CN112080538B

CN112080538B - 一种基于酶催化制备淫羊藿次苷ⅱ的方法

Info

Publication number: CN112080538B
Application number: CN202010996521.2A
Authority: CN
Inventors: 吴志革; 金志华; 金庆超; 杨郁; 李龙飞; 戚旺涛; 徐宝萍; 方瑶瑶
Original assignee: Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Current assignee: Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-09-21
Also published as: CN112080538A

Abstract

本发明公开了一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：(1)构建表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖水解酶的重组工程菌，诱导表达获得纤维二糖水解酶；(2)以纤维二糖水解酶为催化剂，以淫羊藿苷为底物进行转化反应，反应结束后将反应液分离纯化，制得淫羊藿次苷Ⅱ。本发明提供的生物法制备淫羊藿次苷Ⅱ，具有成本低、操作步骤简单、反应条件温和等特点，转化率达到98％以上，为淫羊藿次苷Ⅱ的大规模工业生产奠定了基础。

Description

一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于酶催化的淫羊藿次苷Ⅱ的制备方法。

背景技术

淫羊藿为小檗科淫羊藿属草本植物，其作为药用植物已有2000多年的历史，其主要有效成分为黄酮类化合物淫羊藿苷。刘铁汉等人发现淫羊藿苷可被肠内菌代谢，主要代谢产物为淫羊藿的苷元，大鼠灌服淫羊藿苷后，吸收入血的主要代谢物为淫羊藿次苷Ⅱ(刘铁汉，王毅，王本祥等，淫羊藿苷的肠菌代谢研究I.肠内细菌对淫羊藿苷的代谢转化.中草药，2000,31(11)：834)，因此淫羊藿次苷Ⅱ可能是淫羊藿苷发挥生理活性的主要代谢产物。

近年来对于淫羊藿次苷Ⅱ的药理研究集中在心血管、肿瘤、中枢神经系统、免疫系统、生殖系统、骨组织等领域。在抗肿瘤方面，淫羊藿次苷Ⅱ对人鼻咽癌KB细胞、人慢性髓系白血病细胞K562、人早幼粒白血病细胞HL-60细胞均有显著的抑制作用。淫羊藿次苷Ⅱ能够通过增加线粒体和溶酶体膜的通透性诱导HepG2细胞的凋亡。此外，淫羊藿次苷Ⅱ能够使人黑色素瘤细胞A375阻滞在G0/G1期和G2/M期，并抑制cyclin E等周期相关蛋白表达。在中枢神经系统方面，淫羊藿次苷Ⅱ可以减轻APP/PS1转基因小鼠的空间学习和记忆障碍。这种保护作用似乎是由于ADAM10表达增加和APP、BACE1的表达减少，从而抑制了海马体和皮层的Aβ生成。这提示淫羊藿次苷Ⅱ可能是一种潜在的AD治疗药物。淫羊藿次苷Ⅱ对骨组织的作用则是国内研究的一个热点，淫羊藿次苷Ⅱ能够通过上调成骨细胞相关因子表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化发挥抗骨质疏松的作用。目前研究显示淫羊藿次苷Ⅱ是PDE5的特异性抑制剂，可显著提高阴茎海绵体内cGMP浓度，从而调节阴茎勃起，而且不影响大鼠阴茎海绵体平均动脉血压，有望成为抗ED的新型药物。因此，淫羊藿次苷Ⅱ在药品和保健品领域都有着广泛地应用，市场前景十分广阔。

