CN112076187B

CN112076187B - 安卓锭在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途

Info

Publication number: CN112076187B
Application number: CN202010533319.6A
Authority: CN
Inventors: 许嘉钦; 傅则凯
Original assignee: Simpson Biotech Co Ltd
Current assignee: Simpson Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: US20200390745A1; US11510902B2; CN112076187A; TWI797455B; JP2020200329A; TW202112363A

Abstract

本发明提供一种组合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，其中所述组合物包含安卓锭（Antrodins）。

Description

安卓锭在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途

技术领域

本发明是关于一种组合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，其中所述组合物包含牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的提取物或安卓锭(Antrodin)。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)为全球最常见的慢性肝病。NAFLD的病因为当肝脏脂肪酸摄取和脂肪酸合成的速率大于肝脏中脂肪酸氧化代谢和输出的速率，导致甘油三酯堆积在肝脏中，造成脂肪病变。NAFLD与代谢综合症有很高的关联性，例如：肥胖、高血糖、高血压和血脂异常。大约30％NAFLD患者会发生慢性发炎，以及发展成非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。持续性的慢性发炎会导致严重的肝纤维化、肝硬化(cirrhosis)和肝癌(hepatocellularcarcinoma)。NAFLD的流行率预计增加21％，患病人口从8,310万(2015年)增加到1.009亿(2030年)，而NASH的流行率预计会增加63％，病患数从1,652万增加到2,700万。NASH患病人口的急速增加显示NASH可能很快地将取代慢性C型肝炎(chronic hepatitis C)或酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)成为肝癌主要成因，并造成肝脏移植需求。减少肝脏脂肪堆积是治疗NAFLD/NASH的药物目标之一，而其他NAFLD/NASH药物治疗方法包含减少氧化应激、抗发炎、抗细胞凋亡、抗纤维化/肝硬化和对肠道菌进行调整。

牛樟芝Antrodia cinnamomea CHANG TT&WN CHOU(为牛樟芝Antrodiacamphorate在分类上的同义词)为牛樟芝属(多孔菌科，非褶菌目)中一种新的物种，其寄生于特有种牛樟树(Cinnamomum kanehirai HAY)的内腔心材上。此濒临绝种的物种在台湾已被当作中药，其用治疗食物、酒精和药物中毒、腹泻、腹痛、高血压、皮肤痒和肝癌。牛樟芝(A.cinnamomea)经热水提取的产物具有保肝的功效。有报导指出牛樟芝提取物在痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)-脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所诱导的肝中毒的小鼠中具有保肝的功效。

美国专利第7,109,232号提到牛樟芝菌丝体的化合物1-5以及其用途，例如：保肝、抗发炎或抗癌。上述的化合物1-5在其他文献中进一步命名为安卓锭A-E(Antrodins A-E)(Phuong do T et al.,2009,inhibitory effects of Antrodins A-E from Antrodiacinnamomea and their metabolites on hepatitis C virus protease.PhytotherRes.April；23(4):582-4)。根据现有技术指出，从牛樟芝菌丝体中分离出的化合物1-5不但在结构相似，且也具有相似的活性。

美国专利第7,732,482号公开一种从牛樟芝菌丝体所分离出的化合物用于治疗哺乳类的纤维化的方法，其中纤维化是经由TGF-β所调节，TGF-β与发炎诱导的慢性肝病有关。然而，没有任何研究指出安卓锭(Antrodin)可用于治疗NAFLD/NASH，特别是通过减少脂肪或甘油三酯在肝脏中堆积(NAFLD的致病因素)来达成。

发明内容

本发明提供一种预防或治疗在个体上非酒精性脂肪肝的方法，包含向具有罹患非酒精性脂肪肝的风险或患有非酒精性脂肪肝的个体施用组合物，而所述组合物包含治疗有效剂量的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的提取物或安卓锭(Antrodin)化合物。

本发明证实牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的提取物或安卓锭可治疗非酒精性脂肪性肝病，其可经由减少肝脏中脂肪油滴的大小、肝脏的重量、肝功能指标的表现、其他相关代谢指数和肝脏中脂质堆积量。

本文中的用语“一”或“一种”是用来叙述本发明的组件及成分。此术语仅为了叙述方便及给予本发明的基本观念。进一步，此叙述应被理解为包括一种或至少一种，且除非明显地另有所指，表示单数时亦包括复数。在权利要求中和“包含”一词一起使用时，所述用语“一”可意谓一个或超过一个。

