CN102759583B

CN102759583B - 一种紫胶桐酸含量的测定方法

Info

Publication number: CN102759583B
Application number: CN201110371841.XA
Authority: CN
Inventors: 郑华; 刘世平; 周梅村; 张弘; 冯颖; 陈晓鸣; 张雯雯; 张敏
Original assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Resource Insects of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2031-11-21
Also published as: CN102759583A

Abstract

本发明公开了一种紫胶桐酸含量的测定方法，包括采用高效液相色谱法进行测定，以含有甲醇的水溶液为流动相，采用示差折光检测器进行测定，按照外标法以峰面积分别计算紫胶桐酸样品中的紫胶桐酸的含量。本发明方法提高了含量测定的精确性，缩短了测定时间，重复性好，适应性高，而且本发明方法的选择性强，灵敏度高，最低检测限小，克服了紫胶桐酸没有共轭结构，不能利用紫外(UV)检测器来检测的缺陷，降低了紫胶桐酸的生产、检测成本，适宜于紫胶桐酸的检测应用。

Description

一种紫胶桐酸含量的测定方法

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，涉及一种色谱检测方法，特别涉及一种采用高效色谱检测分析方法测定紫胶桐酸含量的方法。

背景技术

紫胶树脂是食品添加剂的重要原材料，由多羟基脂肪酸和倍半萜烯酸组成的聚酯混合物，其中多羟基脂肪酸为紫胶桐酸，是一种白色晶体，是紫胶树脂结构单体中的长链脂肪酸部分，分子式为C₁₆H₃₂O₅，含有三个游离的羟基和一个游离的羧基，也称作9，10，16-三羟基棕榈酸。紫胶桐酸用途广泛，不仅可以作为大环麝香类香料化合物、营养能量剂、前列腺素、昆虫信息素、环酰脲等的前体合成原料，也可应用于防紫外线、防辐射、耐高温等航空航天材料的制备。

皂化处理是紫胶桐酸制备过程中的重要步骤，目前国内已有常温皂化法、普通加热皂化法、超声波辅助皂化法和微波皂化法，其中微波皂化法制备紫胶桐酸的方法具有操作简单，时间短，效率高，安全无污染等特点。

虽然紫胶桐酸的制备方法得到了改进，但是目前国内外尚无公认的紫胶桐酸快速、准确检测方法。对紫胶桐酸含量测定方法的研究主要有如下3种：(1)廖亚龙等用酸碱滴定法检测紫胶桐酸含量，简便快速，但酸碱滴定结果反映的是被测样品中总有机酸的含量，并不能有效甄别样品中的紫胶桐酸和其它有机酸；(2)一般含有长碳链脂肪酸结构的有机物多是通过甲酯化后用气相色谱来检测，哈成勇等采用核磁共振法测定紫胶桐酸优势构象时制备了紫胶桐酸甲酯，但制备时间长，且紫胶桐酸分子结构中由于同时含有羧基和羟基，较易发生分子间或分子内酯化，故此法用于气相色谱检测时较难实现；(3)液相色谱法可以分离紫胶桐酸，但因紫胶桐酸中没有共轭结构，在200nm～800nm并无特征吸收峰，故不能利用紫外(UV)检测器来检测。Nagappayya等报道了采用高效液相色谱(HPLC)蒸发光散射(ELSD)法检测紫胶桐酸，流动相为乙腈和水，因未明确色谱条件且无谱图佐证，难以判断其检测效果；虽然ELSD检测器灵敏度高，稳定性好，但价格比较昂贵，难以推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有紫胶桐酸含量测定方法中存在的技术缺陷，提供一种能够快速，准确地测定样品中紫胶桐酸含量的方法，本发明方法测定过程中色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。

为实现本发明的上述目的，本发明一方面提供一种测定紫胶桐酸含量的方法，包括分别制备紫胶桐酸的对照品溶液和供试品溶液，采用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液的峰面积，按照外标法以峰面积计算供试品中紫胶桐酸的含量。