尽管淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ在结构上只有一个糖基的差别，其结构式如图1所示，但许多证据表明，淫羊藿次苷Ⅱ比淫羊藿苷具有更显著的生理活性，如在抗ED领域。但是，天然的淫羊藿次苷Ⅱ在淫羊藿中含量极少，因此采用天然产物提取的方法直接从淫羊藿中提取淫羊藿次苷Ⅱ不具备可行性，经济效益较差。目前，已有研究机构展开化学法合成淫羊藿次苷Ⅱ的研究，但离产业化尚有距离。如何低成本、高效、环保地制备淫羊藿次苷Ⅱ成为当前的重要任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、反应条件温和、高效地制备淫羊藿次苷的方法，为淫羊藿次苷Ⅱ的大规模工业生产提供可行方案。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于酶催化的淫羊藿次苷Ⅱ的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖水解酶的重组工程菌，诱导表达获得纤维二糖水解酶；

(2)以纤维二糖水解酶为催化剂，以淫羊藿苷为底物进行转化反应，反应结束后将反应液分离纯化，制得淫羊藿次苷Ⅱ。

本发明利用纤维二糖水解酶(cbhB)对淫羊藿苷进行酶解，生物法制备淫羊藿次苷Ⅱ。所述纤维二糖水解酶基因源自斐济曲霉(Aspergillus fijiensis)，研究表明，该酶具有优异的催化活性，具体地，所述纤维二糖水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述重组工程菌的宿主细胞为大肠杆菌细胞。本发明采用大肠杆菌系统以表达外源性纤维二糖水解酶，具体地：将活化后的重组工程菌接种于含有抗生素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀值为0.6～1，加入1～3g/L的乳糖或0.1～0.4mmol/L的IPTG，诱导结束后离心收集菌体，制备粗酶液，利用粗酶液进行转化反应。

转化反应体系中，以0.2M磷酸钠缓冲液或0.2M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为反应介质，以控制反应体系pH值＝6～7。pH影响纤维二糖水解酶的活性，利用缓冲液调节反应体系pH值，有助于水解反应的进行。优选的，pH值＝7。

进一步地，酶的添加量以湿菌体计为3～10mg/mL，底物初始浓度为30～100μg/ml。优选的，酶的添加量以湿菌体计为4mg/mL，底物初始浓度为50μg/ml。

进一步地，采用甲醇或二甲基亚砜溶解淫羊藿苷后，再加入到反应体系中，反应体系中甲醇或二甲基亚砜的体积百分比浓度为1％～10％。DMSO等助溶剂可显著改善底物的溶解状况，进而提升淫羊藿苷的转化率。优选的，反应体系中二甲基亚砜的体积百分比浓度为3％。

转化反应的温度为30～50℃，作为优选，温度为40～50℃，更为优选，采用40℃。

进一步地，所述分离纯化包括：反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，最后旋蒸去除乙酸乙酯，得到淫羊藿次苷Ⅱ。

本发明具备的有益效果：

本发明提供的基于酶催化的生物法制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，具有成本低、操作步骤简单、反应条件温和等特点，转化率达到98％以上，为淫羊藿次苷Ⅱ的大规模工业生产奠定了基础。

附图说明

图1为淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ的结构及反应示意图。

图2为淫羊藿次苷Ⅱ标准品液相图。

图3为纤维二糖水解酶生物催化反应后的液相图。

图4为催化产物的液质鉴定图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1

一、纤维二糖水解酶(cbhB)基因的获取

纤维二糖酶基因在斐济曲霉、黑曲霉、草酸青霉、嗜热毛壳菌等微生物中广泛存在。

本实施例所采用的斐济曲霉(Aspergillus fijiensis)纤维二糖水解酶(cbhB)的基因序列如SEQ ID No.2所示，由人工合成来的。利用该人工合成基因的目的是为了在大肠杆菌系统中获得纤维二糖水解酶。

二、重组工程菌的制备

取-80℃保存的感受态细胞BL21，静置放于冰中至完全融化，加入0.1μL的含斐济曲霉纤维二糖水解酶基因(cbhB)的质粒，静置于冰上30min，42℃水浴中热击90s，冰浴3min，加入700-900μL无抗LB培养基，并于37℃，250rpm摇床中培养活化45min。于超净台中，取100μL活化后的菌液，涂布于含有卡那霉素的固体LB平板中，倒置于37℃微生物培养箱中培养12h。平板上得到单克隆菌落，于超净台中用接种环挑取单菌落，接种到含有5mL卡那霉素LB培养基的灭菌试管中，置于37℃，250rpm摇床中，培养12h，取少量菌液进行测序验证。

