CN112522162A - 一株栗褐链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株栗褐链霉菌及其应用。栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,其保藏登记号为CGMCC No.21280。本发明还提供了制备栗褐链霉菌提取物的方法:将栗褐链霉菌MS170035进行发酵,得到发酵物;取发酵物的上清液,采用有机试剂进行提取,收集提取液;将提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂,得到提取物。本发明还保护栗褐链霉菌MS170035或所述提取物的应用:在制备线虫抑制剂中的应用;在抑制线虫中的应用。本发明提供的栗褐链霉菌的发酵提取物具有很高的抗根线虫的活性,对栗褐链霉菌的发酵提取物进行化合物分离,得到式(Ⅰ)所示化合物,该化合物对根线虫具有较高的致死率。

Description

一株栗褐链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一株栗褐链霉菌及其应用。
背景技术
近年来,根结线虫成了种植户们的心腹大患,在根结线虫时候,不仅投入高,而且难。根结线虫是一种世界性的害虫,一般受害大棚可减产20%-30%,严重的大棚减产程度能达到60%,甚至绝产,危害程度相当严重,而且一旦传入很难根除。
虫体微小,隐蔽性强:线虫是一种土传虫害,个体微小、侵害能力强、寄生于多种作物、杂草等;繁殖速度快,虫口基数易大量积累。
侵害根部,难以发现:植株表现出症状时,根部已被线虫侵害,已经造成植株损害,植株表现同青枯病等土传病害类似,容易被表观性状误导。
环境适应性强:其在土壤中通常活跃在15~30cm左右的土层,深可达1.5米,其在可侵染多种寄主,即使在无寄主条件下仍然可存活3年。
预防较难:根结线虫传播途径较多,受污染的农具、带虫的种苗、作业过程中随鞋携带的土壤等都成为了根结线虫传播的介体。
由于药物的广泛使用,根结线虫随之发生了耐药现象,因此需要筛选新的药物,用于农业线虫防治。
发明内容
本发明的目的是提供一株栗褐链霉菌及其应用。
本发明提供了栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035。栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.21280。
本发明还提供了一种制备栗褐链霉菌提取物的方法,包括如下步骤:
将栗褐链霉菌MS170035进行发酵,得到发酵物;
取所述发酵物的上清液,采用有机试剂进行提取,收集提取液;
将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂,得到提取物。
所述发酵的条件具体可为:28℃、200rpm振荡培养10天。
所述发酵采用发酵培养基;每升发酵培养基中加入的原料如下:5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙,余量为水。
所述发酵培养基的制备方法具体可为:取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙溶于水,调pH至7.0-7.5,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
所述发酵具体可为:将5ml种子液加入100ml发酵培养基中,28℃、200rpm振荡培养10天。
所述种子液具体可为OD600nm=1.2-1.4的种子液。
所述种子液的制备方法具体可为:将斜面菌种挖块接种至100ml种子培养基,28℃、200rpm振荡培养5天,得到OD600nm=1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法具体可为:将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水,调pH至7.0-7.2,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
发酵容器中的内容物即为发酵物。
发酵物的上清液的制备方法为:将所述发酵物20℃、10000rpm离心10分钟,收集上清液。
所述有机试剂为乙酸乙酯。
采用有机试剂进行提取具体可为:取发酵物的上清液,用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;合并三次萃取得到的乙酸乙酯相,减压蒸馏以除去有机溶剂,得到的产物即为提取物。
所述减压蒸馏的温度具体可为40℃。
所述方法制备得到的提取物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种制备栗褐链霉菌的发酵物的方法,包括如下步骤:将栗褐链霉菌MS170035进行发酵,得到发酵物。
所述发酵的条件具体可为:28℃、200rpm振荡培养10天。
所述发酵采用发酵培养基;每升发酵培养基中加入的原料如下:5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙,余量为水。
所述发酵培养基的制备方法具体可为:取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙溶于水,调pH至7.0-7.5,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
所述发酵具体可为:将5ml种子液加入100ml发酵培养基中,28℃、200rpm振荡培养10天。
所述种子液具体可为OD600nm=1.2-1.4的种子液。
所述种子液的制备方法具体可为:将斜面菌种挖块接种至100ml种子培养基,28℃、200rpm振荡培养5天,得到OD600nm=1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法具体可为:将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水,调pH至7.0-7.2,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
所述方法制备得到的发酵物也属于本发明的保护范围。
发酵容器中的内容物即为发酵物。
本发明还保护所述发酵物的上清液。发酵物的上清液的制备方法如下:将所述发酵物20℃、10000rpm离心10分钟,收集上清液。
