CN112353733A - 一种罗布麻发酵产物的发酵方法及其在抗炎化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及罗布麻发酵产物在制备抗炎产品中的应用。本发明提供了罗布麻发酵产物在抗炎方面的应用，罗布麻发酵产物具有良好的体内抗炎活性。本发明还提供了罗布麻发酵产物的发酵方法，使发酵液中有效成分罗布麻多糖含量高达0.56%。

Description

一种罗布麻发酵产物的发酵方法及其在抗炎化妆品中的应用

技术领域

本发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及一种含有罗布麻发酵产物的抗炎化妆品及其制备方法。

背景技术

罗布麻(Apocynum venetum L.)为捩花目夹竹桃科罗布麻属直立半灌木，叶、根、茎、花、全草均可入药，属于多年生宿根草本植物，具有很强的抗逆性。从每年3月下旬开始，到4月中旬左右，罗布麻便开始萌芽生长，在5月下旬到6月中旬期间进入开花初期，大约在8月下旬至9月中旬进入开花末期，通常情况下花期持续周期长达90天，此时种子便进入到成熟期，年生长周期大约有180天，作为药用植物被收录在《中国药典（2015版）》一部。罗布麻因罗布泊而得名，在古代被称为“泽漆”，主要分布于中国辽宁、吉林、内蒙古、甘肃、新疆、陕西、山西等地区。《陕西中草药》载: “(罗布麻叶) 清凉泻火，强心利尿，降血压。治心脏病，高血压，神经衰弱，肾炎浮肿”。大量药理实验表明，罗布麻活性成分对预防和治疗如高血压、高血脂、冠心病等心血管疾病以及哮喘病、气管炎等呼吸系统疾病有较好的疗效。

通过微生物发酵工艺制备天然产物发酵物，可以有效降低一些天然产物本身固有的毒性，在发酵过程也可以酶解药材细胞壁结构，更充分的释放天然产物的有效成分，提高其利用率。微生物在发酵过程中，亦会产生次生代谢产物，其中就包括多种生物酶，可以有效的把蛋白质、多糖等生物大分子分解为分子量较小的物质，以蛋白质为例，会被蛋白酶水解为具有与其功能性蛋白质相同序列的特异性小的不同分子量的生物活性肽，其特点是分子量低、结构简单且毒副作用低，故易于被人体吸收发挥更强的生物活性，但又具有更高的安全性。有研究表明，发酵后的发酵液可以提高有效成分的物质含量，从而使各种药理活性得到显著提高。此外，微生物发酵还具有成本低、不易致敏等特点是当今研究和开发的热点。

炎症反应是人体应对各种刺激的一种防御性反应，参与了许多慢性疾病的病理过程，构成慢性疾病的病因和病理基础。在炎症反应过程中，中性粒细胞和吞噬细胞会被激活并释放一系列炎症因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，两者功能相似，相互协作，可以清除体内外有害刺激物并维持内环境稳态，从而促进受损组织修复和愈合，共同保护机体免受各种不利刺激。但是，由于急性炎症未治愈，或中性粒细胞和巨噬细胞的过度激活和浸润导致的慢性炎症又会引起很多慢性疾病的发生和发展。肌底炎症反应本质上作为一种生理屏障，对皮肤起着一种保护作用，是一种人体的正常生理反应，但是当皮肤出现粉刺、过敏等一系列问题问题引起的炎症反应超过了免疫应答限度，皮肤就会出现红肿、刺痛等症状。

发明内容

针对目前普遍存在的肌底炎症问题，本发明提供了一种罗布麻发酵产物制备方法及其在抗炎化妆品中的应用。本发明提供的罗布麻发酵产物具有显著的抗炎功效。本发明还提供了罗布麻发酵产物的制备方法，该制备方法有发酵工艺简单、能够降低发酵成本和易于扩大生产的优势。罗布麻发酵液中富含以多糖为主的多种植物次生代谢产物，并在微生物发酵条件下转变为分子量更小的有效成分，使其变得更易于被人体吸收利用，同时该方法发酵得到的罗布麻发酵产物是一种安全性高的抗炎化妆品原料。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了罗布麻发酵产物在制备抗炎产品中的应用。