三、纤维二糖水解酶(cbhB)的诱导表达

将表达SEQ ID No.2序列所示的外切纤维二糖酶工程菌株接种于2m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有100ml LB培养液(含有50μg/ml卡那霉素)摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD₆₀₀值为0.6～1左右，添加诱导剂(0.2mmol/L的IPTG)，20℃诱导过夜。

四、纤维二糖水解酶粗酶液的制备

诱导结束后，6000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用冰预冷的0.2M磷酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠洗涤并重悬菌体，高压破胞，10000rpm离心10min，取上清，即为粗酶液。

五、淫羊藿次苷Ⅱ的液相检测

淫羊藿次苷Ⅱ的液相检测条件参数为：色谱柱：Wondasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为A液为乙腈，B液为水，流速1.0mL/min；柱温：30℃，进样20μL，紫外检测波长为270nm，洗脱程序为：0-10min，30％乙腈；10-25min，50％乙腈；25-30min，30％乙腈。淫羊藿次苷Ⅱ标准品的液相色谱如图2所示。

六、淫羊藿次苷Ⅱ的生物转化

在10ml反应体系中加入4ml粗酶液，50μg/ml的淫羊藿苷(淫羊藿苷事先用DMSO溶解)，补充DMSO终浓度至3％，缓冲液为0.2M的磷酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，40℃，500rpm条件下反应。在反应进程的不同时间点取样，样品用乙酸乙酯萃取，在60℃干燥后，即得到淫羊藿次苷Ⅱ的粗产物，用甲醇溶解。液相检测，结果显示，随着反应的进行，淫羊藿苷逐渐被转化为淫羊藿次苷Ⅱ(图3)。经液质联用鉴定，进一步确认转化产物为淫羊藿次苷Ⅱ(图4)。

实施例2

温度对淫羊藿苷转化率的影响

温度显著影响酶的催化活性。将含有底物、粗酶液和缓冲液(pH＝6)的反应体系分别在30℃、40℃、50℃、60℃进行催化反应，其他条件同实施例1。在50℃时，酶的催化活性高于40℃，但在40℃时酶的稳定性更好。在不同的温度条件下，淫羊藿苷的转化率有显著的不同，30℃、40℃、50℃、60℃时，转化率分别为73.6％、92.7％、90.2％、8.5％。

实施例3

pH对淫羊藿苷转化率的影响

pH会显著影响纤维二糖水解酶(cbhB)的活性。本实施例采用0.2M磷酸钠缓冲液(pH＝6,7,8)或0.2M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5)控制反应的pH。在40℃、不同的pH条件下，淫羊藿苷的转化率有显著的不同，在pH为5、6、7时，转化率分别为19.6％、92.4％、98.9％。

实施例4

淫羊藿次苷Ⅱ的制备和纯化

在100ml体系中加入50μg/ml的淫羊藿苷，40ml粗酶液，在3％DMSO、40℃、pH7.0条件下进行催化反应。反应结束后，以等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，40℃条件下旋蒸去除乙酸乙酯，然后用甲醇溶解得到的亮黄色固体淫羊藿次苷Ⅱ。对经纤维二糖水解酶催化反应后的样品液相检测结果显示，淫羊藿苷被转化为淫羊藿次苷Ⅱ，转化率达到98.7％。

序列表

<110> 浙大宁波理工学院

<120> 一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 547

<212> PRT

<213> 斐济曲霉(Aspergillus fijiensis)