本文中的用语“或”其意同“及/或”。

本发明提供一种在个体上预防或治疗非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease)的方法，包含施用组合物至具有罹患非酒精性脂肪性肝病的风险或患有非酒精性脂肪性肝病的所述个体，且所述组合物包含治疗有效剂量的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的提取物。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物是牛樟芝菌丝体的水提取物或有机溶剂提取物。在一较佳具体实施例中，所述有机溶剂为醇类、酯类、烷烃类或卤代烷烃类。在一更佳的具体实施例中，所述醇类为乙醇。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物包含安卓锭(Antrodin)化合物。在一较佳的具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭A(Antrodin A)、安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(Antrodin C)、安卓锭D(Antrodin D)和安卓锭E(Antrodin E)。在一更佳的具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(AntrodinC)和安卓锭D(Antrodin D)。在另一具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭B(Antrodin B)和安卓锭C(Antrodin C)。在一较佳的具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭D(Antrodin D)和安卓锭E(Antrodin E)。

本发明提供一种在个体上预防或治疗非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease)的方法，包含施用组合物至具有罹患非酒精性脂肪性肝病的风险或患有非酒精性脂肪性肝病的所述个体，且所述组合物包含治疗有效剂量的具有式(I)的化合物：

或其互变异构形式(tautomeric form)、其立体异构物(stereoisomer)、其消旋物(racemate)、其代谢物(metabolite)、其多形体(polymorph)、其盐类、或其溶剂化物(solvate)；

其中，

X为N或O；

R₁为H、羟基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基；

R₂为H、羟基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

R₃为无、H、羟基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

表示单键或双键；

但若X为O，则R₃为无；

若

表示单键，则所述化合物具有下式：

本文中所用的术语“非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)”指的是患者在与无饮酒史或与酒精摄取无关的情况下罹患脂肪肝疾病。脂肪肝(fatty liver)指的是相较于正常甘油三酯(triglyceride)在肝细胞中的含量，甘油三酯过量堆积在肝细胞中的现象。正常的肝脏中约含有5％脂肪组织，所述脂肪的主要成分为甘油三酯、脂肪酸、磷脂、胆固醇和胆固醇酯。然而，当脂肪肝发生时，脂肪中大部分的成分会被甘油三酯取代。当甘油三酯的重量占肝脏重大于5％时，此肝脏被诊断为脂肪肝。脂肪肝的产生是由于肝细胞中脂质代谢异常或携带肝细胞中多余脂肪离开肝脏的过程有缺失，其中最主要的原因是肝脏内脂质代谢异常。脂肪肝中脂肪堆积的主要成分为甘油三酯。所述非酒精性脂肪性肝病包含非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝癌等，而本发明的组合物包括但不限用于预防或治疗脂肪肝病。在一较佳具体实施例中，所述非酒精性脂肪性肝病包含非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪性肝炎。

本文中所用的术语“预防”指的是施用本发明的组合物以减缓或延迟非酒精性脂肪性肝病的全部作用。

本文中所用的术语“治疗”指的是治疗性处理以逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止的现象有关于疾病或病症(例如NAFLD)的病况发展或严重度。所述术语“治疗”包含减轻或改善至少一种与NAFLD相关的病况、疾病或病症的不良反应或病征。治疗一般是有效的，指的是当一种或多种病征或临床指标会减轻。或者，治疗是有效的，指的是当疾病的发展减缓或停顿。亦即，“治疗”不仅包含病征或指标的改善，还有与未治疗时所预期的相比，病征的发展或恶化的停止或至少减缓。无论是否可检测，良好或期望的临床结果都包含但不限于减缓一个或多于一个病征，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病发展的延迟或减慢，疾病状态的改善或减轻，缓解(无论是部分还是全部)，减少干预措施，缩短住院时间和/或降低死亡率。疾病的术语“治疗”还包括疾病的病征或副作用减轻(包括姑息疗法(palliative treatment))。本文中的治疗包括或不包含完全的“治愈”。

在一具体实施例中，所述化合物为安卓锭(Antrodin)化合物。在一较佳具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭A(Antrodin A)(3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]furan-2,5-dione)、安卓锭B(Antrodin B)(3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-1H-pyrrol-2,5-dione)、安卓锭C(Antrodin C)(3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-1H-pyrrol-1-ol-2,5-dione)、安卓锭D(Antrodin D)(3R*,4S*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮)(3R*,4S*-1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione)、安卓锭E(Antrodin E)(3R*,4R*-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮)(3R*,4R*-1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione)或其组合。在一更佳具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(AntrodinC)、安卓锭D(Antrodin D)或其组合。

