CN112336672A - 一种白芨发酵产物的发酵方法及其在美白化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及白芨发酵产物在制备美白产品中的应用。本发明提供了白芨发酵产物在美白方面的应用，白芨发酵产物具有良好的体内美白活性。本发明还提供了白芨发酵产物的发酵方法，使发酵液中有效成分白芨多糖含量高达3.78%。

Description

一种白芨发酵产物的发酵方法及其在美白化妆品中的应用

技术领域

本发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及一种含有白芨发酵产物的美白化妆品及其制备方法。

背景技术

白芨［Bletilla striates (Thuub) Rchb.f.］又名白及、白及子等，属多年生兰科植物白芨的干燥块茎，目前主要分布在我国西南地区，另外在东南沿海的江浙皖三省也有少量分布。《本草纲目》、《中药大辞典》及《全国中草药编绘》都有关于白芨作为药用植物的记载，可总结为白及性苦、甘、涩，微寒，归肺、肝、胃经，有消肿生肌，美白祛斑的功效。现代研究证明，白芨中主要有效物质为多糖类化合物、联苄类化合物以及菲类化合物，可以有效美白、祛斑、抗氧化、抗肿瘤、抗感染，并可以加速凝血。

通过微生物发酵工艺制备天然产物提取物，可以有效降低一些天然产物本身固有的毒性，在发酵过程也可以酶解药材细胞壁结构，更充分的释放天然产物的有效成分，提高其利用率。微生物在发酵过程中，亦会产生次生代谢产物，其中就包括多种生物酶，可以有效的把蛋白质、多糖等生物大分子分解为分子量较小的物质，以蛋白质为例，会被蛋白酶水解为具有与其功能性蛋白质相同序列的特异性小的不同分子量的生物活性肽，其特点是分子量低、结构简单且毒副作用低，故易于被人体吸收发挥更强的生物活性，但又具有更高的安全性。有研究表明，发酵后的提取液可以提高有效成分的物质含量，从而使各种药理活性得到显著提高。此外，微生物发酵还具有成本低、不易致敏等特点是当今研究和开发的热点。

色素沉着是一种非常重要人体皮肤的自我保护机制，它是保护皮肤免受紫外线辐射损伤的首要屏障，但320mm-420mm的长波UVA可以穿透到真皮层，激活络氨酸酶的活性，加速黑色素的分裂、增生，引发一系列如色斑、雀斑、黄褐斑和黑色素瘤等色素沉着症。许多研究已经证明，决定人体肤色最主要的因素是黑色素的含量和黑色素的分布，而络氨酸酶活性又决定了黑色素的生成能力，因此抑制络氨酸酶活性及抑制黑色素生成是发挥美白作用的核心机理。

此外，传统的美白添加剂成分均具有细胞毒性、刺激性、致敏性及不良反应大等缺点，其中如汞、氢醌等已被列为化妆品禁用成分，而天然植物成分素来有温和、安全性高、刺激性小等优点。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种白芨发酵产物制备方法及其在美白化妆品中的应用。本发明提供的白芨发酵产物具有显著的美白功效。本发明还提供了白芨发酵产物的制备方法，该制备方法有发酵工艺简单、能够降低发酵成本和易于扩大生产的优势。白芨发酵液中富含以多糖为主的多种植物次生代谢产物，并在微生物发酵条件下转变为分子量更小的有效成分，使其变得更易于被人体吸收利用，同时该方法发酵得到的白芨发酵产物是一种安全性高的美白化妆品原料。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了白芨发酵产物在制备美白产品中的应用。

本发明还提供了白芨发酵产物在制备具有美白功能的化妆品中的应用。

本发明提供的白芨发酵产物具有减缓常用化妆品防腐剂（如苯氧乙醇）的细胞毒性的功效，能够大幅提高具有美白功效的化妆品的安全性。

本发明提供了一种白芨发酵产物，所述白芨发酵产物中白芨多糖含量为3.78%。

本发明提供的发酵方法发酵工艺简单，发酵成本低廉，易于扩大生产；可以提高发酵产物中有效成分白芨多糖的含量，能够极大程度的提高对白芨的利用程度。具体发酵工艺如下：精确称取白芨叶片，进行粉碎过筛处理得到白芨叶片粉末，所述粉末的粒径优选为过100目筛，然后按料液比1：（100~120）（g/mL）加入无菌的去离子水，并调节pH为6.0~6.5；在本发明中，所述发酵的料液比进一步优选为1：100，去离子水灭菌条件进一步优选为在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min。

得到白芨夜片粉末和去离子水的混合物后，按照1‰投料比例接种种子液，通过充分搅拌使其混合均匀，发酵罐设定温度37℃，发酵时间48~50h，开始发酵；在本发明中，所述的种子液制备方法优选为：将MRS培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌后，接种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）以及嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），设置培养温度为 37℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；分别使菌体浓度达到 108CFU/mL，发酵时间进一步优选为48 h。