<400> 1

Met Val Asp Ser Phe Ser Ile Tyr Lys Thr Ala Leu Leu Leu Ser Met

1 5 10 15

Leu Ala Thr Ser Asn Ala Gln Gln Val Gly Thr Tyr Thr Thr Glu Thr

20 25 30

His Pro Ser Leu Thr Trp Gln Thr Cys Ser Gly Ser Gly Ser Cys Thr

35 40 45

Thr Thr Ser Gly Ser Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His

50 55 60

Glu Val Gly Gly Tyr Thr Asn Cys Tyr Ser Gly Asn Thr Trp Asp Ser

65 70 75 80

Ser Ile Cys Ser Thr Asp Thr Thr Cys Ala Ser Glu Cys Ala Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Thr Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser

100 105 110

Leu Arg Leu Asn Phe Val Thr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Ile Gly Ser

115 120 125

Arg Leu Tyr Leu Leu Ala Asp Asp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Leu

130 135 140

Leu Asn Arg Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys

145 150 155 160

Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly

165 170 175

Val Ser Arg Phe Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly

180 185 190

Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asp Gly Gln

195 200 205

Ala Asn Ile Glu Gly Trp Glu Pro Ser Ser Thr Asp Val Asn Ala Gly

210 215 220

Ser Gly Asn His Gly Ser Cys Cys Pro Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala

225 230 235 240

Asn Ser Val Ser Ser Ala Phe Thr Ala His Pro Cys Asp Ser Val Gln

245 250 255

Gln Thr Met Cys Thr Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Thr

260 265 270

Ala Asp Arg Tyr Ser Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn

275 280 285

Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Asn Phe Tyr Gly Pro Gly Lys Thr Val

290 295 300

Asp Thr Ser Lys Pro Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Ile Thr Asn Asp

305 310 315 320

Gly Thr Asp Thr Gly Thr Leu Thr Glu Ile Arg Arg Leu Tyr Val Gln

325 330 335

Asn Gly Val Val Ile Gly Asn Gly Pro Ser Thr Tyr Thr Ala Ala Ser

340 345 350

Gly Asn Ser Ile Thr Glu Ser Phe Cys Lys Ala Glu Lys Thr Leu Phe

355 360 365

Gly Asp Thr Asn Val Phe Asp Thr His Gly Gly Leu Ser Ala Met Gly

370 375 380

Asp Ala Leu Gly Asp Gly Met Val Leu Val Leu Ser Leu Trp Asp Asp

385 390 395 400

His Ala Ala Asp Met Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr Pro Thr Thr Ser

405 410 415

Ser Ala Thr Ser Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Thr

420 425 430

Gly Asn Ala Thr Tyr Val Glu Ala Asn Tyr Pro Asn Ser Tyr Val Thr

435 440 445

Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Thr Leu Asn Ser Thr Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Thr Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Leu Thr Thr Lys Ala

465 470 475 480

Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr Thr Thr Thr Ser Ser Lys Thr

485 490 495

Thr Thr Thr Thr Ser Lys Thr Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser Thr Asn

500 505 510

Val Ala Gln Leu Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro

515 520 525

Thr Thr Cys Ala Ser Gly Thr Cys Thr Lys Gln Asn Asp Phe Tyr Ser

530 535 540

Gln Cys Leu

545

<210> 2

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggttgact ctttctccat ctacaaaaca gctctcctgc tgtccatgct ggccaccagc 60

