CN112301139A

CN112301139A - 一种检测大肠杆菌o157:h7的特异性靶点、引物、检测方法及应用

Info

Publication number: CN112301139A
Application number: CN202011284156.9A
Authority: CN
Inventors: 别小妹; 孔梁宇; 陆兆新; 胡安妥
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112301139B

Abstract

本发明提供一种检测大肠杆菌O157:H7的特异性靶点、引物、检测方法及应用。本发明的新型靶点，与常规检测靶点相比具有较好的特异性，降低了检测中假阳性的产生；本发明中采用Eva Green第三代饱和荧光染料，该染料具有较高的荧光信号值，提高了检测的灵敏度。同时，该染料即使在高浓度使用时，也为表现出PCR的抑制效果，大幅了检测时熔解曲线的分辨率，进而改善了本发明的检测准确性；检测方法便捷，方便观察，且无需繁琐的电泳操作，检测时间缩短在12h以内；检测过程不涉及抗体，检测成本低，可满足一般实验室的检测需求。

Description

一种检测大肠杆菌O157:H7的特异性靶点、引物、检测方法及应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测大肠杆菌O157:H7的特异性靶点、引物、将其与饱和荧光染料结合，采用双重HRM-RT-PCR方法，对食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测的方法。

背景技术

大肠杆菌分型较多，肠出血性大肠杆菌(Enteroheamorrhagic Escherichiacoli，EHEC)属于致病性大肠杆菌的一种，其中主要的致病菌株为肠出血性大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7)。E.coli O157:H7是一种有鞭毛、无芽孢、可运动的革兰氏阴性杆菌。它是一种严重威胁人群身体健康和公共卫生安全的食源性致病菌，人群感染此菌后经常患有严重的腹部绞痛和出血性腹泻，并且近十分之一的患者发展为溶血性尿毒综合征(HUS)，严重者甚至发展为血小板减少性紫癜(TTP)，死亡率高达30％。在我国，E.coli O157:H7是现有的对国民健康具有重大威胁的致病原之一。

上世纪90年代初，美国第一次发现了由于感染E.coli O157:H7而引起出血性肠炎事件。我国江苏省徐州市与1986年首次分离到E.coli O157:H7，之后相继有感染性疾病的暴发。1999～2000年安徽、江苏、河南发生以溶血性尿毒综合征为主的疫情暴发，累计报告E.coli O157:H7引起的溶血性尿毒综合征275例，死亡241例，病死率高达87.6％。2009～2012年，西安市E.coli O157:H7监测研究显示腹泻病人及宿主动物存在感染，此外在食品中亦有检出。目前，肠出血性大肠杆菌检测主要使用传统的培养方法，整个检测过程步骤较多，时间较长，一般需要4-6个工作日，而且干扰的因素较多，检测结果的判定较复杂，给食品检测带来非常不利的影响。

目前，随着分子生物学的不断发展尤其是聚合酶链式反应(PCR)的发展，通过分子生物学技术检测鉴定E.coli O157:H7变得更加可靠。用于E.coli O157:H7的PCR检测的靶点研究较少，当前常用的检测靶点主要集中于毒素基因(如stx 1、stx 2)、鞭毛蛋白基因(如fliC、yehA)及一些代谢酶基因(如rfbE)等。部分基因特异性较差且往往难以广泛涵盖大肠杆菌O157:H7不同的亚型。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的如下1)-5)任一种物质作为特异性靶点在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7中的应用：1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109。

本发明的第二个目的是提供如下1)-5)任一种物质作为特异性靶点在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109。

本发明的第三个目的是提供一种检测如下1)-5)任一种物质的制品在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109。

本发明的第四个目的是提供一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的双重HRM-RT-PCR引物。

本发明的第五个目的是提供上述引物在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒的应用。

本发明的第六个目的是提供一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒。

本发明的第七个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法；通过生物信息学方法快速获得E.coli O157:H7特异性高的靶点，结合第三代饱和荧光染料及实时荧光PCR方法，实现食品中E.coli O157:H7的快速检测。该检测通过对扩增过程中的Ct值、Tm值分析可对样品进行实时检测，无需下游电泳检测等繁琐操作。另外，饱和荧光染料的使用进一步提升了检测的灵敏度，解决了检测过程复杂、检测周期长等问题。

