CN112322791A - 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 - Google Patents
一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该方法根据新型鸭依赖属病毒基因组保守序列设计引物组：外引物(N‑DAAV‑F3和N‑DAAV‑B3)、内引物(N‑DAAV‑FIP和N‑DAAV‑BIP)和环引物(N‑DAAV‑LF和N‑DAAV‑LB)。具体序列分别见SEQ ID NO.1‑6。根据所设计的引物组建立一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。该试剂盒检测方法与鸭常见传染病病原不发生交叉反应。本发明的检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，便于基层临床现场使用，方便快速。
Description
技术领域
本发明属于动物病毒学检测领域，具体涉及一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependoparvovirus)，是目前发现的一类结构简单的DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。腺相关病毒为无囊膜、直接约为20-25nm的病毒，其基因组长约4.7kb。腺相关病毒基因组末端存在有末端重复倒置序列(inverted terminalrepeats，ITR)，其基因组编码两个大的开发阅读框：rep基因(参与病毒的复制和整合)和cap基因(编码病毒衣壳结构蛋白)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中发现存在鸭源腺相关病毒感染，其Cap基因全长(2217bp)和GenBank中的鸭源腺相关病毒MHH-05-2015(GenBank登录号KX583629)的核苷酸同源性为99.5％。由于腺相关病毒易于腺病毒科病毒混淆，基于国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV)的病毒分类命名规则，本研究将其命名为新型鸭依赖属病毒(novel duckorigin adeno-associated virus，N-DAAV)，将本研究团队发现的病毒命名为新型鸭依赖属病毒FJFF001株，将其Cap基因全长提交GenBank数据库，获得登录号为MW286836。
目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法、实时荧光定量PCR方法(real time PCR)和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)反应等方法。但是普通的PCR方法以及灵敏度更高的荧光定量PCR方法，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)，中文名为“环介导等温扩增反应”。环介导等温扩增技术可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：①LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高。②LAMP技术扩增的特异性非常高，使用的特异性引物可以识别目的序列上特异性的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响。③阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料(如本发明的荧光目视检测试剂)，根据颜色的变化通过荧光照射装置进行紫外光照射检测；还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，LAMP方法还具有特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，特别适合基层和现场使用。目前，还未见针对新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增(LAMP)反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白，建立的LAMP检测方法及其试剂盒对后续开展新型鸭依赖属病毒分子流行病学和科学防控该病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。利用该引物组可以特异性的检测新型鸭依赖属病毒，为基层和现场提供一种简便、快捷的检测新型鸭依赖属病毒的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组，所述的引物由外引物(N-DAAV-F3和N-DAAV-B3)、内引物(N-DAAV-FIP和N-DAAV-BIP)、环引物(N-DAAV-LF和N-DAAV-LB)组成，上述引物序列如下：
N-DAAV-F3：5’-CAACGAACGTCGAAAGGAGAA-3’，
N-DAAV-B3：5’-TACCCACTCCATCGGCAC-3’；
N-DAAV-FIP：
5’-CCAGCTCCTTCTACTTCTTGCGTTATCCCAAGAGGAAAAAGGCC-3’，
N-DAAV-BIP：
5’-CACATCTACCGGAGGGGAAACCGTCATCGCCCATTGGTGC-3’；
N-DAAV-LF：5’-AGAAGGGGGCTTTTCTTCTC-3’，
N-DAAV-LB：5’-AATCTAATACAATGTCTGCAGGGG-3’。
一种含所述引物组的新型鸭依赖属病毒检测试剂盒。
所述的新型鸭依赖属病毒检测试剂盒的LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液(RM)12.5μL、N-DAAV-FIP(20pmol)和N-DAAV-BIP(20pmol)各2μL、N-DAAV-LF(20pmol)和N-DAAV-LB(20pmol)各1μL、N-DAAV-F3(20pmol)和N-DAAV-B3(20pmol)各0.25μL、荧光目视检测试剂(FD)1μL、BstDNA聚合酶1μL，其余用超纯水补足至终体积25μL。反应条件为63℃反应50min。