本发明还提供了罗布麻发酵产物在制备具有抗炎功能的化妆品中的应用。

本发明提供的罗布麻发酵产物具有减缓常用化妆品防腐剂（如苯氧乙醇）的细胞毒性的功效，能够大幅提高具有抗炎功效的化妆品的安全性。

本发明提供了一种罗布麻发酵产物，所述罗布麻发酵产物中罗布麻多糖含量为0.56%。

本发明提供的发酵方法发酵工艺简单，发酵成本低廉，易于扩大生产；可以提高发酵产物中有效成分罗布麻多糖的含量，能够极大程度的提高对罗布麻的利用程度。具体发酵工艺如下：精确称取罗布麻叶片，进行粉碎过筛处理得到罗布麻叶片粉末，所述粉末的粒径优选为过120目筛，然后按料液比1：（10~12）（g/mL）加入无菌的去离子水，并调节pH为6.0~6.5；在本发明中，所述发酵的料液比进一步优选为1：10，去离子水灭菌条件进一步优选为在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min。

得到罗布麻夜片粉末和去离子水的混合物后，按照1‰投料比例接种酿酒酵母种子液（Saccharomyces cerevisiae），通过充分搅拌使其混合均匀，发酵罐设定温度30℃，发酵时间60~72 h，开始发酵；在本发明中，所述的酿酒酵母种子液制备方法优选为：将麦芽汁培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌后，接种酿酒酵母菌，设置培养温度为 28℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；使菌体浓度达到 108CFU/mL，发酵时间进一步优选为72h。

发酵完成后，在8000~10000rpm/min条件下进行离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤得到发酵产物滤渣和滤液，取其中发酵产物滤液即为罗布麻发酵产物；在本发明中，离心条件进一步优化为8000rpm/min，破壁条件进一步优化1200Bar。

本发明通过对发酵工程的各步骤进行优化，多个优化步骤相互配合能够有效提高发酵的效率和效果。经过上述发酵方法发酵得到的罗布麻发酵产物中罗布麻多糖的含量为0.56%。

本发明对上述发酵原料等物品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

本发明还提供了一种含有罗布麻发酵产物的抗炎化妆品，所述抗炎产品包括上述发酵方法得到的罗布麻发酵产物。本发明提供的抗炎产品具有优越的抗炎效果，在斑马鱼炎症前期能够有效发挥抗炎、清除中性粒细胞和巨噬细胞作用。

本发明还提供了一种基于上述的罗布麻发酵产物或上述发酵方法发酵得到的罗布麻发酵产物的抗炎化妆品，包括以下质量份的组分：EDTA-2Na 3.00%~6.00%、甘油3.00~5.00%、黄原胶0.10~0.30%、角鲨烷3.00~6.00%、甜扁桃油2.00~4.00%、辛酸/癸酸甘油三酯2.00~4.00%、牛油果油3.00~4.00%、二甲基聚硅氧烷0.20~1.00%、霍霍巴脂0.50~1.00%、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯 2.00~3.00%、甘油硬脂酸酯0.50~1.50%、山梨坦硬脂酸酯0.50~1.00%、红没药醇0.10~0.50%、硬脂酸0.50~1.50%、罗布麻发酵产物0.20~1.00%、三乙醇胺0.10~0.30%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.30~0.70%、香精0.20~0.40%，余量为去离子水。

在本发明中，上述化妆品的制备步骤优选包括以下步骤：

1）制备油相：首先准确称取角鲨烷、甜扁桃油、辛酸/癸酸甘油三酯、牛油果油、二甲基聚硅氧烷、霍霍巴脂、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、山梨坦硬脂酸酯、红没药醇、硬脂酸，加热至80℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取EDTA-2Na、甘油，加入体系所需去离子水中，搅拌溶解，准确称取黄原胶分散于溶解后的体系中，加热至80℃；

3）将油相加入至水相以10000 rpm/min的速度均质至温度降为60℃；

4）当体系降温至35℃，依次加入罗布麻发酵产物、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，用三乙醇胺调节pH至5.5~6.0，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

本发明对上述辅料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的罗布麻发酵产物在制备抗炎产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

附图说明

图1 罗布麻发酵流程

图2 罗布麻发酵产物对斑马鱼噬细胞和中性粒细胞聚集影响

图3 罗布麻发酵产物对斑马鱼噬细胞和中性粒细胞清除影响。

具体实施方式

实施例1

罗布麻发酵产物的安全性实验

1 实验方法

1.1 实验用鱼及其受精卵的采集

将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。水温：26±2℃；pH 7.2；电导率：520 µs/cm；光照/黑暗周期：14 h:10 h。暴露实验开始前一天将斑马鱼以雌雄比为1:2配对，光照刺激下自然交配产卵。