aatgcgcagc aggtcggcac ttacaccact gaaacgcacc ccagcttgac ctggcaaacc 120

tgcagcggca gtggtagctg cactaccacc agcggcagcg tggtcattga cgccaattgg 180

cgttgggtgc acgaggttgg tggctacacc aactgctaca gcggcaacac ttgggacagt 240

tcgatctgct ccaccgatac cacctgcgcg tccgaatgtg ccctcgaggg tgccacttac 300

gcgagcacct atggtgtgac caccagcggc tcgtcgctcc gtctcaactt cgttacgacg 360

tcgtcgcaga agaacattgg ctcgcgtctg taccttctgg ctgacgacag cacctacgag 420

actttcaagc ttctcaatcg ggaattcact ttcgatgtcg acgtctccaa cctcccctgc 480

ggactgaacg gcgccctcta cttcgtctct atggacgctg acggcggcgt ttcccgcttc 540

ccgacgaaca aggctggcgc caagtatgga accggatatt gcgactccca atgtcctcgg 600

gatctcaagt tcatcgatgg tcaagccaac attgagggct gggagccatc ttcgaccgat 660

gtcaatgcgg gttccggtaa ccacggctcc tgctgccctg agatggatat ctgggaggcg 720

aacagcgtct ccagtgcctt caccgcccac ccttgcgact ccgtccagca gaccatgtgt 780

acgggcgatt cttgcggtgg cacttacagt gacactgccg accgttactc cggtacttgc 840

gatcctgatg gatgtgattt caacccttac cgcctgggca acaccaactt ctatggtccc 900

ggaaagaccg tcgacaccag caagcccttc accgtcgtga cgcagttcat caccaacgat 960

ggtactgaca ctggtaccct gactgagatc cgtcgtctct acgtgcagaa cggtgtcgtg 1020

attggcaacg gcccctccac ctacactgcc gcgagcggca actcgatcac cgagagcttc 1080

tgcaaggccg agaagacctt gttcggcgac accaacgtct tcgacactca cggtggactg 1140

tctgccatgg gtgacgccct cggcgatggc atggtcctgg tgctcagtct gtgggatgac 1200

cacgccgccg acatgctctg gctcgacagc gactacccca ccaccagctc ggctaccagc 1260

cctggtgtcg cccgcggtac ctgccccacc accaccggaa atgccaccta cgttgaggcc 1320

aactacccga actcgtatgt cacctactcc aacatcaagt tcggtaccct caactcgacc 1380

tactccggtt cgacctcggg cggctccagc tccagcagca ccaccttgac taccaaggcc 1440

tcgaccacca ccactagctc caagaccacc accaccagct ccaagaccac caccaccact 1500

tccaagacgt ccaccacctc gagctcgtcc acgaatgttg cccagctgta cggacagtgc 1560

ggtggacagg gatggactgg ccccaccacc tgcgccagcg gcacttgcac caagcagaat 1620

gacttctact cgcagtgcct gtag 1644

Claims

1.一种基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖水解酶的重组工程菌，诱导表达获得纤维二糖水解酶；所述重组工程菌的宿主细胞为大肠杆菌细胞，所述纤维二糖水解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)以纤维二糖水解酶为催化剂，以淫羊藿苷为底物进行转化反应，利用缓冲液调节反应体系pH值＝6～7，转化反应的温度为40～50℃，反应结束后将反应液分离纯化，制得淫羊藿次苷Ⅱ。

2.如权利要求1所述的基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，将活化后的重组工程菌接种于含有抗生素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀值为0.6～1，加入1～3g/L的乳糖或0.1～0.4mmol/L的IPTG，诱导结束后离心收集菌体，制备粗酶液，利用粗酶液进行转化反应。

3.如权利要求1所述的基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，反应体系中，以0.2M磷酸钠缓冲液或0.2M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为反应介质，以控制反应体系pH值＝6～7。

4.如权利要求1所述的基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，酶的添加量以湿菌体计为3～10mg/mL，底物初始浓度为30～100μg/mL。

5.如权利要求1所述的基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，采用甲醇或二甲基亚砜溶解淫羊藿苷后，再加入到反应体系中，反应体系中甲醇或二甲基亚砜的体积百分比浓度为1％～10％。

6.如权利要求1所述的基于酶催化制备淫羊藿次苷Ⅱ的方法，其特征在于，所述分离纯化包括：反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，最后旋蒸去除乙酸乙酯，得到淫羊藿次苷Ⅱ。