本发明请求保护如下1)-5)任一种物质作为特异性靶点在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7中的应用：

1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712碱基序列如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还保护如下1)-5)任一种物质作为特异性靶点在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：

1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还保护检测如下1)-5)任一种物质的制品在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：

1)NC_002695.2_cds_283；2)NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3)NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4)NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5)NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还请求保护一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的双重HRM-RT-PCR引物，所述引物分别为：G1、G10；其中，

G1-F：5’-CGCGAGGACTTTGACTCCTT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

G1-R:5’-CCTCGGCGTTTCCCATGATA-3’，如SEQ ID NO.8所示；

G10-F:5’-TTACCCGACGCCTCAACAAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；

G10-R:5’-TGGTGGCATTACTGAACGGT-3’，如SEQ ID NO.14所示。

本发明还保护上述PCR引物在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒中的应用。

本发明还保护一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒，所述试剂盒中包括G1、G10，其中：

G1-F：5’-CGCGAGGACTTTGACTCCTT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

G1-R:5’-CCTCGGCGTTTCCCATGATA-3’，如SEQ ID NO.8所示；

G10-F:5’-TTACCCGACGCCTCAACAAC-3’，如SEQ ID NO.13所示；

G10-R:5’-TGGTGGCATTACTGAACGGT-3’，如SEQ ID NO.14所示。

本发明还保护一种非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：(1)肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性靶点发掘；(2)双重HRM-RT-PCR体系构建；(3)检测特异性、灵敏度评估。

本发明提供一种便捷的靶点发掘方法，根据本地比对及在线验证，共获得12个特异性较好的靶点，具体信息如附表1、图1所示。随后进行引物设计及普通PCR特异性验证，最终得到5对特异性较好的引物对(G1、G7、G8、G10、G14)，序列如附表4所示。

为确保检测的准确性，本发明提供了一种双重HRM-RT-PCR检测体系，根据G1、G10扩增片段不同的Tm值对扩增结果的准确性进行评估，避免了繁琐的电泳检测。检测体系的建立包括以下步骤：(1)双重RT-PCR体系靶点筛选；(2)dNTP浓度优化、Ex Taq聚合酶浓度优化、引物浓度及比例优化、退火温度优化、扩增循环数优化；(3)不同饱和荧光染料优化。

根据实验室现有的标准菌株及分离株，对构建体系的灵敏度及特异性检测特异性进行评估。

最终得到的G1-G10双重HRM-RT-PCR的体系为：10×Ex Buffer 2μL，2.5mM的dNTPs1.6μL，模板2μL，G1上下游引物(10μM)0.8μL，G10上下游引物(10μM)0.4μL，Eva Green 1.5μL，Ex Taq聚合酶0.1μL，补ddH₂O至20μL。

扩增程序为：95℃预变性5min(基因组模板)/10min(菌液模板)，95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环，熔解曲线升温速度0.1℃/s，G1、G10扩增片段的Tm值分别为：79.1±0.5℃、83.6±0.5℃。

特异性较好，24株菌中，只有E.coli O157:H7出现2个熔解峰，非O157大肠杆菌及其他菌株在30循环均未出现扩增。灵敏度分析得到，基因组为模板时，检测灵敏度为411fg/μL；菌液为模板时，检测灵敏度为2.5×10³CFU/mL。

有益效果

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明筛到一批新型靶点，与常规检测靶点相比具有较好的特异性，降低了检测中假阳性的产生。

(2)本发明中采用Eva Green第三代饱和荧光染料，该染料具有较高的荧光信号值，提高了检测的灵敏度。同时，该染料即使在高浓度使用时，也为表现出PCR的抑制效果，大幅了检测时熔解曲线的分辨率，进而改善了本发明的检测准确性。

(3)检测方法便捷，方便观察，且无需繁琐的电泳操作，检测时间缩短在12h以内；检测过程不涉及抗体，检测成本低，可满足一般实验室的检测需求。

(4)本发明提供的检测方法可检测到411fg/uL的基因组，或220CFU/mL的活菌，具有较高的灵敏度。另外，普通双重HRM-RT-PCR只可简单的定性，而本发明建立的方法具有较好的线性R²值，可通过本发明进行定量分析。