在另一具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(Antrodin C)或其组合。在一较佳的具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭D(Antrodin D)、安卓锭E(Antrodin E)或其消旋物。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量足够用于减少脂质在肝脏中堆积的量来治疗所述非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量足够用于减少脂质在肝脏中堆积的量来治疗所述非酒精性脂肪性肝病。

在另一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量足够用于降低肝功能指针来治疗所述非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量足够用于降低肝功能指标来治疗所述非酒精性脂肪性肝病。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量足够用于降低代谢综合征相关指数来治疗非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量足够用于降低代谢综合征相关指数来治疗非酒精性脂肪性肝病。在一更佳具体实施例中，所述代谢综合征相关指数包含血糖、天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)或总甘油三酯(total triglyceride，TG)。

在另一具体实施例中，所述化合物进一步治疗脂肪肝相关代谢疾病。于一较佳具体实施例中，所述脂肪肝相关代谢疾病包含糖尿病。在一更佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量足够用于降低血糖和胰岛素的表达以治疗所述脂肪肝相关代谢疾病。

在一具体实施例中，所述化合物进一步抑制所述非酒精性脂肪性肝病引起的发炎反应。在一较佳具体实施例中，所述化合物足够用于降低丙二醛的表达以抑制所述非酒精性脂肪性肝病引起的发炎反应。

在另一具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量足够用于降低胰岛素和丙二醛的表达以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。

在一具体实施例中，所述个体为动物，较佳为哺乳类，更佳为人类。

在一具体实施例中，所述组合物为医药组合物。在一较佳具体实施例中，所述医药组合物可以选择性包含载体，例如：医药上可接受的载体。在一更佳具体实施例中，所述医药组合物进一步包含医药上可接受的载体。所述医药上可接受的载体是依据特定的所施用的组合物以及施用所述组合物的特定方式来决定。因此，所述医药组合物有多种合适的制剂。所述制剂可调配成适用于肠胃外给药，例如经由静脉、肌肉、真皮、腹膜和皮下途径给药。所述医药上可接受的载体可包含等渗透压无菌水溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂，溶质使制剂与预期接受者的血液等渗透压，所述医药上可接受的载体也可包含水溶性和非水溶性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、脂质体，微球颗粒和乳化剂。所述术语“医药上可接受的”指的是化合物和组合物对所给药的哺乳类不会产生过量毒性。

所述组合物(包括牛樟芝菌丝体的提取物或化合物)和医药上可接受的载体可通过本领域已知多种不同路径给药至对象。在一具体实施例中，所述组合物和所述医药上可接受的载体可经由外部、静脉、皮下、局部、口服或通过肌肉或吸入给药。所述医药组合物将经由消化系统或循环系统递送至目标位置。

所述组合物(包括牛樟芝菌丝体的提取物或化合物)和医药上可接受的载体可通过无菌水溶液或分散液、水性悬浮液、油乳剂、水在油包油的乳剂、特定的乳化液、长停留时间的乳化剂、黏性乳液、微乳剂、纳米乳剂、脂质体、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒、微汞以及天然或合成聚合物的几种可持续释放剂。所述医药上可接受的载体和所述组合物还可以制成气雾剂、片剂、丸剂、胶囊剂、无菌粉剂、栓剂、洗剂、乳膏、软膏、糊剂、凝胶剂、水凝胶、持续递送装置或其他可用于药物递送的制剂。

本文中所使用的术语“治疗有效剂量”是指所述治疗剂量可预防、降低、停止或逆转当所述个体开始接受治疗前的所述个体在特定情况下病征发展，或部分/完全缓解在特定情况下已存在的病征。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量范围为0.01mg/Kg至100mg/Kg。在一较佳具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量范围为0.05mg/Kg至80mg/Kg。在一更佳具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量范围为0.1mg/Kg至50mg/Kg。

在另一具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.01mg/Kg至100mg/Kg。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.05mg/Kg至80mg/Kg。在一更佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.1mg/Kg至50mg/Kg。

本发明进一步提供一种组合物用于制备预防或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的药物的用途，其中所述组合物包含牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的提取物。