发酵完成后，在8000~10000rpm/min条件下进行离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤得到发酵产物滤渣和滤液，取其中发酵产物滤液即为白芨发酵产物；在本发明中，离心条件进一步优化为8000rpm/min，破壁条件进一步优化1200Bar。

本发明通过对发酵工程的各步骤进行优化，多个优化步骤相互配合能够有效提高发酵的效率和效果。经过上述发酵方法发酵得到的白芨发酵产物中白芨多糖的含量为3.78%。

本发明对上述发酵原料等物品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

本发明还提供了一种含有白芨发酵产物的美白化妆品，所述美白产品包括上述发酵方法得到的白芨发酵产物。本发明提供的美白产品具有优越的美白效果，在斑马鱼体内能够显著抑制络氨酸酶活性，减少黑色素生成。

本发明还提供了一种基于上述的白芨发酵产物或上述发酵方法发酵得到的白芨发酵产物的美白化妆品，包括以下质量份的组分：霍霍巴籽油2.5%、聚二甲基硅氧烷1.5%、鲸蜡硬脂醇1.8%、硬脂酸酯/硬脂酸甘油酯2.0%、辛/癸酸甘油三酯3%、生育酚乙酸酯0.1%、丁二醇3.0%、甘油3.0%、EDTA-2Na 0.1%、丙烯酸（酯）类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.15%、白芨发酵产物0.5%、透明质酸钠0.05%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.5%、香精0.3%，余量为去离子水。

在本发明中，上述化妆品的制备步骤优选包括以下步骤：

1）制备油相：首先准确称取霍霍巴籽油、聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇、硬脂酸酯/硬脂酸甘油酯、辛/癸酸甘油三酯、生育酚乙酸酯，加热至80~85℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取丁二醇、甘油、EDTA-2Na、丙烯酸（酯）类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，加入体系所需去离子水中，加热至80~85℃，搅拌溶解至透明；

3）将水相加入至油相以10000 rpm/min的速度均质30s~1min；

4)将体系搅拌降温至45℃，依次加入白芨发酵产物、透明质酸钠、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

本发明对上述辅料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的白芨发酵产物在制备美白产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

附图说明

图1为白芨发酵流程。

具体实施方式

实施例1

白芨发酵产物的安全性实验

1 实验方法

1.1 实验用鱼及其受精卵的采集

将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。水温：26±2℃；pH 7.2；电导率：520 µs/cm；光照/黑暗周期：14 h:10 h。暴露实验开始前一天将斑马鱼以雌雄比为1:2配对，光照刺激下自然交配产卵。

1.2 暴露实验

1）挑选发育至0~3 hpf (hours post-fertilization)的健康斑马鱼鱼胚置于6孔细胞培养板中，20尾/孔，每孔加入5 mL实验溶液。以斑马鱼养殖水为空白对照组。

2）分别于24、48和72 hpf时在体视显微镜下观察并统计鱼胚的孵化、畸形和死亡数量。其中畸形形态包括：头部畸形、心包水肿、卵黄囊水肿、血液堵塞、脊柱弯曲、尾部弯曲、发育迟缓等；死亡状态判断为：卵黄囊凝结、心跳停止。

2 实验结果

白芨发酵产物对鱼胚死亡率、孵化率和畸形率的影响见表1、表2和表3。

表1白芨发酵产物对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表2白芨发酵产物对鱼胚孵化率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表3白芨发酵产物对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

注：死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；孵化率%=孵化胚胎数/存活胚胎数*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表1、表2、表3可知，白芨发酵产物浓度一直至8%时在致死量、孵化率及畸形率三方面均无显著性差异，可以得出结论即本配方中使用的0.2%-1%白芨发酵产物绝对是安全的，无任何毒副作用。

实施例2

白芨发酵产物减缓传统防腐剂负面作用实验

1 实验方法

一般地，化妆品配方中需加入防腐剂进行防腐。防腐剂存在一定毒性。本实验选用常用防腐剂苯氧乙醇进行白芨发酵产物的防腐效果测试。参见实施例4实验方法，设定空白对照组、1%苯氧乙醇组和添加1%苯氧乙醇的白芨发酵产物组（下面简称样品），探究其对鱼胚死亡率和畸形率的影响。

2 实验结果

2.1样品对鱼胚安全性的影响

（1）1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表4、表5。

表4 1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表5 1%苯氧乙醇对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

2.2 样品对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表6、表7。

表6 样品对鱼胚死亡率（%）的影响

表7 样品对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表4、表6可知，白芨发酵产物和苯氧乙醇协同作用时对苯氧乙醇致死率无影响，但是对比表5、表7可知，两者在协同作用时，白芨发酵产物在一定程度上可以减弱传统防腐剂苯氧乙醇的致畸作用。

实施例3

白芨发酵产物的美白实验

1 实验方法

1.1 黑色素生成研究

1.1.1 挑选受精卵后9 hpf（hours post-fertilization）的健康AB系斑马鱼胚胎随机置于6孔细胞培养板，30枚/孔，每孔加入5 mL溶液。实验另设立阳性对照组（熊果苷）和空白对照组（斑马鱼养殖水），每组设3个复孔。置于曲线控制生化培养箱中孵育。