附图说明

图1为BLAST离线安装包下载界面；

图2为利用本地BLAST软件执行建库命令；

图3为数据库格式化后的结果；

图4为本地比对命令的执行；

图5为本地比对后输出的结果，输出的结果使用notepad++、Excel进行处理；

图6为筛选得到的靶点与常用靶点间特异性比对差异，其中281～4509为筛选得到的靶点，rfbE为当前E.coli O157:H7检测常用的靶点；

图7为双重RT-PCR体系优化的结果，其中A、B为dNTP浓度优化结果；C、D为Ex Taq酶优化的结果；E、F为不同引物浓度优化的结果；G、H为不同引物比例优化的结果。

图8为不同核酸荧光染料的优化结果，其中A、B分别为不同种类、不同浓度染料对Ct值、ΔRn值的影响；C为不同种类、不同浓度的染料对熔解峰的影响。

图9为优化后的G1-G10双重HRM-RT-PCR的扩增结果，其中A、B分别为阳性对照的扩增曲线及熔解峰；C、D分别为阴性对照的扩增曲线及熔解峰。

图10为G1-G10双重HRM-RT-PCR体系灵敏度的检测结果，其中A、B分别为基因组、菌液灵敏度检测结果。

图11为G1-G10双重HRM-RT-PCR体系特异性检测及循环数优化结果，其中A为特异性检测结果，B为循环数优化结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开是商业渠道获得。

1.肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性靶点发掘

1.1本地BLAST安装及E.coli O157:H7基因组数据库构建

软件安装：进入NCBI官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，点击AllResources，下载.BLAST离线安装包(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)，根据电脑系统下载相应的安装包(*.exe)。

数据库构建：根据NCBI公布的83条完整的E.coli O157:H7基因组序列为基础，进行数据库的构建，构建方法如下：

a.查到的83条完整的基因组的参考序列编号，汇总后通过NCBI基因组批量处理工具https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/batchentrez下载所有基因组的fasta格式文件，作为建库的材料。

b.点击电脑的“开始”，输入“cmd”，回车键，调取DOS命令。切换工作目录到blast的bin下，DOS命令是：cd C:\Program Files\NCBI\blast-2.7.1+\bin(实际安装目录)，回车。

c.对物种序列进行建库处理，转换成blast软件可用的格式：

DOS命令：makeblastdb.exe-in Input_file.fasta-parse_seqids-hash_index-dbtype nucl；

Input_file：建库的序列文件名，如E.coli O157:H7；nucl/prot：建库的序列属性，核苷酸库/蛋白质库，在此处选择nucl；(其它详细参数可以通过DOS命令makeblastdb-help进行查看)

1.2本地比对初筛及在线比对复筛

本地比对初筛：通过cmd命令调取DOS命令：blastn-query input_file.fasta-dbtest.fasta-out output_file.txt-evalue 1e-200-outfmt 7，对E.coli O157:H7 Sakai(NC_002695.2)的5203条CDS序列进行本地比对：

Blastn：核苷酸与核苷酸库比对；Input_file：需比对的文件名，在此处选择E.coli O157:H7 Sakai的基因组进行特异靶点的发掘；-db test.fasta：为1.1中构建的数据库名称；output_file：输出比对结果的文件名；-evalue：比对参数E值，在此选择1e^-200；-outfmt7：输出格式为TXT文本文档。

在线比对复筛：使用notepad++软件处理本地比对初筛结果，选择与E.coli O157:H7同源性较好(E-value<1e-200，Query Cover≥98％)且在非E.coli O157:H7特异较高(E-value≥1e-20，Query Cover<10％)的CDS序列作为准特异靶点。随后将这些序列在NCBIBLSAT中进行比对，确保筛选的靶点具有较高的检出率及特异性。复筛得到的靶点结果及其特异性评估如表1、图7所示。