1.2 暴露实验

1）挑选发育至0~3 hpf (hours post-fertilization)的健康斑马鱼鱼胚置于6孔细胞培养板中，20尾/孔，每孔加入5 mL实验溶液。以斑马鱼养殖水为空白对照组。

2）分别于24、48和72 hpf时在体视显微镜下观察并统计鱼胚的孵化、畸形和死亡数量。其中畸形形态包括：头部畸形、心包水肿、卵黄囊水肿、血液堵塞、脊柱弯曲、尾部弯曲、发育迟缓等；死亡状态判断为：卵黄囊凝结、心跳停止。

2 实验结果

罗布麻发酵产物对鱼胚死亡率、孵化率和畸形率的影响见表1、表2和表3。

表1罗布麻发酵产物对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表2 罗布麻发酵产物对鱼胚孵化率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表3 罗布麻发酵产物对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

注：死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；孵化率%=孵化胚胎数/存活胚胎数*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表1、表2、表3可知，罗布麻发酵产物浓度一直至8%时在致死量、孵化率及畸形率三方面均无显著性差异，可以得出结论即本配方中使用的0.2%-1%罗布麻发酵产物绝对是安全的，无任何毒副作用。

实施例2

罗布麻发酵产物减缓传统防腐剂负面作用实验

1 实验方法

一般地，化妆品配方中需加入防腐剂进行防腐。防腐剂存在一定毒性。本实验选用常用防腐剂苯氧乙醇进行罗布麻发酵产物的防腐效果测试。参见实施例4实验方法，设定空白对照组、1%苯氧乙醇组和添加1%苯氧乙醇的罗布麻发酵产物组（下面简称样品），探究其对鱼胚死亡率和畸形率的影响。

2 实验结果

2.1样品对鱼胚安全性的影响

（1）1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表4、表5。

表4 1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表5 1%苯氧乙醇对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

2.2 样品对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表6、表7。

表6 样品对鱼胚死亡率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001）

表7 样品对鱼胚畸形率（%）的影响

（与空白对照组比较：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

死亡率% =死亡胚胎数/N*100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/N*100%

通过分析表4、表6可知，罗布麻发酵产物和苯氧乙醇协同作用时对苯氧乙醇致死率无影响，但是对比表5、表7可知，两者在协同作用时，罗布麻发酵产物在一定程度上可以减弱传统防腐剂苯氧乙醇的致畸作用。

实施例3

罗布麻发酵产物的抗炎实验

1 实验方法

1.1 巨噬细胞和中性粒细胞的聚集实验

1.1.1 选取3 dpf的转基因斑马鱼(corola: EGFP)，用受试样品溶液处理1 h，将斑马鱼幼鱼麻醉，显微镜下用手术刀片切除50%尾鳍，并随机分组，每组20尾，每组设3个复孔，实验另设空白对照组（斑马鱼养殖水），继续孵育6 h；

1.1.2 在荧光显微镜下观察拍摄切口处的巨噬细胞和中性粒细胞，并且通过对切口处的炎症细胞计数判断受试样品对聚集过程是促进还是抑制的。

1.2 巨噬细胞和中性粒细胞的清除实验

1.2.1 选取72 hpf的转基因斑马鱼(corola: EGFP)，用受试样品处理1 h，将斑马鱼幼鱼麻醉，显微镜下用手术刀片切除50%尾鳍，并随机分组，每组20尾，每组设3个复孔，实验另设空白对照组（斑马鱼养殖水），继续孵育6 h；

1.2.2 在荧光显微镜下观察拍摄切口处的巨噬细胞和中性粒细胞，并且通过统计切口处的炎症细胞数计算清除过程的促进或抑制作用。

2 实验结果

2.1 巨噬细胞和中性粒细胞的聚集实验

罗布麻发酵产物处理后斑马鱼尾部中性粒细胞和巨噬细胞向伤口处聚集结果见图2。空白对照组斑马鱼伤口处聚集的中性粒细胞和巨噬细胞的数量为 26.8±0.75，1%、2%、4%罗布麻发酵产物处理组的细胞数量分别为 18.4±1.50，15.2±0.75，11.8±0.75。结果表明，罗布麻发酵产物可以抑制斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞向伤口处聚集，其机制可能是抑制中性粒细胞和巨噬细胞的激活或者诱导中性粒细胞和巨噬细胞凋亡。由于斑马鱼在切尾6 h时中性粒细胞的聚集达到最高峰，随后细胞数量保持稳定或者逐渐减少，切尾6 h可作为斑马鱼炎症前期和中后期的分界点。因此，本次实验结果表明，罗布麻发酵产物在斑马鱼炎症前期就可以发挥抗炎作用。

