CN111575391A - 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 - Google Patents
液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111575391A CN111575391A CN202010397457.6A CN202010397457A CN111575391A CN 111575391 A CN111575391 A CN 111575391A CN 202010397457 A CN202010397457 A CN 202010397457A CN 111575391 A CN111575391 A CN 111575391A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- hybridization
- centrifuging
- escherichia coli
- pna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 title claims abstract description 24
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000003287 bathing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 18
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 abstract description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 abstract description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 241000989055 Cronobacter Species 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588917 Citrobacter koseri Species 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000321184 Raoultella Species 0.000 description 1
- 241000499366 Salinivibrio Species 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000006357 methylene carbonyl group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法、试剂盒和探针，基于核糖体rRNA的多拷贝，及受环境稳影响较小的特性，运用NCBI数据库信息和DNASTAR软件的序列比较分析的功能，结合PNA探针设计的原则，设计了具有大肠杆菌O157特异性的肽核酸探针，并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术结合用于检测。同时建立了液相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA‑FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过3个小时；PNA‑FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA‑FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定大肠杆菌O157:H7的探针设计及应用PNA-FISH法鉴定大肠杆菌O157:H7的方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌常见的血清型,是以食物为主要的传播途径的致病菌，在世界范围内普遍存在，广泛分布于水、土壤和食物中，肉类、蔬菜、水果等均可成为传染源。大肠杆菌O157：H7可产生志贺氏毒素样细胞毒素，引起严重并发症，甚至导致死亡，死亡率可达5％～10％。近年，肠出血性大肠杆菌O157:H7感染在世界各地都有不同规模的爆发和流行，在世界范围内都受到普遍关注。此外，E.coli O157:H7的感染剂量极低，在食入不足10个细菌就可能引起疾病。目前还没有一种特效药或有效的治疗手段，因此建立快速、有效的检测方法对E.coli O157:H7的预防工作显得尤为重要。
肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH)，与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。
发明内容
本发明的目的在于通过设计具大肠杆菌O157:H7特异性的PNA探针，并结合FISH检测技术，实现对大肠杆菌O157:H7的快速准确检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种用于大肠杆菌O157:H7肽核酸原位荧光杂交鉴定的PNA探针，该探针具有如下核苷酸序列：5’-GAGCCTCTTTTATGG-3’。
基于核糖体rRNA的多拷贝，及受环境稳影响较小的特性，运用NCBI数据库信息和DNASTAR软件的序列比较分析的功能，结合PNA探针设计的原则，设计了具有大肠杆菌O157特异性的肽核酸探针，并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)技术结合用于检测。同时建立了液相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过3个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
在一些实施例中，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为Cy3。
本发明还提供一种用于鉴定大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含上述所述的探针。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括杂交液，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。
本发明另提供一种液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)细菌的培养及固定：离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度，细菌离心，弃PBS，用酒精/PBS固定缓冲液重悬，离心去上清；
步骤2)液相杂交及荧光观察：向步骤1)加入包含有权利要求1所述的探针的杂交液，重悬；样品置于PCR管中，水浴，加入洗涤缓冲液振荡孵育，离心弃上清，第二次洗涤后孵育；洗涤缓冲液悬至一定体积，取涂片显微镜观察。
本发明提供的液相PNA荧光原位杂交方法，在菌株液相状态时，对其进行固定(固定后可存放于-20℃，可保存6个月)，相比较固相杂交方法而言，液相方法更加灵活，之后，仍在液相状态时，将固定菌液和杂交缓冲液混合进行液相杂交，杂交结束进行两次洗涤，最后涂片观察实验结果；此外，液相杂交缓冲液的成份也较少，相较于固相交缓冲液，配制更加简便。
在一些实施方式中，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。
在一些实施方式中，洗涤缓冲液的pH9.0，且其包含如下组份：10mM Tris，1mMEDTA。
在一些实施方式中，PBS包含如下组份：7mM Na2HPO4、7mM NaH2PO4、130mM NaCl。
在一些实施方式中，该方法具体包括如下步骤：
步骤1)细菌的培养及固定：