1.3引物设计及特异性评估

选取1.2中得到的特异性检测靶点CDS序列利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，将所得引物置于NCBI中Primer-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)系统中，选择nr(Ref Seq non-redundant proteins)数据库进行比对，比对结果给出目标引物的扩增产物、熔解温度、自身互补(Self complementarity)、引物二聚体(Primer Dimer)等信息，选择退火温度60℃左右、自身互补值小于6、3’端互补值小于3的引物送往金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。

根据实验室现有的38株菌株(表2、表3)，对合成的引物进行PCR，取5μL PCR产物到1％的琼脂糖凝胶中，用125V电压跑40min后，Ultra GelRed染色后观察结果，选取特异性较好的引物进行后续检测体系的构建。

2.双重HRM-RT-PCR体系构建

根据引物特异性、Tm值差异，选择G1、G10引物组合进行双重HRM-RT-PCR体系的构建。以说明书推荐体系为出发点，分别对体系的dNTP、Ex Taq聚合酶、引物浓度及比例、荧光染料的种类及浓度、退火温度、反应循环数进行筛选。说明书推荐体系为：10×Ex Buffer 2μL，2.5mM的dNTPs 1.6μL，模板＜500ng，上下游引物终浓度0.2～1.0μM，Ex Taq聚合酶0.1μL，补ddH₂O至20μL。

dNTP浓度优化：其他条件不变，将dNTP终浓度调整为：0.10mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM，检测不同浓度dNTP对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的浓度为最佳dNTP使用浓度；

Ex Taq聚合酶浓度优化：其他条件不变，将Ex Taq聚合酶终浓度调整为：0.0125U/μL、0.0250U/μL、0.0375U/μL、0.0500U/μL，检测不同浓度dNTP对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的浓度为最佳Ex Taq聚合酶使用浓度；

引物浓度优化：其他条件不变，将引物终浓度调整为：0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM，检测不同浓度dNTP对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的浓度为最佳引物使用浓度；

引物比例优化：引物浓度优化后，进行引物比例优化，将G1、G10引物比例调整为：1:1、2:1、3:1、4:1，根据引物浓度优化结果，固定G10引物终浓度为0.2μM。检测不同引物比例对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的为最佳引物比例；

荧光染料优化：为提高检测灵敏度及溶解曲线分析的分辨率，选取以下CYBERGreen、DNA Green、Eva Green、LC Green、LY Green、SYTO Green 9、SYBR Green I荧光染料，加入上述优化的双重RT-PCR体系中。分别将终浓度调整为0.5×、1.0×、1.5×、2.0×，检测不同荧光染料对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的为最佳染料使用条件；

退火温度优化：根据上述优化的体系，分别设置不同的退火温度(56℃、58℃、60℃、62℃、64℃)，检测不同退火温度对对扩增的Ct值、荧光信号值ΔRn的影响，选择Ct值小、荧光信号值高的为最佳退火温度；

扩增循环数优化：RT-PCR中，高的循环数会导致末期非特异性扩增产生概率升高。本发明分别设置30、35、40个循环，评估不同扩增循环数对检测的影响，确定最佳的扩增循环数。

由此得到的G1-G10双重HRM-RT-PCR的最佳体系为：10×Ex Buffer 2μL，2.5mM的dNTPs 1.6μL，模板2μL，G1上下游引物(10μM)0.8μL，G10上下游引物(10μM)0.4μL，EvaGreen 1.5μL，Ex Taq聚合酶0.1μL，补ddH₂O至20μL。扩增程序为：95℃预变性5min(基因组模板)/10min(菌液模板)，95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，熔解曲线升温速度0.1℃/s，G1、G10扩增片段的Tm值分别为：79.1±0.5℃、83.6±0.5℃。优化结果如下图7-9所示。

3.检测体系特异性、灵敏度评估

经过不同条件优化后，对双重HRM-RT-PCR的特异性、灵敏度进行评估，具体步骤如下：

3.1DNA模板的制备

将4株大肠杆菌O157:H7标准菌株、8株非O157大肠杆菌及12株非大肠杆菌(如表2)(编号为CICC的菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CMCC的菌株购自中国医学微生物菌种保藏中心，编号为ATCC的菌株购自美国菌种保藏中心)分别接种到30mL的LB液体培养基中，37℃培养8h。分别取1mL各菌菌悬液于1.5mL离心管中，12000r/min，离心2min，弃上清。用500μL灭菌的纯水洗涤菌体沉淀两次，再用100μL灭菌纯水重悬沉淀，沸水浴中煮沸10min，冰浴10min，12000r/min，离心2min，取上清液作为检测模板，并取1μL置于Nanodrop-2000核酸浓度测定仪中检测模板浓度(411ng/μL，OD260/280＝2.04)。