其中，所述对照品溶液的制备包括，称取紫胶桐酸标准品作为对照品，将对照品加入对照品溶剂，溶解，制成对照品溶液，其中，所述对照品溶剂为水或甲醇的水溶液；所述供试品溶液的制备包括，称取含有紫胶桐酸的样品，将样品加入样品溶剂，溶解，制成供试品溶液，其中，所述样品溶剂为水或甲醇的水溶液；所述测定包括，分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪进行液相色谱测定，采用示差折光检测器检测、记录对照品溶液和供试品溶液的峰面积。

特别是，所述对照品溶剂甲醇的水溶液中甲醇与水的体积之比为60∶40。

其中，所述甲醇的水溶液中还含有三氟乙酸。

特别是，所述甲醇的水溶液的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1。

尤其是，所述对照品溶剂中甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

特别是，所述样品溶剂甲醇的水溶液中甲醇与水的体积之比为60∶40。

其中，所述甲醇的水溶液中还含有三氟乙酸。

尤其是，所述样品溶剂中甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

其中，所述的高效液相色谱采用的色谱柱为氨基色谱柱(即氨基柱)或C18反相色谱柱；所述高效液相色谱的流动相为含有甲醇的水溶液。

特别是，所述氨基色谱柱选择YWG-NH₂、Ultimate XB-NH₂、Inertsil-NH₂或HypersilAPS2(NH₂)色谱柱；所述C18反相色谱柱选择Sepax GP-C18、Sepax HP-C18或ZORBAXSB-C18反相柱。

尤其是，所述C18反相色谱柱为ZORBAX SB-C18反相柱。

特别是，所述流动相中甲醇与水的体积之比为50-70∶30-50，优选为50-60∶40-50，进一步优选为60∶40。

特别是，所述流动相中还含有三氟乙酸。

尤其是，所述甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为50-70∶30-50∶0.05-0.2，优选为60∶40∶0.05-0.2，进一步优选为60∶40∶0.05-0.1更进一步优选为60∶40∶0.1。

其中，所述高效液相色谱分析条件为流速为0.7-1.5ml/min，优选为1ml/min；柱温为25-35℃，优选为30℃。

其中，所述示差折光检测器检测过程中检测温度为25-35℃，优选为30℃。

本发明方法测定紫胶桐酸含量的测定方法具有如下优点：

1、本发明方法测定紫胶桐酸含量准确，测定速度快、方法简便，测定效率高，测定时间短，紫胶桐酸的出峰时间快，即紫胶桐酸的保留时间(RT)为7.6-8.0min。

2、本发明测定方法采用高效液相色谱法进行测定，采用本发明的流动相能够将紫胶桐酸与杂质完全分离，液相色谱法分离效果好，紫胶桐酸的色谱图峰型完整、美观，流动相中添加三氟乙酸，使得紫胶桐酸的色谱法没有拖尾现象，测定结果准确。

3、本发明方法测定结果重现性好，系统精密度高，相对标准偏差平均值(RSD)为0.86％；稳定性好，稳定性试验的RSD平均值为0.75％；本方法的可信度高，在线性范围0.01～1.00mg/mL(r＝0.9994)实用性好。

4、本发明检测方法选择性强，灵敏度高，本发明的检测最小量即最低检测限为0.008mg/ml。

5、本发明方法克服了因紫胶桐桐酸中没有共轭结构，在200nm～800nm并无特征吸收峰，不能利用紫外(UV)检测器来检测的缺陷，采用示差折光检测器，利用样品组分与流动相的折光系数的不同，精确地检测紫胶桐酸，测定紫胶桐酸的含量。

6、本发明方法操作简单，处理时间短，快速而且测定结果准确，降低了紫胶桐酸的生产、检测成本，适宜工业化大规模推广应用。

附图说明

图1是流动相为含有甲醇的水溶液的紫胶桐酸HPLC色谱条件选择试验的色谱图；

图2是流动相为含有甲醇、水和三氟乙酸混合溶液的紫胶桐酸HPLC色谱条件选择试验的色谱图；

图3是紫胶桐酸HPLC色谱条件流速选择试验的色谱图；

图4是紫胶桐酸HPLC色谱条件柱温选择试验的色谱图；

图5是紫胶桐酸HPLC色谱分析的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中使用的试验材料、试剂和仪器如下：