将大肠杆菌O157:H7于BHI中37℃培养至对数生长期(约9小时)，收集细菌离心8000g×5min，弃培养液，并用PBS洗涤一次。细菌离心8000g/5min，弃PBS，用50％酒精/PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在107～108个/ml，室温固定1小时后置于-20℃可保存6个月；
步骤1)液相杂交及荧光观察：
取100μl固定好的菌体8000g离心5min，弃上清；加入50μl含300pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液(室温)重悬；样品于薄壁PCR管中，55℃水浴1.5小时；8000g离心5min，弃杂交缓冲液；加入100μl洗涤缓冲液(预热至55℃)，55℃水浴10min；8000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次20min；取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取10μl菌液涂片观察荧光。
在一些实施例中，选取25株具有代表性的革兰氏阴性细菌和阳性细菌菌株，分别为3株大肠杆菌O157:H7、5株大肠埃希氏菌(非O157)、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、鸭沙门沙门氏菌、克罗诺杆菌属、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、肺炎克雷伯氏菌、宋氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、粪肠球菌各1株。试验方法如上实施例2所述的所述操作流程。结果显示只有阳性对照探针BacUni与所有细菌都能结合，而探针O157-23S-1不能与这些非目标菌株结合(表2)；O157-23S-1有很好的特异性。
核糖体RNA及相关基因广泛地适用于生物进化和生物分子标记等领域，其具有如下优点：(1)在生物细胞中大量存在，对蛋白质合成是必需的，其生物合成正比于细胞生长速度；(2)这些基因容易分离和鉴定；(3)在初级结构和次级结构中同时具有高度保守区和可变区域；(4)目前已建立了大量rRNA的基因序列数据库，这对基因序列的比较分析十分有用；(5)与已发现的其他基因比较，不会表现出水平基因的转移。综上，本发明针对病原微生物的分子化石——rRNA的序列来设计PNA探针，利用该PNA探针结合FISH的方法来鉴定微生物。
由于PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。
本发明用优化后的液相PNA荧光原位杂交方法用通用探针BacUni和本发明提供的探针对大肠杆菌O157:H7菌株进行杂交实验，结果如图1(大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)杂交图片)所示，可以看到本发明提供的探针O157-23S-1显现出更为优越强烈的杂交荧光信号。
进一步地，本发明相较于通用的探针显现出更为优越的特异性；
附图说明
图1为大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)杂交图片，BacUni(A)；E.coli O157-23S-1(B)。
具体实施方式
实施例1 PNA探针的设计方法
PNA探针的设计方法包括如下步骤：
步骤1)选择来自大肠杆菌O157:H7及其它亲缘关系较近的和常见食源性致病菌的23S rRNA序列，利用生物信息学方法筛选特异性靶点；
步骤2)用MegAlign软件(version 5.0；DNASTAR,Madison,WI)的ClustalV算法进行排序；在排序后的在变异区域设计了大肠杆菌O157:H7特异性探针O157-23S-1；探针序列见表1。
表1 PNA探针序列
其中，所述的aBacUni为阳性对照探针；该探针引用自Perry-O'Keefe,H.,Stender,H.,Broomer,A.,Oliveira,K.,Coull,J.,Hyldig-Nielsen,J.J.,2001.Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection,identification andenumeration of specific micro-organisms.J Appl Microbiol90(2):180-189；探针合成和标记由韩国Panagene完成。
步骤3)验证探针的灵敏度和特异性，用ARB SILVA数据库进行验证，具体包括小亚基(如16S/18S，SSU)和大亚基(23S/28S，LSU)的rRNA序列数据库。
经比对发现，大亚基rRNA序列数据库中，探针O157-23S-1与大肠杆菌O157:H7有较高的特异性，但也有一些的非目标细菌与探针O157-23S-1有重合区域，如Citrobacterkoseri,Buttiauxella sp.,Obesumbacterium proteus,Raoultella sp.,Salinivibriosp.,，但以上非目标细菌片段在数据库中数量极低，且并非常见食品中的致病菌，因此一般不会导致假阳性结果。
此外，探针O157-23S-1小亚基(如16S/18S，SSU)数据库中，没有匹配片段，排除了与细菌16S rRNA片段杂交的可能。
综上，从理论角度分析，O157-23S-1探针有较好的灵敏度和特异性，可用于大肠杆菌O157:H7PNA检测分析方法的建立，与阳性对照探针BacUni一起被用于后续检测。
实施例2液相PNA荧光原位杂交
本实施例用到的PBS、杂交液以及洗涤缓冲液配制方法：
PBS：7mM Na2HPO4 7mM NaH2PO4 130mM NaCl
杂交液：pH9.0，20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针
洗涤缓冲液：pH9.0，10mM Tris，1mM EDTA
本实施例实施的液相PNA荧光原位杂交方法标准流程如下：
步骤1)离心(8000g，5min)收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至107～108CFU/ml，细菌离心8000g/5min，弃PBS，用50％酒精/PBS固定缓冲液重悬，取100μl固定好的细菌2000g离心5min，去上清；
步骤2)加50μl杂交液(pH9.0，20mMTris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针)重悬；
步骤3)样品置于薄壁PCR管中，55℃水浴作用1.5小时；加入100μl 55℃预热的洗涤缓冲液(pH9.0，10mM Tris，1mM EDTA)振荡孵育10分钟，离心弃上清，第二次洗涤后孵育20分钟；洗涤缓冲液悬至25～30μl，取10μl涂片显微镜观察。
用优化后的液相PNA荧光原位杂交方法用通用探针BacUni和大肠杆菌O157:H7探针O157-23S-1对大肠杆菌O157:H7菌株进行杂交实验，结果见图1。
结果如图1(大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)杂交图片)所示，可以看到,与通用探针相似，探针O157-23S-1与大肠杆菌O157:H7菌株有很好杂交荧光信号。
由于PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。
实施例3 PNA-FISH特异性验证
选取25株具有代表性的革兰氏阴性细菌和阳性细菌菌株，分别为3株大肠杆菌O157:H7、5株大肠埃希氏菌(非O157)、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、鸭沙门沙门氏菌、克罗诺杆菌属、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、肺炎克雷伯氏菌、宋氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、粪肠球菌各1株。
试验方法如上实施例2所述的所述操作流程。
结果显示只有阳性对照探针BacUni与所有细菌都能结合，而探针O157-23S-1不能与这些非目标菌株结合(表2)；O157-23S-1有很好的特异性。