1.1.2 孵育至72h时加入裂解液溶液，并超声制备成匀浆液。离心，取沉淀，并震动使离心管中黑色素充分溶解。取100 μL溶液置于96孔板中，用酶标仪于405 nm波长处测定吸光度。按下列公式计算样品对黑色素合成的抑制率:

1.2 酪氨酸酶活性研究

1.2.1 挑选受精卵后9 hpf（hours post-fertilization）的健康AB系斑马鱼胚胎随机置于6孔细胞培养板，30枚/孔，每孔加入5 mL溶液。实验另设立阳性对照组（熊果苷）和空白对照组（斑马鱼养殖水），每组设3个复孔。置于曲线控制生化培养箱中孵育。

1.2.2 孵育至72h时加入裂解液溶液，并超声制备成匀浆液。离心，取上清液置于96孔板中，同时加入左旋多巴溶液，孵育1 h。使用酶标仪检测各实验组的吸光值（OD475值）。酪氨酸酶活性抑制率按下列公式计算:

2 实验结果

2.1 黑色素生成研究

白芨发酵产物对斑马鱼黑色素生成的抑制效果见表8。由表8可知，空白对照组斑马鱼体内存在大量黑色素沉着，白芨发酵产物处理组斑马鱼体内黑色素沉着则显著减少，其中随着白及发酵产物浓度增大，斑马鱼体内黑色素沉着也在相应减少，即当白芨发酵产物浓度大于等于0.2%时，对斑马鱼体内黑色素合成有抑制作用，且与浓度呈正相关性。

表8 白芨发酵产物对黑色素抑制率的影响

（注：**表示具有统计学差异，**P＜0.01）

2.2络氨酸酶活性研究

白芨发酵产物对斑马鱼络氨酸酶活性研究的结果见表9。由表9可知，当白芨发酵产物浓度大于等于0.2%时，对斑马鱼体内络氨酸酶活性有较强的的抑制作用，且与浓度呈正相关。

表9 白芨发酵产物对络氨酸酶活性抑制率的影响

（注：**表示具有统计学差异，**P＜0.01）。

Claims (9)

1.白芨发酵产物在制备美白产品中的应用。

2.白芨发酵产物在制备具有美白功能的化妆品中的应用。

3.一种白芨发酵产物，其特征在于，所述白芨发酵产物中白芨多糖含量为3.78%。

4.权利要求1或2所述应用中的白芨发酵产物或权利要求3所述白芨发酵产物的提取方法，包括以下步骤：所述白芨发酵产物由以下微生物发酵方法制备，具体步骤如下：

（1）白芨块茎准确称量后粉碎，过100目筛；

（2）按1：（100~120）（g/mL）的料液比加入灭菌的去离子水，调pH为6.0~6.5；

（3）按照1‰投料比例接种混菌种子液，搅拌均匀，发酵罐设定温度37℃，发酵时间48~50 h，开始发酵；

（4）发酵完成后在8000~10000rpm/min条件下离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤除渣，得发酵产物滤液。

5.根据权利要求（2）所述的灭菌去离子水，其灭菌方法为在121℃，0.1Mpa的条件下灭菌20min。

6.根据权利要求（3）所述的酿酒酵母种子液培养基的配置方法，其特征在于将MRS培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌后，接种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）以及嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus），设置培养温度为 37℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；分别使菌体浓度达到 108CFU/mL。

7.一种含有白芨发酵产物的美白产品，其特征在于，所述美白产品包括权利要求3所述的白芨发酵方法发酵得到的白芨发酵产物和辅料。

8.一种基于权利要求3所述的白芨发酵产物含有白芨发酵产物的美白化妆品，包括以下质量份的组分：霍霍巴籽油2.5%、聚二甲基硅氧烷1.5%、鲸蜡硬脂醇1.8%、硬脂酸酯/硬脂酸甘油酯2.0%、辛/癸酸甘油三酯3%、生育酚乙酸酯0.1%、丁二醇3.0%、甘油3.0%、EDTA-2Na0.1%、丙烯酸（酯）类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.15%、白芨发酵产物0.5%、透明质酸钠0.05%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.5%、香精0.3%，余量为去离子水。

9.一种基于权利要求3所述的白芨发酵产物的美白化妆品的制备方法，包括如下步骤：

1）制备油相：首先准确称取霍霍巴籽油、聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇、硬脂酸酯/硬脂酸甘油酯、辛/癸酸甘油三酯、生育酚乙酸酯，加热至80~85℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取丁二醇、甘油、EDTA-2Na、丙烯酸（酯）类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，加入体系所需去离子水中，加热至80~85℃，搅拌溶解至透明；

3）将水相加入至油相以10000 rpm/min的速度均质30s~1min；

4)将体系搅拌降温至45℃，依次加入白芨发酵产物、透明质酸钠、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

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