紫胶桐酸标准样品(纯度95％)：美国BE公司；

甲醇(色谱纯)：Fisher Scientific公司；

三氟乙酸(化学纯)、邻苯二甲酸氢钾(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；

氢氧化钾(分析纯)：西陇化工股份有限公司；

实验用水为超纯水；

紫胶桐酸样品：中国林业科学研究院资源昆虫研究所特种生物资源工程技术研究中心制备。

Agilent1200高效液相色谱仪：美国安捷伦公司，配有型号为RID-G1362A示差折光检测器和ZORBAX SB-C18反相色谱柱；

Purelab Ultra超纯水仪：英国ELGA公司；

KQ-300VDE型双频数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司。

实施例1高效液相色谱分析色谱条件的选择

11紫胶桐酸标准溶液的配置

准确称取0.1000g紫胶桐酸标准样品(含量95％)，加入甲醇、水和三氟乙酸的混合溶液，搅拌溶解，其中甲醇与水的体积之比为60∶40，甲醇与水的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1，在超声波辅助下溶解混匀，然后定容至100mL容量瓶中，摇匀配制成母液。

分别吸取0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10mL母液于10mL容量瓶中，用V(甲醇)∶V(水)＝60∶40(0.1％三氟乙酸)的溶液定容至刻度。配置的紫胶桐酸标准样品溶液的浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mg/mL。

1.2流动相的选择

色谱柱：选择ZORBAX SB-C18反相色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)

检测器：RID-G1362A示差折光检测器；

温度：柱温30℃，检测器温度30℃；

流速：1mL/min；

分别精确吸取浓度为0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用如表1中所述体积之比的流动相进行高效液相色谱(HPLC)分析，采用示差折光检测器检测，记录色谱图。高效液相色谱分析色谱条件选择条件和结果如表1所示。

表1HPLC色谱分析流动性与色谱行为

流动相(体积之比)	色谱行为
		甲醇∶水＝90∶10	极性过强，目标峰不保留，直接随溶剂峰一起出来
甲醇∶水＝80∶20	极性强，目标峰不保留，与溶剂峰不能有效分离
		甲醇∶水＝60∶40	色谱峰拖尾
甲醇∶水＝50∶50	出峰时间较长，时间效率不高
		甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.05	三氟乙酸加入量略低，峰型效果欠佳
甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.1	峰型、柱效果好，分离度高，RT适中，RT为7.7min
		甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2	三氟乙酸加入量偏高，对分离柱损害较大

流动相为甲醇∶水＝90∶10、80∶20、60∶40、50∶50的HPLC谱图见附图1；流动相为甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.05、60∶40∶0.1、60∶40∶0.2的HPLC谱图见附图2。

综合分析图1、2，选择流动相为甲醇水溶液或甲醇、水与三氟乙酸的混合溶液，其中甲醇和水(60∶40(V/V))的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.05-0.2都可以作为流动相，考虑到保留时间(RT)、色谱峰的峰型等的因素，优选甲醇-水(60∶40)与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1的混合溶液为流动相，即流动相为甲醇、水和三氟乙酸的混合液，其中甲醇、水三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

1.3流速的选择

以甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，比较不同流速下紫胶桐酸出峰及分离效果的影响。

精确吸取浓度为0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，分别以流速为1.5mL/min、1mL/min、0.5mL/min速度进行HPLC分析，采用示差折光检测器检测，记录色谱图。不同流速条件下高效液相色谱分析色谱图如图3所示。

由图3的分析结果表明：流速为1.5mL/min，出峰时间提前，紫胶桐酸的RT为3min，与溶剂峰相临近，分离度差，影响分析效果，而且色谱柱的柱压过大，对色谱柱不益，影响色谱柱的分离效果；流速为0.5mL/min，虽然柱压降低，但出峰时间延长，紫胶桐酸的RT为12min左右，延长了分析时间，分析效率低；流速为1mL/min，出峰时间适中，紫胶桐酸的RT为7.7min，色谱柱的柱压合适，因此选择HPLC的测定流速为1mL/min。

1.4柱温的选择

在确定流动相配比及流速后，考虑柱温对试验的影响。

分别精确吸取浓度为0.3mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，流速为1mL/min，分别在柱温为25℃、30℃、35℃的色谱条件下进行HPLC分析，在检测器温度为25℃、30℃、35℃下进行示差折光检测器检测，记录色谱图。不同柱温和检测器温度条件下高效液相色谱分析色谱图如图4所示。