本发明还保护栗褐链霉菌MS170035、所述提取物、所述发酵物或所述发酵物的上清液的应用,为如下(a)或(b):
(a)在制备线虫抑制剂中的应用;
(b)在抑制线虫中的应用。
本发明还保护栗褐链霉菌MS170035、所述提取物、所述发酵物或所述发酵物的上清液在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用。
本发明还保护式(Ⅰ)所示化合物的应用,为如下(a)或(b):
(a)在制备线虫抑制剂中的应用;
(b)在抑制线虫中的应用。
Figure BDA0002859331370000031
以上任一所述线虫具体可为根结线虫。
以上任一所述线虫具体可为南方根结线虫。
本发明提供的栗褐链霉菌MS170035,其发酵提取物具有很高的抗根线虫的活性。本发明对栗褐链霉菌MS170035的发酵提取物进行化合物分离,得到式(Ⅰ)所示化合物,该化合物对根线虫具有较高的致死率。
附图说明
图1为反相色谱层析的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。DMSO全称为二甲基亚砜。
如无特殊说明,以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株MS170035的采集
2017年9月从南海海泥中分离到一株菌,命名为菌株MS170035。
二、菌株MS170035的鉴定
形态特征:菌落凸起,基内菌丝为黑褐色,少量白色气生菌丝,孢子白色,无水溶性色素产生。
16S rRNA基因部分序列见序列表的序列1,与GENBANK ACCESSION NO.MK156399.1的序列相似性最高,相似性为99.79%。
根据鉴定结果,菌株MS170035属于栗褐链霉菌(Streptomyces badius)。
三、菌株MS170035的保藏
栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,已于2020年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.21280。
实施例2、制备栗褐链霉菌MS170035的粗提物并检测其对根结线虫的抑制作用一、制备栗褐链霉菌MS170035的粗提物
1、将栗褐链霉菌MS170035划线接种于斜面培养基,28℃静置培养5天(使气生菌丝生长丰满),得到斜面菌种。
斜面培养基的制备方法:将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物、4克葡萄糖和20克琼脂粉溶于水,调pH至7.0-7.2,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
2、将种子培养基分装于500ml三角瓶中(100ml/瓶),将斜面菌种挖块接种至种子培养基,28℃、200rpm振荡培养5天,得到OD600nm=1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法:将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水,调pH至7.0-7.2,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
3、将5ml种子液加入100ml发酵培养基中,28℃、200rpm振荡培养10天。
发酵培养基的制备方法:取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙溶于水,调pH至7.0-7.5,用水定容至1L,115℃灭菌30分钟。
完成本步骤后,发酵容器中的内容物即发酵产物。
4、完成步骤3后,20℃、10000rpm离心10分钟,收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液,用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取,静置待水相与乙酸乙酯相分层后,收集位于上层的乙酸乙酯相;合并三次萃取得到的乙酸乙酯相,40℃减压蒸馏以除去有机溶剂,得到的产物即为粗提物。
平均每个三角瓶得到0.2-0.5g粗提物。
二、检测粗提物对南方根结线虫的抑制作用
取步骤一制备的粗提物,用DMSO溶解,使粗提物浓度为1000μg/μL,即为粗提物溶液。
取南方根结线虫卵囊,洗净,放置到0.5%次氯酸钠水溶液中消毒3min,再用无菌水反复冲洗3次以洗去次氯酸钠,然后进行孵化,每隔两天观察并收集二龄幼虫。取二龄幼虫,用无菌水悬浮,得到线虫悬液,每50μL线虫悬液中含100条二龄幼虫。
取24孔板,每孔加入50μL线虫悬液、200μL粗提物溶液和150μL无菌水,用移液器轻轻吹打混匀,然后28℃静置12h,然后统计线虫死亡率。
用等体积DMSO代替代替粗提物溶液作为阴性对照。
进行三次重复试验,每次重复试验至少设置3个重复处理,结果取平均值。
阴性对照处理的线虫死亡率为6.5%。粗提物处理组的线虫死亡率为78.6%。
实施例3、制备化合物并检测其对根结线虫的抑制作用
一、制备化合物
1、将实施例2的步骤一制备的粗提物用甲醇重新溶解,过滤去除不溶物后进行反向高效液相色谱。
色谱柱:Agilent Eclipse SB C-18反相色谱柱(9.4×250mm)。
检测波长:254nm。
流动相:65%甲醇水溶液(即甲醇的体积百分含量为65%)。
流动相流速:3ml/min。
收集目标峰的过柱后溶液(目标峰为第5个洗脱峰,峰值对应的保留时间为11.7min)。色谱图见图1,箭头标注目标峰。
2、取步骤1得到的过柱后溶液,然后利用旋转蒸发仪40℃减压蒸馏以去除有机溶剂和水,得到产物。
每g粗提物约得到0.5 mg产物。
3、取步骤2得到的产物,进行化合物结构鉴定。
结果见表1。HRESIMS显示其准分子离子峰m/z 229.0104[M+H]+。结合1H NMR和13CNMR推测其为结构式如式(Ⅰ)所示的化合物。
表1
Figure BDA0002859331370000061
Figure BDA0002859331370000062
二、检测化合物对南方根结线虫的抑制作用
取步骤一制备的式(Ⅰ)所示化合物,用DMSO溶解,使化合物浓度为1000μg/μL,即为化合物溶液。
取南方根结线虫卵囊洗净,放置到0.5%次氯酸钠水溶液中消毒3min,再用无菌水反复冲洗3次,洗去次氯酸钠,然后进行孵化,每隔两天观察并收集二龄幼虫。取二龄幼虫,用无菌水悬浮,得到线虫悬液,每50μL线虫悬液中含100条二龄幼虫。