3.2特异性检测

以3.1中得到的不同菌株的基因组为模板，根据2中优化的双重HRM-RT-PCR体系进行检测。观测不同菌株对应的Ct值及Tm值的差异。

检测结果的特异性较好，24株菌中，只有E.coli O157:H7出现2个熔解峰(79.1±0.5℃、83.6±0.5℃)，非O157大肠杆菌及其他菌株在30循环均未出现扩增。

3.3灵敏度检测

本发明对主要对基因组模板、新鲜菌液模板进行检测，以确定其检出限。

基因组模板：以E.coli O157:H7(ATCC43889)标准菌株的基因组为模板，进行10倍梯度稀释，梯度为10^-1～10^-8，不同梯度各取2μL进行检测，确定最低检出限。

经检测，基因组为模板时，检测灵敏度为41.1fg/μL。

菌液模板：以E.coli O157:H7(ATCC43889)标准菌株的培养液为模板，进行10倍梯度稀释，梯度为10^-1～10^-8，不同梯度各取2μL进行检测，确定最低检出限。

以菌液为模板的组别分别进行了平板计数，涂布结果显示，37℃180rpm过夜培养的E.coli O157:H7(ATCC43889)菌液浓度为2.5×10⁸CFU/mL。经检测，菌液为模板时，检测灵敏度为250CFU/mL。

附表：

表1大肠杆菌O157:H7靶点筛选结果

表2靶点特异性验证菌株

注：无备注的为非O157:H7血清型

表3自筛与文献中靶点对比

注：菌株S28～S38为大肠杆菌O157：H7；红色标记的“+”为错误扩增（非特异扩增且大小不匹配

表4引物序列及相关信息

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种检测大肠杆菌O157:H7的特异性靶点、引物、检测方法及应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 156