图4的分析结果表明：柱温对出峰效果和分离效果的影响较小。鉴于较低温度下仪器能耗较低、色谱柱寿命长、升温时间短，故采用30℃作为最佳温。

实施例2标准曲线的绘制

按照实施例1中色谱分析条件进行测定，色谱分析条件如下：

色谱柱：ZORBAX SB-C18反相色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)

流动相：甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.1(V/V/V)；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测器：RID-G1362A示差折光检测器；

示差折光检测器温度：30℃。

2.1绘制标准曲线

取紫胶桐酸标准品进行高效液相色谱(HPLC)分析，将配置的不同浓度的标准溶液分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，进行测定，每个样品测3次，取3次测定结果的平均值，以标准样品峰面积为纵坐标，标准样品的浓度为横坐标，绘制标准溶液曲线，如图5所示。得回归方程：Y＝74584X+2899.3，R²＝0.9994，结果表明，紫胶桐酸浓度在0.01～1.0mg/mL的范围内具有良好的线性关系，因此，可以根据此方程进行定量分析。在上述的色谱条件下，当信噪比S/N为3时，紫胶桐酸的最低检测限为0.008mg/mL。

2.2精密度试验

精密吸取浓度为0.4mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，连续进样9次，按照实施例1中选择的色谱分析条件进行测定，计算平均峰面积和相对标准偏差，评估精密度，测定结果见表2。

表2紫胶桐酸精密度试验结果(n＝9)

测定结果表明：9次测定数据的RSD平均值为0.86％，表明本研究方法确定的紫胶桐酸分离检测条件精密度良好。

2.4稳定性试验

于紫胶桐酸标准样品溶液制备后0、1、2、3、4、5、6、7、8h，精密吸取浓度为0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，连续进样9次，按照实施例1中选择的色谱分析条件进行测定，计算平均峰面积和相对标准偏差，评估精密度，测定结果见表3。

表3紫胶桐酸稳定性试验结果(n＝9)

测定结果表明：9次测定数据的RSD平均值为0.75％，表明紫胶桐酸样品检测稳定性良好。

2.5加标回收率试验

按照实施例1选定的色谱分析条件和回归方程：Y＝74584X+2899.3的定量分析，测定紫胶桐酸样品含量为95.31％；

精密称取已测定的含量为95.31％的紫胶桐酸样品0.0500g溶于100mL实施例1中选择的流动相中，其中流动相中甲醇、水、三氟乙酸的体积之别为60∶40∶0.1，制得浓度为0.50mg/ml的紫胶桐酸样品溶液；接着分别精确吸取3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、6.50和7.00ml紫胶桐酸样品溶液置于10ml容量瓶中，即加入容量瓶中的紫胶桐酸样品的质量分别为1.42965mg、1.66792mg、1.90620mg、2.14470mg、2.38275mg、2.62102mg、2.62102mg、3.09757mg和3.33585mg；然后向每个瓶中加入浓度为0.5mg/ml的紫胶桐酸标准品溶液2ml，即加入每个瓶中的紫胶桐酸标准品的质量为0.95000mg，加流动相定容至10mL，摇匀，分别计算加标回收率，回收率计算公式如下：

计算结果见表4。

表4紫胶桐酸加标回收率试验结果(n＝9)

从表4可以看出，添加不同剂量的紫胶桐酸平均加标回收率为100.23％，在可信范围内，组间无明显差异，表明本测定方法可信度高，适用于测定紫胶桐酸含量。

实施例3HPLC法测定紫胶桐酸含量

精密称取紫胶桐酸样品0.1g溶于实施例1中选择的流动相中，其中流动相中甲醇、水、三氟乙酸的体积之别为60∶40∶0.1，然后定容至100mL容量瓶中，摇匀，待测；

精密吸取紫胶桐酸样品溶液10μL，连续进样5次，按照实施例1中选择的色谱分析条件进行HPLC-RID分析测定，测定紫胶桐酸组分峰面积，采用实施例2得到的回归方程：Y＝74584X+2899.3，对其进行定量分析，得出样品中紫胶桐酸质量分数。测定结果如表5所示。