本发明也提供一种组合物用以制备预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物，其中所述组合物包含治疗有效剂量的具有式(I)的化合物：

其中，

X为N或O；

R₁为H、羟基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基；

R₂为H、羟基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

R₃为无、H、羟基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

表示单键或双键；

但若X为O，则R₃为无；

若

表示单键，则所述化合物具有下式：

在一具体实施例中，所述非酒精性脂肪性肝病包含非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪性肝炎。

在一具体实施例中，所述化合物为安卓锭(Antrodin)化合物。在一较佳具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭A(Antrodin A)、安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(Antrodin C)、安卓锭D(Antrodin D)、安卓锭E(Antrodin E)或其组合。在一更佳具体实施例中，所述安卓锭化合物包含安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(Antrodin C)、安卓锭D(Antrodin D)或其组合。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量通过减少脂质在肝脏中堆积的量以治疗非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量通过减少脂质在肝脏中堆积的量以治疗非酒精性脂肪性肝病。

在另一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量通过降低肝功能指标以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量通过降低肝功能指标以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。

在一具体实施例中，所述牛樟芝菌丝体的提取物的治疗有效剂量通过降低代谢综合征相关指数以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量通过降低代谢综合征相关指数以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。在一更佳具体实施例中，所述代谢综合征相关指数包含血糖、天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)或总甘油三酯(total triglyceride，TG)。

在另一具体实施例中，所述化合物进一步治疗脂肪肝相关代谢疾病。在一较佳具体实施例中，所述脂肪肝相关代谢疾病包含糖尿病。在一更佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量通过降低血糖和胰岛素的表达以治疗所述脂肪肝相关代谢疾病。

在一具体实施例中，所述化合物抑制所述非酒精性脂肪性肝病引起的发炎反应。在一较佳具体实施例中，所述化合物通过降低丙二醛的表达以抑制所述非酒精性脂肪性肝病引起的发炎反应。

在另一具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量通过降低胰岛素和丙二醛的表达以治疗所述非酒精性脂肪性肝病。

在一具体实施例中，所述组合物为医药组合物。在一较佳实施例中，所述医药组合物进一步包含医药上可接受的载体。所述医药组合物可通过消化系统或循环系统将药物递送至目标位置。

在另一具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.01mg/Kg至100mg/Kg。在一较佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.05mg/Kg至80mg/Kg。在一更佳具体实施例中，所述化合物的治疗有效剂量范围为0.1至50mg/Kg。

附图说明

图1为以小于100μg/ml安卓锭(Antrodin)处理Hep G2细胞株的细胞存活率。

图2为以安卓锭(Antrodin)处理游离脂肪酸诱导脂质堆积的Hep G2细胞株。

图3为给予

后的肝脏外观和肝脏的苏木紫-伊红染色切片(×100倍放大)。

图4为给予安卓锭B(Antrodin B)或安卓锭C(Antrodin C)治疗后的肝脏外观。

图5为给予安卓锭B(Antrodin B)或安卓锭C(Antrodin C)治疗后的肝脏的苏木紫-伊红染色切片(×100倍放大)。

具体实施方式

以下实施例为非限制性且仅为本发明的各方面和特色的代表。

材料和方法

1.细胞中脂质堆积的抑制

1.1细胞培养

人类肝癌细胞株Hep G2以含10％胎牛血清、100U/ml盘尼西林(penicillin)和100mg/ml链霉素(streptomycin)的DMEM-HG(Dulbecco'smodified Eagle's medium-highglucose)培养液培养在37℃且含5％CO₂的细胞培养箱。

1.2细胞存活率测试

为从牛樟芝菌丝体分离出的混合物，其是从牛樟芝(Antrodiacinnamomea)菌丝体的水或有机溶剂提取物所制备。牛樟芝菌丝体提取物包含安卓锭B-E(Antrodins B-E)。5×10³Hep G2细胞种植在96孔板24小时，之后取不同浓度的

安卓锭B(Antrodin B)、安卓锭C(Antrodin C)和安卓锭D(Antrodin D)共同培养72小时。处理后，细胞与阿尔玛蓝(alamar blue，10％，w/v)共同培养3小时，之后读吸光值540nm和630nm。细胞存活率计算方式为[测试组的(OD570–OD600)/对照组的(OD570–OD600)]×100。