所述新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组在制备新型鸭依赖属病毒快速诊断试剂中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
(1)操作简便、快速：本发明建立的LAMP方法操作简便、无需复杂昂贵仪器，便于基层临床现场使用，方便快速。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在1h内完成。反应结果判定方法简单，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液明显浑浊，阴性管样品管反应液颜色变化不大。经紫外线照射装置(254nm)照射可见，阳性样品发出翠绿色荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见连续梯状电泳条带。
(2)灵敏度高：本发明建立的LAMP方法检测新型鸭依赖属病毒，最低检测限为108拷贝/μL。
(3)特异性强：本发明建立的LAMP方法对其他传染病(鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒)检测均为阴性，仅对新型鸭依赖属病毒出现阳性结果。
附图说明
图1是本发明新型鸭依赖属病毒LAMP特异性实验(直接观察)结果图。其中，1：鸭3型腺病毒；2：H9亚型禽流感病毒；3：禽1型副粘病毒；4：新型鸭依赖属病毒；5：禽坦布苏病毒；6：番鸭呼肠孤病毒；7：鸭源鹅多瘤病毒。
图2是本发明新型鸭依赖属病毒LAMP方法敏感性试验(琼脂糖电泳)结果图。其中，1：1.08×105拷贝/μL；2：1.08×104拷贝/μL；3：1.08×103拷贝/μL；4：1.08×102拷贝/μL；5：1.08×101拷贝/μL；6：1.08×100拷贝/μL；M：DNA分子量标准。
具体实施方式
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1
一、实验方法
1试验毒株
试验用病原新型鸭依赖属病毒、鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2核酸DNA的提取
用病毒核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit，北京全式金生物技术有限公司，也可用其他商品化公司等效试剂盒)提取相关病毒(新型鸭依赖属病毒、鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒)的核酸，均放置-20℃保存备用。
3 LAMP检测方法的建立
3.1 LAMP的引物设计
根据GenBank中登录的所有新型鸭依赖属病毒基因组序列特征，结合新型鸭依赖属病毒福建株(命名为FJFF001株，GenBank登录号MW286836)序列特征，设计本发明的特异性的LAMP引物组，包括外引物(N-DAAV-F3和N-DAAV-B3)、内引物(N-DAAV-FIP和N-DAAV-BIP)和环引物(N-DAAV-LF和N-DAAV-LB)，具体序列见SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6。将设计好的相关引物，经NCBI数据库进行BLAST分析，均符合试验预期。
利用设计的外引物(N-DAAV-F3和N-DAAV-B3)(内引物N-DAAV-FIP和N-DAAV-BIP在外引物扩增区域以内，条带较短，常规PCR检测易和引物二聚体混淆，故本发明仅进行引物BLSAT分析)对新型鸭依赖属病毒、鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCRSuperMix(+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物(N-DAAV-F3和N-DAAV-B3，10μM)各1μL、提取的核酸(新型鸭依赖属病毒、鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒)1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃30s，53℃30s，72℃45s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果仅对新型鸭依赖属病毒扩增出现特异性目的条带；对其他病原核酸(如鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒)均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。
3.2 LAMP方法的建立和优化
按照环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒(SLP204 Laoopamp DNA扩增反应试剂盒)配置LAMP试验反应液，反应体系为25μL。每25μL反应体系中含有：2×反应缓冲液(RM)12.5μL、N-DAAV-FIP(20pmol)和N-DAAV-BIP(20pmol)各2μL、N-DAAV-LF(20pmol)和N-DAAV-LB(20pmol)各1μL、N-DAAV-F3(20pmol)和N-DAAV-B3(20pmol)各0.25μL、荧光目视检测试剂(FD)1μL、BstDNA聚合酶1μL，其余用超纯水补足至终体积25μL。
对实验不同温度(61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)、不同时间(10min、20min、30min、40min、50min、60min)检测本研究的引物组反应性能。优化后的最佳反应条件为63℃反应50min。
3.3特异性试验
以新型鸭依赖属病毒FJFF001株核酸为阳性对照，取鸭3型腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副粘病毒、禽坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭源鹅多瘤病毒提取核酸，分别用优化后的LAMP条件进行检测，评估建立LAMP的特异性。结果可见在紫外光(254nm)观察(图1)，仅新型鸭依赖属病毒可见特征性翠绿色荧光(4号样品)，其他均未见特异性翠绿色荧光。