表5高效液相色谱法测定紫胶桐酸含量

对照例1酸碱滴定法检测紫胶桐酸含量

1、配制氢氧化钾-乙醇标准溶液

按照国家标准GB601-2002《化学试剂标准滴定溶液的制备》方法进行配制和标定，配制的氢氧化钾-乙醇标准溶液的浓度为0.128mol/L。

2、配制紫胶桐酸样品溶液

精密称取紫胶桐酸样品5份，每份约0.10g，分别溶于30mL 95％的乙醇溶液中，滴加2滴酚酞指示剂(10g/L，酚酞的浓度)，配制成紫胶桐酸样品溶液；

3、滴定

用标定的浓度为0.128mol/L的氢氧化钾-乙醇标准溶液进行酸碱滴定测定紫胶桐酸的含量，滴定至终点(即配制的紫胶桐酸样品溶液由无色转变成浅粉红色)，由消耗氢氧化钾-乙醇标准溶液的体积，计算出紫胶桐酸的质量分数，测定结果如表6所示。

表6酸碱滴定法测定紫胶桐酸含量

从表5、6的测定结果可知，同一紫胶桐酸样品，采用两种方法进行含量的定量分析结果分析，采用酸碱滴定法定量分析的结果比HPLC分析的结果偏高。HPLC与酸碱滴定法的区别在于：HPLC检测过程中，样品通过色谱柱后，色谱柱对不同组分具有分离作用，将紫胶桐酸与杂质已分离开，故HPLC测定结果更接近样品中紫胶桐酸组分的真实含量。而酸碱滴定法则不能完全区分样品中的紫胶桐酸和其它有机酸，方法不够准确，含量值偏高。因此对于同一紫胶桐酸样品，HPLC-RID定量分析结果比酸碱滴定法定量分析结果低，测定结果更为准确。

综上所述，本发明方法R²＝0.9994，紫胶桐酸浓度在0.01～1.0mg/mL的范围内具有良好的线性关系；精密度高，精密度的RSD平均值为0.86％，方法的检出限低，紫胶桐酸的最低检测限为0.008mg/mL；方法的稳定性高、重复性好，回收率理想，样品前处理简单，分析效率提高，有效的提高了紫胶桐酸的检测效率，适于快速、大量的分析紫胶桐酸的含量。

Claims

1.一种测定紫胶桐酸含量的方法，其特征是包括分别制备紫胶桐酸的对照品溶液和供试品溶液，采用高效液相色谱法测定对照品溶液和供试品溶液的峰面积，按照外标法以峰面积计算供试品中紫胶桐酸的含量；所述制备紫胶桐酸的对照品溶液采用的溶剂为含有三氟乙酸的甲醇的水溶液，所述制备紫胶桐酸的供试品溶液采用的溶剂为含有三氟乙酸的甲醇的水溶液；所述高效液相色谱法测定的流动相为含有甲醇的水溶液，所述流动相中甲醇与水的体积之比为50-70:30-50；所述制备对照品溶液和制备供试品溶液采用的含有三氟乙酸的甲醇的水溶液，三氟乙酸与甲醇的水溶液的体积比为0.1：100。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：

所述对照品溶液的制备包括，称取紫胶桐酸标准品作为对照品，将对照品加入对照品溶剂，溶解，制成对照品溶液，其中，所述对照品溶剂为含有三氟乙酸的甲醇的水溶液；

所述供试品溶液的制备包括，称取含有紫胶桐酸的样品，将样品加入样品溶剂，溶解，制成供试品溶液，其中，所述样品溶剂为含有三氟乙酸的甲醇的水溶液；

所述测定包括，分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪进行液相色谱测定，采用示差折光检测器检测、记录对照品溶液和供试品溶液的峰面积。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述高效液相色谱采用的色谱柱为氨基色谱柱或C18反相色谱柱。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述C18反相色谱柱为Sepax GP-C18、SepaxHP-C18或ZORBAX SB-C18反相柱。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述流动相中还含有三氟乙酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为50-70:30-50:0.05-0.2。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征是所述高效液相色谱分析条件为流速为1ml/min，柱温为25-35℃。

8.如权利要求2所述的方法，其特征是所述示差折光检测器检测过程中检测温度为25-35℃。