2.2 巨噬细胞和中性粒细胞的清除实验

罗布麻发酵产物处理后鱼尾伤口处中性粒细胞和巨噬细胞清除的结果见图 3。空白对照组斑马鱼伤口处中性粒细胞和巨噬细胞聚集的数量为 28.6±1.62，1%、2%、4%罗布麻发酵产物处理组的细胞数量分别为19.6±1.02，17.6±1.02，15.6±1.50。结果表明，罗布麻发酵产物可以促进斑马鱼伤口处中性粒细胞和巨噬细胞的清除，其机制可能是促进中性粒细胞和巨噬细胞的反向迁移或者诱导中性粒细胞和巨噬细胞凋亡，说明罗布麻发酵产物在炎症中后期也能发挥抗炎作用。

Claims (9)

1.罗布麻发酵产物在制备抗炎产品中的应用。

2.罗布麻发酵产物在制备具有抗炎功能的化妆品中的应用。

3.一种罗布麻发酵产物，其特征在于，所述罗布麻发酵产物中罗布麻多糖含量为0.56%。

4.权利要求1或2所述应用中的罗布麻发酵产物或权利要求3所述罗布麻发酵产物的发酵方法，包括以下步骤：所述罗布麻发酵产物由以下微生物发酵方法制备，具体步骤如下：

（1）罗布麻叶片准确称量后粉碎，过120目筛；

（2）按1：（10~12）（g/mL）的料液比加入灭菌的去离子水，调pH为6.0~6.5；

（3）按照1‰投料比例接种酿酒酵母种子液（Saccharomyces cerevisiae），搅拌均匀，发酵罐设定温度30℃，发酵时间60~72 h，开始发酵；

（4）发酵完成后在8000~10000rpm/min条件下离心，取上清液在1150~1200Bar条件下完成破壁，冷却后通过0.45μm微孔滤膜过滤除渣，得发酵产物滤液。

5.根据权利要求（2）所述的灭菌去离子水，其灭菌方法为在121℃，0.1Mpa的条件下灭菌20min。

6.根据权利要求（3）所述的酿酒酵母种子液培养基的配置方法，其特征在于将麦芽汁培养基培养基在121℃，0.1 MPa条件下灭菌20min后，接种酿酒酵母菌，设置培养温度为 28℃，摇床转速为 120 r/min，培养24 h；分别使菌体浓度达到 108CFU/mL。

7.一种含有罗布麻发酵产物的抗炎产品，其特征在于，所述抗炎产品包括权利要求3所述的罗布麻发酵方法发酵得到的罗布麻发酵产物和辅料。

8.一种基于权利要求3所述的罗布麻发酵产物含有罗布麻发酵产物的抗炎化妆品，包括以下质量份的组分：EDTA-2Na 3.00%~6.00%、甘油3.00~5.00%、黄原胶0.10~0.30%、角鲨烷3.00~6.00%、甜扁桃油2.00~4.00%、辛酸/癸酸甘油三酯2.00~4.00%、牛油果油3.00~4.00%、二甲基聚硅氧烷0.20~1.00%、霍霍巴脂0.50~1.00%、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯 2.00~3.00%、甘油硬脂酸酯0.50~1.50%、山梨坦硬脂酸酯0.50~1.00%、红没药醇0.10~0.50%、硬脂酸0.50~1.50%、罗布麻发酵产物0.20~1.00%、三乙醇胺0.10~0.30%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.30~0.70%、香精0.20~0.40%，余量为去离子水。

9.一种基于权利要求3所述的罗布麻发酵产物的抗炎化妆品的制备方法，包括如下步骤：

1）制备油相：首先准确称取角鲨烷、甜扁桃油、辛酸/癸酸甘油三酯、牛油果油、二甲基聚硅氧烷、霍霍巴脂、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、山梨坦硬脂酸酯、红没药醇、硬脂酸，加热至80℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取EDTA-2Na、甘油，加入体系所需去离子水中，搅拌溶解，准确称取黄原胶分散于溶解后的体系中，加热至80℃；

3）将油相加入至水相以10000 rpm/min的速度均质至温度降为60℃；

4)当体系降温至35℃，依次加入罗布麻发酵产物、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，用三乙醇胺调节pH至5.5~6.0，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

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