1.3游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)诱导脂质堆积和油红(Oil Red)检测

1×10⁵Hep G2细胞种植在96孔板并以含1％BSA但不含血清的细胞培养液培养24小时。为了诱导脂质堆积，上述细胞改种植在含有0.33mM棕榈酸(palmitic acid)和0.66mM油酸(oleic acid)的混合液中24小时，所述混合液是溶于添加或不添加安卓锭的无血清培养液内。在脂质堆积和安卓锭处理后，细胞以PBS进行清洗，然后用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)在室温下固定15分钟。固定后的细胞以PBS清洗5分钟，然后使用60％异丙醇(isopropanol)润洗2次，接着用1ml油红(Oil Red)试剂共同培养10分钟。细胞内脂质的定量分析方式为以0.5ml异丙醇提取附着在细胞脂质上的染剂，之后以吸光值490nm测量。

2动物模型中脂肪肝疾病相关指数的改善

2.1所使用的8周大的C57BL/6JNarl(B6)雄性小鼠购买于台北的动物实验中心。所有的动物饲养于温度为23±2℃以及光暗各12小时的动物房中。

2.2动物分组

根据《健康食品的护肝保健功效评估方法》，所有8周大的实验小鼠随机分成对照组、高脂饲料组和测试组(高脂饲料加喂不同剂量

安卓锭B或安卓锭C)。每一组含有3至4只小鼠。

2.3实验方法(预防型流程)

对照组给予18周正常饲料，其他组别给予18周高脂饲料。对照组和高脂饲料组以灌胃的方式给予去离子水，而Hepasim组每天以灌胃的方式给予30mg/Kg

每周记录每组小鼠的体重。18周结束后，全部小鼠以过量的CO₂处死。将小鼠处死的同时，从小鼠心脏采血。为了分离出血清，全血在4℃下用冷冻离心机以15,700×g离心5分钟。从小鼠取出肝脏后，以冰生理食盐水浸润。肝脏样本用于多种检测和组织病理学观察。

2.4实验方法(治疗型流程)

对照组给予20周正常饲料，其他组别给予20周高脂饲料。对照组和高脂饲料组以灌胃的方式给予去离子水，而安卓锭B或安卓锭C组从第11周到第20周每天以灌胃的方式给予10mg/Kg或30mg/Kg安卓锭B或安卓锭C的剂量。每周记录每组小鼠的体重。20周结束后，全部小鼠以CO₂处死。将小鼠处死的同时，从小鼠的心脏采血。为了分离血清，全血在4℃下用冷冻离心机以15,700×g离心5分钟。从小鼠取出肝脏后，以冰生理食盐水浸润。肝脏样本用于多种检测和组织病理学观察。

2.5各项指数的测定方式

保存的肝脏样本(0.1g)以1ml PBS均质化，之后在4℃下用冷冻离心机以15,700×g离心5分钟去移除沉淀物。血清和肝脏的天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和总甘油三酯(total triglyceride，TG)的含量以相应的检测试剂盒(Randox)测量。全血中的血糖以血糖仪(Roche)检测。血清中胰岛素以胰岛素的小鼠ELISA试剂盒(Invitrogen)检测。肝脏中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量是使用脂质过氧化(Lipid Peroxidation)检测试剂盒(比色/荧光)(abcam，#ab118977)检测。肝脏样本用于多种检测和组织病理学观察。

2.6组织学观察

小鼠肝脏取出后，以10％中性福尔马林进行固定。肝脏样本通过放置于不同浓度的乙醇(30、50、70、95、99.5％)以及二甲苯(xylene)进行脱水。最后，肝脏样本以石蜡切片进行包埋。为了苏木紫-伊红(haematoxylin-eosin，H&E)染色，肝脏组织切片置入二甲苯30分钟脱蜡，然后依序置于99.5％乙醇10分钟、95％乙醇5分钟、70％乙醇1分钟，50％乙醇1分钟和30％乙醇1分钟进行复水，之后浸泡于蒸馏水10分钟。为了染色细胞核，样本浸泡于苏木紫溶液中4分钟后，浸泡于蒸馏水数分钟，接着浸泡于伊红溶液中2分钟，进行细胞质染色，之后浸泡于蒸馏水10分钟。最后，样本依序置于90％乙醇2分钟，99.5％乙醇2分钟，二甲苯20分钟，之后以封片胶封片。

2.7统计与分析

所有结果以平均值±标准误差来表示。显著差异的分析以双尾学生t检验(two-tailed Student's t-test)来分析。P<0.05代表两组别有统计上的显著差异。

结果

1.细胞中脂质堆积的抑制

1.1细胞存活率测试

阿尔玛蓝(Alamar blue)处理后，所有组别的吸光值与对照组无显著差异(图1)。此结果表明，

(对照组)、安卓锭B、安卓锭C和安卓锭D的浓度低于100μg/ml下对Hep G2细胞没有细胞毒性。

1.2油红(Oil Red)分析

油红分析为一种直接检测细胞中脂质堆积的方法。所有组别的细胞以游离脂肪酸去孵育来诱导细胞中脂质的堆积。与未以游离脂肪酸去孵育来诱导细胞中脂质的堆积的空白组(blank group)相比，对照组多了60％的脂质于细胞中。

在测试组中，相较于对照组，安卓锭B、安卓锭C和安卓锭D明显降低细胞中脂质堆积(图2)。10μg/ml和100μg/ml安卓锭B处理分别降低12.8％和9.3％的细胞中脂质堆积；10μg/ml和100μg/ml安卓锭C分别降低20.6％和24.1％的细胞中脂质堆积；100μg/ml安卓锭D降低18.6％的细胞中脂质堆积。

2.动物模型中脂肪肝疾病相关指数的改善

2.1

显著降低高脂饲料造成的体重和肝脏重增加

相较于对照组(正常饲料)，高脂饲料组中体重和肝脏重两者都增加。在测试组中，给予小鼠30mg/Kg

可显著降低高脂饲料造成的体重和肝脏重增加。14周结束后，Hepasim组的体重和肝脏重相较于高脂饲料组分别下降32.7％和35.2％。所有的数据显示于表一中。

表一、喂食后体重及肝脏重变化(预防型流程)

2.2

的治疗显著改善脂肪肝疾病相关指数

高脂饲料组的ALT、AST、TG、TC在血清中的含量相较于对照组快速增加；而相较于高脂饲料组，

降低高脂饲料诱导的ALT、AST、TG、TC增加，分别降低约68％，70％，28.8％，27.5％。此外，

能显著降低肝脏中TG和TC的含量，分别降低约28.8％和20.6％。所有的数据显示于表二及表三。

表二、喂食后血清中ALT、AST、TG和TC(预防型流程)

表三、喂食后肝脏中TG和TC(预防型实验设计)

2.3肝脏外观和肝脏切片的免疫组织化学染色法

相较于对照组，高脂饲料组中小鼠肝脏外观呈现较粉白，其为脂肪肝的特征；但Hepsim组中小鼠肝脏没有观察到相同的特征。根据肝脏切片的苏木紫-伊红染色，高脂饲料组中小鼠肝脏内有较多的脂肪油滴，而

明显减少肝脏中脂肪油滴的增加(图3)。

3.安卓锭治疗改善动物模型中脂肪肝疾病相关指数

3.1安卓锭B和安卓锭C降低高脂饲料造成的体重和肝脏重增加

高脂饲料组中小鼠体重及肝脏重相较于对照组(正常饲料)明显的增加。在第20周结束的时候，喂食高脂饲料及10mg/Kg安卓锭B、10mg/Kg安卓锭C或30mg/Kg安卓锭C，相较于高脂饲料组，可分别减少了14％、4.5％或12.9％的体重增加率。体重增加率＝[(各测试组的体重-对照组的体重)/对照组的体重]x 100％。喂食10mg/Kg安卓锭B、10mg/Kg安卓锭C或30mg/Kg安卓锭C的组也显著抑制肝脏肥大。所有的数据显示于表四中。

表四、喂食后的体重、体重增加率和肝脏重(治疗型流程)

3.2安卓锭B或安卓锭C的治疗改善脂肪肝疾病相关指数

高脂饲料组中小鼠血清中的血糖、ALT、AST、TG和TC的含量相比于对照组都显著的增加，然而10mg/Kg安卓锭C的治疗与高脂饲料相比分别减少34.78％、12.3％、39.35％、1.57％和66.83％的血糖、ALT、AST、TG和TC的增加量。30mg/Kg安卓锭C的治疗与高脂饲料相比可以分别减少79.48％、48.96％、74.17％、21.96％和86.26％的血糖、ALT、AST、TG和TC的增加量。这些结果指出安卓锭C可以显著改善脂肪肝疾病。所有的数据显示于表五。