取24孔板,每孔加入50μL线虫悬液、200μL化合物溶液和150μL无菌水,用移液器轻轻吹打混匀,然后28℃静置12h,然后统计线虫死亡率。
用等体积DMSO代替化合物溶液作为阴性对照。
进行三次重复试验,每次重复试验至少设置3个重复处理,结果取平均值。
阴性对照处理的线虫死亡率为6.5%。化合物处理组的线虫死亡率为82.3%。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株栗褐链霉菌及其应用
<130> GNCYX203181
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> Streptomyces badius
<400> 1
ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgaagcc cttcggggtg 60
gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc ccttcactct gggacaagcc 120
ctggaaacgg ggtctaatac cggataacac tctgtcccgc atgggacggg gttaaaagct 180
ccggcggtga aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg gtggggtgat ggcctaccaa 240
ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag 360
cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc 420
gaaagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcttgtc 540
acgtcggatg tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc attcgatacg ggctagctag 600
agtgtggtag gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg 660
aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc cattactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 720
ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt cccgcgtaaa cgttgggaac taggtgttgg 780
gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac 840
ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg 900
gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatataccg gaaagcatca 960
gagatggtgc cccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg 1080
cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg 1140
acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt 1200
acaatgagct gcgatgccgc gaggcggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat 1260
tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc 1320
tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa 1380
cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct gtcgaaggtg ggactggcga 1440
ttgggacga 1449

Claims (10)

1.栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,其保藏登记号为CGMCC No.21280。
2.一种制备栗褐链霉菌提取物的方法,包括如下步骤:
将栗褐链霉菌MS170035进行发酵,得到发酵物;栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,其保藏登记号为CGMCC No.21280;
取所述发酵物的上清液,采用有机试剂进行提取,收集提取液;
将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂,得到提取物。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述有机试剂为乙酸乙酯。
4.权利要求2或3所述方法制备得到的提取物。
5.一种制备栗褐链霉菌的发酵物的方法,包括如下步骤:
将栗褐链霉菌MS170035进行发酵,得到发酵物;栗褐链霉菌(Streptomyces badius)MS170035,其保藏登记号为CGMCC No.21280。
6.权利要求5所述方法制备得到的发酵物。
7.权利要求6所述发酵物的上清液。
8.权利要求1所述栗褐链霉菌、权利要求4所述提取物、权利要求6所述发酵物或权利要求7所述发酵物的上清的应用,为如下(a)或(b):
(a)在制备线虫抑制剂中的应用;
(b)在抑制线虫中的应用。
9.权利要求1所述栗褐链霉菌、权利要求4所述提取物、权利要求6所述发酵物或权利要求7所述发酵物的上清在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用;
Figure FDA0002859331360000011
10.式(Ⅰ)所示化合物的应用,为如下(a)或(b):
(a)在制备线虫抑制剂中的应用;
(b)在抑制线虫中的应用;
Figure FDA0002859331360000012
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