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

cgcgaggact ttgactcctt aacagtagct gatttgtatg atatagaaat agcgatgcaa 60

gactttttga agatataaat tttgaaaatt ctaaagataa caaagtgcga tttgacgaag 120

atacatatga ctttaatatc atgggaaacg ccgagg 156

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

agtgacaaca gcccccatac ctataatggc tcccgcgcca ataataagtg ggcgattagg 60

aacaccctgc t 71

<210> 3

<211> 119

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

ttgctcctgg ggctaaatgt aatggatatg ttgttattga agacatgcat atataggctc 60

gggtgcagta attaagcagg gtgttcctaa tcgcccactt attattggcg cggagccat 119

<210> 4

<211> 431

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

ttacccgacg cctcaacaac gtgatgatgt tgagttggtt ttacgtactc gggatgaatt 60

gaacttgttg gatagtagcg ctgtttggat tttttttctt cacagaaaat cgaccaggtt 120

tatttggcag cagcaaaagt cggaggtatt ttgctaacag ttcttatcct gccgatttta 180

tatatgagaa tataatgata gaggcgaatg tcattcatgc tcccacaaaa ataatgtaaa 240

taaactgctt ttcctcggtt cgtcgtgtat ttatcctaag ttagcacacc accgattatg 300

gaagacgaat tattacaagg gaaacttgag ccaacaaatg aaccttatgc tatcgcaaaa 360

ttgcaggtat taaattatgt gaatcttata accgtcagtt tgggcgtgat taccgttcag 420

taatgccacc a 431

<210> 5

<211> 184

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

ggaccgcaga ggaaagagag gaattaagga atcaccttgc agataaactc tcgaaacaag 60

gccagttttt taccctgtcc acacgatgcc aatgtactcg gaaaaatatc aaaagcacct 120

atagctgagg atcttggttg gcgtggaatt aatttaccta gtttccccag cctatcgaat 180

gagc 184

<210> 6

<211> 430

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 6

aacgattgca ccaaccttgc agtataatca tgaccaaaag cacctgtttt tttcatccaa 60

tgcaattgat atgcatgcct tattggatga ataaatgagt ctgctttaaa atgcttagca 120

atgacgctgt aataaataga tttatatgcc aaccaattta gcgatgcgat aaacatttca 180

agtgaacgag tcatacctcc tttaccgcga gtagattttt ccctttctag ttcaaattca 240

cgctcagtat attcatgtcc agatgaactc actagcttca catcggttga ccagtaccct 300

ttcgtatcag aagcatctga taattcatta aaaatcgatg cacttagttc actatatttc 360

gcatattcag gagtaccggg ctgaccaagc attttcattg ttaagtaata cacgctagac 420

cgaagatccc 430

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcgaggact ttgactcctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctcggcgtt tcccatgata 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcagggtgt tcctaatcgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtgacaaca gcccccatac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgctcctgg ggctaaatgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggctccgc gccaataata 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttacccgacg cctcaacaac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tggtggcatt actgaacggt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaccgcaga ggaaagagag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctcattcga taggctgggg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gggatcttcg gtctagcgtg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aacgattgca ccaaccttgc 20

Claims

1.如下1）-5）任一种物质作为特异性靶点在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7中的应用：

1）NC_002695.2_cds_283；2）NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3）NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4）NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5）NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712碱基序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如下1）-5）任一种物质作为特异性靶点在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：

1）NC_002695.2_cds_283；2）NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3）NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4）NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5）NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

3.检测如下1）-5）任一种物质的制品在制备肠出血性大肠杆菌O157:H7检测试剂中的应用：

1）NC_002695.2_cds_283；2）NC_002695.2_cds_NP_310858.1_2712；

3）NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716；4）NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719；

5）NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109；其中，

所述NC_002695.2_cds_283碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310865.1_2716碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_310868.2_2719碱基序列如SEQ ID NO.5所示；

所述NC_002695.2_cds_NP_311265.1_3109碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的双重HRM-RT-PCR引物，其特征在于，所述引物分别为：G1、G10；其中，

G1-F：5 - CGCGAGGACTTTGACTCCTT - 3’ ，如SEQ ID NO.7所示；

G1-R：5’- CCTCGGCGTTTCCCATGATA - 3’，如SEQ ID NO.8所示；

G10-F：5 - TTACCCGACGCCTCAACAAC - 3’，如SEQ ID NO.13所示；

G10-R：5’- TGGTGGCATTACTGAACGGT - 3’，如SEQ ID NO.14所示。

5.权利要求4所述的PCR引物在检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒中的应用。

6.一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括G1、G10，其中：

G1-F：5’- CGCGAGGACTTTGACTCCTT - 3’ ，如SEQ ID NO.7所示；

G1-R：5’- CCTCGGCGTTTCCCATGATA - 3’，如SEQ ID NO.8所示；

G10-F：5’- TTACCCGACGCCTCAACAAC - 3’，如SEQ ID NO.13所示；

G10-R：5’- TGGTGGCATTACTGAACGGT - 3’，如SEQ ID NO.14所示。

7.一种非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性靶点发掘；（2）双重HRM-RT-PCR体系构建；（3）检测特异性、灵敏度评估。

8.根据权利要求7所述的非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，G1-G10双重HRM-RT-PCR检测体系，20 μL包含有：10×Ex Buffer

2 μL，2.5 mM 的dNTPs 1.6 μL，模板2 μL，G1上下游引物（10 μM）0.8 μL，G10上下游引物（10 μM）0.4 μL，Eva Green 1.5 μL，Ex Taq聚合酶 0.1 μL，补ddH₂O至20 μL。

9.根据权利要求7所述的非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，PCR的反应程序：扩增程序为：95℃预变性5 min/10 min，95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环，熔解曲线升温速度0.1℃/s，G1、G10扩增片段的Tm值分别为：79.1±0.5℃、83.6±0.5℃。

10.根据权利要求7-9任一所述的非疾病诊断目的的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于：G1-G10双重HRM-RT-PCR反应后，其Ct值、熔解峰可直观显示，若Ct值≤35且熔解峰位置分别在79.1±0.5℃、83.6±0.5℃则为阳性；反之，则为阴性。