表五、喂食后血清中血糖、ALT、AST、TG和TC(治疗型流程)

3.3安卓锭B或安卓锭C的治疗改善高脂饲料小鼠的血浆中胰岛素

糖尿病与脂肪肝有高度的相关性，且许多脂肪肝患者也有高血糖的症状。安卓锭通过上述实验已被证明可以降低高脂饲料的小鼠的血糖。另一项糖尿病指标：血浆中胰岛素，也可因安卓锭B或安卓锭C的治疗而改善。与对照组相比，高脂饲料的小鼠的血浆中胰岛素从0.5ng/ml上升到2.2ng/ml。10mg/Kg安卓锭B、30mg/kg安卓锭B、10mg/Kg安卓锭C或30mg/Kg安卓锭C的治疗则分别降低223.6％、69.1％、81.8％或176.3％的血浆中胰岛素增加率。血浆中胰岛素增加率＝[(各测试组的血浆中胰岛素含量-对照组的血浆中胰岛素含量)/对照组的血浆中胰岛素含量]x 100％。此结果指出安卓锭B和安卓锭C都可以改善脂肪肝相关代谢疾病，其包含糖尿病。所有的数据显示于表六。

表六、喂食后血浆中胰岛素含量(治疗型流程)

3.4安卓锭B或安卓锭C的治疗改善高脂饲料小鼠的氧化应激

丙二醛(MDA)，一种活性氧物质(Reactive oxygen species，ROS)的衍生物，为体内氧化应激的常用指标。在此实验中，高脂饲料显著的增加小鼠体内MDA含量达226％，此结果指出高脂饲料提升小鼠体内氧化应激。10mg/Kg安卓锭B、30mg/Kg安卓锭B、10mg/Kg安卓锭C或30mg/Kg安卓锭C则分别降低24.8％、129.6％、86％或136.7％之小鼠体内MDA的增加率。此结果指出安卓锭B或安卓锭C能够(但不限于)通过降低氧化应激去改善与发炎相关的肝脏疾病。所有数据显示于表七。

表七、喂食后小鼠肝脏中丙二醛含量(治疗型实验设计)

3.5安卓锭B或安卓锭C治疗的高脂饲料小鼠的肝脏外观和肝脏切片的免疫组织化学染色法

肝脏切片的苏木紫-伊红染色或肝脏外观(油堆积或肥大)是发炎或脂肪肝相关的肝脏疾病的指标之一。高脂饲料组的小鼠的肝脏相较于对照组呈现粉白，其为脂肪肝的特征；但在安卓锭B或安卓锭C组则没有观察到相同的特征(图4)。根据肝脏切片的苏木紫-伊红染色，高脂饲料组中小鼠肝脏内有较多的脂肪油滴，但10mg/Kg安卓锭B、30mg/Kg安卓锭B、10mg/Kg安卓锭C或30mg/Kg安卓锭C的治疗则明显降低肝脏中脂肪油滴的增加(图5)。这些结果清楚表明安卓锭B或安卓锭C可以显著改善发炎或脂肪肝相关的肝脏疾病。

在此所适当地举例说明本发明，其可能在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或非本文中具体公开的限制情况下实施。术语和表示作为说明书的描述而非限制，以及无意图使用这些术语和表示，其排除任何等同于所示及说明的特点或其部分，但需认识的是，在本发明的专利申请范围内有可能有各种不同的改变。因此，应了解虽然已根据优选实施方案及任意的特点来具体公开了本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所公开的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明要求保护的范围内。

Claims

1.一种组合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，其中所述组合物包含治疗有效剂量的具有式(I)的化合物：

或其互变异构形式、其立体异构物、其消旋物、或其盐类；

其中，

X为N；

R₁为3-甲基-2-丁烯氧基；

R₂为异丁基；

R₃为H、羟基；

表示单键或双键。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物的治疗有效剂量通过减少脂质在肝脏中堆积的量以治疗所述非酒精性脂肪肝。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物的治疗有效剂量通过降低肝功能指标以治疗所述非酒精性脂肪肝。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物的治疗有效剂量通过降低代谢综合征相关指数来治疗所述非酒精性脂肪肝。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述代谢综合征相关指数包含血糖、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、总胆固醇或总甘油三酯。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物的治疗有效剂量通过降低胰岛素和丙二醛的表达以治疗所述非酒精性脂肪肝。