表2.PNA探针检测不同目标菌的特异性验证
Table 2.Specificity of probes to different target bacterial species
序列表
<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院
<120> 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157: H7的鉴定方法、试剂盒和探针
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcctcttt tatgg 15
Claims (9)
1.一种用于大肠杆菌O157:H7肽核酸原位荧光杂交鉴定的PNA探针，其中，该探针具有如下核苷酸序列：5’-GAGCCTCTTTTATGG-3’。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为Cy3。
3.用于鉴定大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的探针。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交液，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。
5.液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法，特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1)细菌的培养及固定：离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度，细菌离心，弃PBS，用酒精/PBS固定缓冲液重悬，离心去上清；
步骤2)液相杂交及荧光观察：向步骤1)加入包含有权利要求2所述的探针的杂交液，重悬；样品置于PCR管中，水浴，加入洗涤缓冲液振荡孵育，离心弃上清，第二次洗涤后孵育；洗涤缓冲液悬至一定体积，取涂片显微镜观察。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，洗涤缓冲液的pH9.0，且其包含如下组份：10mM Tris，1mM EDTA。
8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，PBS包含如下组份：7mM Na2HPO4、7mMNaH2PO4、130mM NaCl。
9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
步骤1)细菌的培养及固定：
将大肠杆菌O157:H7于BHI中37℃培养至对数生长期(约9小时)，收集细菌离心8000g×5min，弃培养液，并用PBS洗涤一次。细菌离心8000g/5min，弃PBS，用50％酒精/PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在107～108个/ml，室温固定1小时后置于-20℃可保存6个月；
步骤2)液相杂交及荧光观察：
取100μl固定好的菌体8000g离心5min，弃上清；加入50μl含300pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液(室温)重悬；样品于薄壁PCR管中，55℃水浴1.5小时；8000g离心5min，弃杂交缓冲液；加入100μl洗涤缓冲液(预热至55℃)，55℃水浴10min；8000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次20min；取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取10μl菌液涂片观察荧光。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010397457.6A CN111575391A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010397457.6A CN111575391A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111575391A true CN111575391A (zh) | 2020-08-25 |
Family
ID=72123022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010397457.6A Pending CN111575391A (zh) | 2020-05-12 | 2020-05-12 | 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111575391A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112301139A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-02-02 | 南京农业大学 | 一种检测大肠杆菌o157:h7的特异性靶点、引物、检测方法及应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747257A (en) * | 1996-02-29 | 1998-05-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7 |
| JPH10165182A (ja) * | 1996-12-09 | 1998-06-23 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子に含まれるプローブ用核酸断片、それらを用いる腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出法及び検出用キット |
| CN1683565A (zh) * | 2005-03-15 | 2005-10-19 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途 |
| CN102586465A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-18 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法及pna探针 |
| CN102586466A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-18 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 肽核酸原位荧光杂交技术检测沙门氏菌的方法及pna探针 |
| EP2993237A2 (en) * | 2013-04-30 | 2016-03-09 | Universidade do Minho | Peptide nucleic acid (pna) probe, kit and method for detecting and/or quantifying escherichia coli 0157 : h7 |
| CN106480197A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-08 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及试剂盒和pna探针 |
-
2020
- 2020-05-12 CN CN202010397457.6A patent/CN111575391A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747257A (en) * | 1996-02-29 | 1998-05-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7 |