3.4敏感性试验
3.4.1阳性标准品的构建
针对新型鸭依赖属病毒FJFF001株CAP基因设计特异性引物(N-DAAV-F01和N-DAAV-R01)，用于制备标准品质粒；其上游引物N-DAAV-F01(引物序列为：5’-CTATCTGAAATATAACCACGCA-3’)和下游引物N-DAAV-R01(引物序列为：5’-CTGAATCCAAAGTACGAGTTGTCT-3’)进行PCR扩增含有靶序列的基因片段(目的片段大小为531bp)。
使用PCR扩增试剂(2×PCR Master MIX)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液25μL、上下游引物(N-DAAV-F01和N-DAAV-R01)(引物浓度为10μmol·L-1)各1μL、提取的核酸模板DNA 1μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸60s，40个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将新型鸭依赖属病毒cap基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(N-DAAV-F01和N-DAAV-R01)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品(T-N-DAAV)，分装后置于-20℃保存备用。
对构建的阳性标准品(T-N-DAAV)进行连续稀释(质粒稀释后浓度分别为1.08×105、1.08×104、1.08×103、1.08×102、1.08×101、1.08×100拷贝/μL)，按照优化后的LAMP条件进行检测，获得其敏感性试验数据。
结果可见，质粒浓度分别为1.08×105、1.08×104、1.08×103、1.08×102均出现连续梯状电泳条带，本发明的最低检测限为1.08×102拷贝/μL(即108拷贝/μL，第4泳道)。
4建立的LAMP检测方法的临床应用
对本研究室收集的76份鸭组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应的基因组DNA，按照优化后的LAMP条件进行检测。结果可见，有3份样品检测到新型鸭依赖属病毒感染阳性，阳性率为3.95％(3/76)。
将3份LAMP样品利用报道的文献(Su XN,et al.,Isolation and geneticcharacterization of a novel adeno-associated virus from Muscovy ducks inChina，Poultry science,2017,96(11):3867-3871.)的方法进行检测，结果和LAMP检测的结果一致，符合率为100％。将相关阳性样品利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收后克隆测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的新型鸭依赖属病毒基因片段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caacgaacgt cgaaaggaga a 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tacccactcc atcggcac 18
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccagctcctt ctacttcttg cgttatccca agaggaaaaa ggcc 44
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cacatctacc ggaggggaaa ccgtcatcgc ccattggtgc 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
agaagggggc ttttcttctc 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aatctaatac aatgtctgca gggg 24
Claims (3)
1.一种新型鸭依赖属病毒环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的引物由1对外引物N-DAAV-F3和N-DAAV-B3、1对内引物N-DAAV-FIP和N-DAAV-BIP、1对环引物N-DAAV-LF和N-DAAV-LB组成，上述引物序列如下：
N-DAAV-F3：5’-CAACGAACGTCGAAAGGAGAA-3’，
N-DAAV-B3：5’-TACCCACTCCATCGGCAC-3’，
N-DAAV-FIP：
5’-CCAGCTCCTTCTACTTCTTGCGTTATCCCAAGAGGAAAAAGGCC-3’，
N-DAAV-BIP：
5’-CACATCTACCGGAGGGGAAACCGTCATCGCCCATTGGTGC-3’，
N-DAAV-LF：5’-AGAAGGGGGCTTTTCTTCTC-3’，
N-DAAV-LB：5’-AATCTAATACAATGTCTGCAGGGG-3’。
2.一种含权利要求1所述引物组的新型鸭依赖属病毒检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的新型鸭依赖属病毒检测试剂盒的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，反应体系25μL：2×反应缓冲液12.5μL、20pmol N-DAAV-FIP和20pmol N-DAAV-BIP各2μL、20pmol N-DAAV-LF和20pmol N-DAAV-LB各1μL、20pmol N-DAAV-F3和20pmol N-DAAV-B3各0.25μL、荧光目视检测试剂1μL、BstDNA聚合酶1μL，其余用超纯水补足至终体积25μL。
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