3-)在谱图除自相关外无其它杂质干扰。1H-13C HSQC结果显示乙醇δ1.10与δ20.19、δ3.48与δ57.92相关无其它杂质信号干扰；乙酸δ1.80与δ25.06直接相关无其它杂质信号干扰，测试图谱见图3，结果表明，本方法专属性强，可用于发酵果饮中乙醇、乙酸的含量测定。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对发明型作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
A. 精密称取30-100 μL测试样品到内径为5 mm核磁管中，精确称取内标物TMSP 1.00mg，加入溶剂至480-600 μL，混匀后得到分析样品；溶剂是由氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为3-5:1混合后的液体，其中所述的测试样品需经前处理与内标完全溶解得到澄清液体；
B. 通过q1H-NMR对步骤A中得的分析样品进行数据采集，采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为 SW: 8-20 ppm、O1: 3-8 ppm，采样次数NS为8-32次，298 K恒温测试，采样时间AQ为≥ 4.50 s，弛豫延迟时间D1为≥20 s，采样点数为64 K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW: 8-20 ppm，O1: 3-8 ppm，F2维谱宽SW: 8-20 ppm，O1: 3-8 ppm，弛豫延迟时间D1为2 s，采样次数NS为4-8次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW: 8-20 ppm，O1: 3-8 ppm；F1维(C)谱宽SW: 150-250 ppm，O1: 70-115 ppm；采样次数NS为8-16次，空扫DS为32；
C. 将步骤B所采集得到的数据使用Topspin4.0.3软件进行傅里叶变换，定标、相位校正和五阶基线校正处理，选定内标和测试样品定量特征峰，放大后进行积分，取5次积分的平均值进行计算，计算公式为：
;
其中Wr: 内标物的重量，As: 测试样品特征峰值，Ar: 内标峰的振幅值，Es: 测试样品的质子当量重量，Er： 内标物的质子当量重量，根据Ws和称样量，计算乙醇和乙酸在样品中的含量，其中所述的质子当量重量以分子量除以特征峰的质子数计算得到。
2.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，步骤A中所述的溶剂是由氘代二甲基亚砜DMSO-d6与超纯水按照体积比为4:1混合后的液体。
3.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，步骤A中所述的溶剂的体积是测试样品体积的5-20倍。
4.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，步骤B采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为 SW:8 ppm、O1: 3.51 ppm，采样次数NS为8次，测试温度298 K，采样时间AQ为4.50 s，弛豫延迟时间D1为20 s，采样点数为64 K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW: 8 ppm，O1: 3.51 ppm，F2维谱宽SW:8 ppm，O1: 3.51 ppm，弛豫延迟时间D1为2 s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW: 8 ppm，O1: 3.51 ppm;F1维(C)谱宽SW: 150 ppm，O1: 70 ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
5.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，步骤B采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为 SW:15 ppm、O1: 6.5 ppm，采样次数NS为16次，测试温度298 K，采样时间AQ为4.50 s，弛豫延迟时间D1为20 s，采样点数为64 K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽SW: 15 ppm，O1: 6.5 ppm，F2维谱宽SW:15 ppm，O1: 6.5 ppm，弛豫延迟时间D1为2 s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱宽SW: 15 ppm，O1: 6.5 ppm;F1维(C)谱宽SW: 200 ppm，O1: 95 ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
6.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，步骤B采集数据所设的参数为：采用90°脉冲，脉冲程序为zg，谱宽设置为 SW:20 ppm、O1: 8 ppm，采样次数NS为32次，测试温度298 K，采样时间AQ为4.50 s，弛豫延迟时间D1为20 s，采样点数为64 K；
1H-1H COSY脉冲程序为cosygpppqf，F1维谱宽 SW: 20 ppm、O1: 8 ppm，F2维谱宽 SW:20 ppm、O1: 8 ppm，弛豫延迟时间D1为2 s，采样次数NS为4次，空扫DS为16；
1H-13C HSQC脉冲程序为hsqcedetgpsp.3，F2维(H)谱SW: 20 ppm、O1: 8 ppm;F1维(C)谱SW: 250 ppm，O1: 115 ppm；采样次数NS为8次，空扫DS为32。
7.根据权利要求1所述的一种采用q1H-NMR技术定量分析发酵果蔬汁中乙醇和乙酸的方法，其特征在于，所述的测试样品包括发酵果蔬汁，发酵果酒，发酵果醋，果蔬酵素其中的一种或多种混合物。
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