| JPH10165182A (ja) * | 1996-12-09 | 1998-06-23 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子に含まれるプローブ用核酸断片、それらを用いる腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出法及び検出用キット |
| CN1683565A (zh) * | 2005-03-15 | 2005-10-19 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途 |
| CN102586465A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-18 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 肽核酸原位荧光杂交技术检测弧菌的方法及pna探针 |
| CN102586466A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-18 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 肽核酸原位荧光杂交技术检测沙门氏菌的方法及pna探针 |
| EP2993237A2 (en) * | 2013-04-30 | 2016-03-09 | Universidade do Minho | Peptide nucleic acid (pna) probe, kit and method for detecting and/or quantifying escherichia coli 0157 : h7 |
| CN106480197A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-08 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及试剂盒和pna探针 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112301139A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-02-02 | 南京农业大学 | 一种检测大肠杆菌o157:h7的特异性靶点、引物、检测方法及应用 |
| CN112301139B (zh) * | 2020-11-17 | 2023-08-08 | 南京农业大学 | 一种检测大肠杆菌o157:h7的特异性靶点、引物、检测方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6753421B2 (en) | Probes for the detection of mycobacteria | |
| JP3093736B2 (ja) | リステリア菌の検出 | |
| CA2596059C (en) | Method of quantitatively analysing microorganism targeting rrna | |
| JPH11137259A (ja) | 細菌同定のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法 | |
| JPH03504677A (ja) | リステリア検出のためのプローブ類及び方法 | |
| WO1995007289A1 (en) | Nucleic acid probes for lactobacillus detection | |
| O'Brien et al. | Detection of Aeromonas salmonicida, causal agent of furunculosis in salmonid fish, from the tank effluent of hatchery-reared Atlantic salmon smolts | |
| US8574839B2 (en) | Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment | |
| CN107365869B (zh) | 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物 | |
| CN111575391A (zh) | 液相原位荧光杂交检测大肠杆菌o157:h7的鉴定方法、试剂盒和探针 | |
| US20040248148A1 (en) | Ultrasensitive detection of pathogenic microbes | |
| CN109097365B (zh) | 用于创伤弧菌识别的核酸适配体及筛选方法与应用 | |
| Tang et al. | Application of rRNA probes and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of the toxic dinoflagellate Alexandrium minutum | |
| AU2016247158B2 (en) | Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogen nucleic acid | |
| Deshmukh et al. | A novel molecular quantitative method for rapid and sensitive detection of Escherichia coli from roof-harvested rainwater | |
| CA2285633C (en) | Bacterial plasmids | |
| Mauti et al. | Molecular identification of soil bacteria by 16srDNA sequence | |
| KR100984785B1 (ko) | 살모넬라 티피무리움 검출용 프라이머 세트 및 프로브 | |
| JP2007189980A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| CN106480197B (zh) | 金黄色葡萄球菌的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及试剂盒和pna探针 | |
| Baharuddin et al. | Sociodemographic the Characteristics of" Slum and Urban Area" Customer Behavior Depot and Identification of Escherchia Coli with RT-PCR by Gen EF-Tu. | |
| Niederhauser et al. | Direct detection of Listeria monocytogenes using paramagnetic bead DNA extraction and enzymatic DNA amplification | |
| Šilhová et al. | Fish detection of Campylobacter and Arcobacter adhered to stainless steel coupons. | |
| JP5134071B2 (ja) | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 | |
| CN108950033B (zh) | 同时检测肠出血性大肠杆菌o45和o145的纳米pcr试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200825 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |