TWI620815B - 用於改善非酒精性脂肪變性肝炎的樟芝菌絲體發酵物、其製備方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭露一種用於改善非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的樟芝菌絲體發酵物的製備方法，以及將該樟芝菌絲體發酵物用於製備用於改善非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的醫藥組合物的用途，其降低了NASH患者血液中的麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、丙酮酸轉胺酶(GPT)、飯前血糖(GLUAC)、低密度脂蛋白質(LDL)、三酸甘油酯(TG)、膽固醇(CHOL)及鐵蛋白數值，且顯著下降NASH患者的纖維化指數、脂肪肝指數、肝臟發炎指數、非酒精性脂肪肝指數。

Description

用於改善非酒精性脂肪變性肝炎的樟芝菌絲體發酵物、其製備方法及其用途

本發明是關於一種樟芝菌絲體發酵物，尤其是關於一種用於改善非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的樟芝菌絲體發酵物、其製備方法及其用途。

肝病

肝臟位於人體軀幹中央偏右位置，成人肝臟重約1200~1500克，約占成人體重的1/40到1/50，是人體體內最大臟器。肝臟參與人體許多代謝機轉，例如消化及吸收脂肪與脂溶性維生素A、D、E、K、合成蛋白質、參與血糖的調節與代謝、參與凝血過程與解毒作用等，對身體健康維持極為重要。肝細胞再生能力相當強，但肝臟幾乎沒有可以傳遞疼痛的神經。因此，當肝臟細胞受損或有脂肪堆積影響其功能時，患者鮮少會察覺到肝臟不適而就診，故易造成嚴重肝病變。

近年來，由於飲食與生活型態改變，國人罹患包含慢性肝病、肝炎、脂肪肝與肝癌等肝病的人數日益增多。根據行政院衛生福利部103年國人死因統計結果，十大死因以慢性疾病為主，慢性肝病及肝硬化名列死亡率第9名。肝癌則名列十大癌症死因順位第2名。可見肝病對於健康、生活品質及壽命的影響。

脂肪肝(hepatic steatosis)

在學理上，肝細胞內脂質蓄積超過肝濕重5%，或組織學上每單位肝臟面積有1/3以上肝細胞產生脂肪堆積，稱為脂肪肝。脂肪肝的發生是由於肝臟中三酸甘油酯未被肝臟代謝或運送至其他部位，導致脂肪微滴散布於肝臟細胞，造成肝臟脂肪過度浸潤。脂肪肝成因與以下因素有關。

1.飲食中攝入的膽固醇與三酸甘油酯在小腸合成乳糜微粒，乳糜微粒與脂肪組織中的三酸甘油酯經由脂蛋白酯酶作用後變成游離脂肪酸。

2.肝臟經由血液循環攝入游離脂肪酸後，在肝臟重新合成三酸甘油酯或變成脂肪微滴散布在肝臟。

3.肝臟合成極低密度脂蛋白(VLDL)，VLDL攜帶三酸甘油酯釋出到組織。當肝臟的VLDL合成減少時，將使得三酸甘油酯運轉發生問題，肝臟將囤積過多的三酸甘油酯而形成脂肪肝。

脂肪性肝臟病變分為三個主要階段。早期為脂肪肝，此階段可逆轉恢復正常狀態。若長期大量脂肪浸潤，可使肝細胞慢性發炎成為慢性肝炎，逐漸發生反覆的肝臟脂肪變性、壞死，最後演變成纖維化造成肝硬化或肝腫瘤。

非酒精性脂肪肝

脂肪肝疾病可分為酒精性脂肪肝疾病(AFLD)與非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。AFLD主要是因為攝取過量酒精所導致。男性每日攝取酒精克數大於30克或女性每日攝取酒精克數大於20克，即為酒精攝取過量。

某些NAFLD患者平常並無飲酒習慣，但肝臟組織卻出現與酒精性肝功能障礙極類似的脂肪堆積病變。NAFLD所涵蓋的肝臟疾病很廣泛，包括單純的肝臟脂肪變性(NAFL)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝硬化和肝癌。此外，NAFLD患者可能衍生出肝臟纖維化，例如研究發現 15-50%的NASH患者衍生不同程度的肝臟纖維化。大部分的NASH無明顯症狀，但肝臟細胞長期處在脂肪浸潤、高氧化壓力與發炎下容易導致壞死、纖維化甚至是肝硬化，而危害到健康。

根據2012年亞洲地區調查發現，台灣台中地區體重正常之人(BMI<25kg/m²)的NAFLD盛行率為15%，但體重過重之人(BMI≧25kg/m²)的盛行率高達31%。因此，體重過重或肥胖是造成NAFLD的危險因子。再者，近年研究顯示，香港、歐洲、美國等地的NAFLD盛行率相當高，因此，NAFLD已成為各國急需關注的健康議題。

NAFLD檢測方式

NASH可能進展成纖維化與肝硬化。肝臟功能檢測通常藉由抽血檢測丙氨酸轉胺酶(alanine aminotransferase(ALT)，又稱為丙酮酸轉胺酶(GPT))、天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase(AST)，又稱為麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT))、鹼性磷酸酶、γ-穀氨醯基轉移酶。當肝臟發炎時，儲存在肝臟的GPT和GOT會釋出細胞外，兩者數值上升。由於GOT也存在心肌、骨骼肌以及紅血球，因此若有心肌梗塞或肌肉壞死等因素，GOT值亦會上升。由於GPT大多存在肝臟，故GPT比GOT更具參考價值。當GOT、GPT值上升超過40IU/L時，患者將被懷疑帶有肝炎；若GOT、GPT值高出正常上限2倍即可更確定。

FibroMax檢測是一種非侵入性檢測肝纖維化、脂肪堆積及發炎程度的檢測方法，其包含五種檢測指數：

1.纖維化指數：以FibroTest檢測血清中5種蛋白質(α2-巨球蛋白、apoA1、肝球蛋白、γ-麩醯胺基轉肽酶和膽紅素)的濃度，以診斷肝纖維化。

2.肝臟發炎指數：以ActiTest測定肝細胞壞死發炎反應。

3.脂肪肝指數：以SteatoTest診斷脂肪肝。

4.非酒精肝炎指數：以NashTest診斷肥胖、胰島素抗性糖尿病或高血脂症患者之NASH病變。

5.酒精肝炎指數：以AshTest診斷嚴重飲酒者是否有酒精性脂肪肝。

上述五種檢測指數的分級意義說明如表一所示。

臨床上以腹部超音波、電腦斷層掃描或核磁共振等影像技術檢測肝臟。

1.腹部超音波：當肝臟脂肪堆積小於5%時，腹部超音波檢測方式敏感度約73%。但當肝臟脂肪堆積大於10%時，其檢測方式敏感度高達90%。因此，以腹部超音波診斷脂肪肝是最經濟且常用的方法。

2.電腦斷層掃描：正常肝臟實質密度高，在電腦斷層掃描下顏色比脾臟白。脂肪肝密度較正常肝臟密度小，在電腦斷層掃描下顏色比脾臟暗。因此，當在電腦斷層掃描下肝臟較為灰暗或較脾臟暗時，表示肝臟傾向有脂肪變性。

3.核磁共振：分析肝臟內的脂肪和水，觀察肝臟實質部分的同步期(in phase)和不同步期(out-of-phase)影像。

NAFLD或NASH患者的治療方式除了減重、運動、避免攝取酒精之外，還可服用西方藥物來治療。例如，每日800國際單位的維生素 E可改善經切片檢查確診有NASH的非糖尿病患者的肝組織，可作為第一線治療用藥。但對於有糖尿病的NASH、未經切片檢查確診及肝硬化患者，目前尚未有足夠研究資料證明維生素E的治療功效。匹格列酮(pioglitazone)雖然可用以治療經切片檢查確診有NASH的患者，但此藥物可能會造成患者體重增加。史塔丁(statin)類藥物被用於治療NAFLD患者的血脂異常、改善肝功能異常而不會增加藥物導致肝損傷的風險。有些研究結果顯示，每福敏(metformin)可改善NASH患者的肝功能及肝組織，但經過統合分析後發現無顯著效果。有些小型研究結果顯示，熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)可改善NASH患者的肝功能、肝脂肪化及肝組織，但大型臨床研究卻發現無明顯效果。因此，科學家們仍致力於改善或治療NAFLD或NASH的治療方式。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。

為了改善或治療NAFLD或NASH，本發明提供一種用於改善NASH之樟芝菌絲體發酵物、其製備方法及其用途，該樟芝菌絲體發酵物進一步可用於改善NASH所導致的病變。相較於一般西方藥物及治療方法，本發明揭露的液態發酵樟芝菌絲體發酵物的製備方法更為安全、簡便，樟芝菌絲體發酵物的活性物質更天然、安全，並達到改善NASH的效果。本發明揭露的樟芝菌絲體發酵物可製成藥物組合物或保健食品，經由口服方式改善NASH患者的症狀。

因此，本發明揭露一種用於改善NASH的樟芝菌絲體發酵物的製備方法，包括：(a)接種樟芝菌絲體至第一培養基，並於15~35℃及pH 2~7下培養第一時段；以及(b)將經培養的樟芝菌絲體從第一培養基轉移至第二 培養基，並於15~35℃及pH 2~7下培養第二時段，獲得該樟芝菌絲體發酵物。

在一個具體實施例中，步驟(a)的樟芝菌絲體是來自培養於平板培養基上的樟芝菌絲體。在一個具體實施例中，製備方法更包括：(c)冷凍乾燥樟芝菌絲體發酵物，獲得樟芝菌絲體凍乾物；以及(d)將樟芝菌絲體凍乾物磨粉，獲得樟芝菌絲體凍乾粉。在一個具體實施例中，第一及第二培養基具有相同成分，且第一及第二培養基的成分包括選自穀類、豆類、無機鹽類、醣類、酵母抽出物、麥芽抽出物及其組合所組成的群組。在一個具體實施例中，第一及第二培養基包括1.0%葡萄糖、0.5%黃豆粉狀物、0.5%消化蛋白質、0.01% MgSO₄及0.01%去沫劑，且第一及第二培養基的pH值為4.0。在一個具體實施例中，步驟(a)是在燒瓶進行，且第一時段為4~14天。在一個具體實施例中，步驟(b)是在發酵槽進行，發酵槽的槽壓為0.5~1.0kg/cm²，通入發酵槽的氣體的通氣速率為0.01-1.5VVM，且第二時段為4~14天。在一個具體實施例中，氣體係選自由空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣及其組合所組成的群組。

本發明更揭露一種樟芝菌絲體發酵物的用途，其係用於製備用於改善NASH的醫藥組合物。

在一個具體實施例中，該醫藥組合物用以降低NASH患者血液中的第一生化參數並顯著下降該NASH患者的肝臟發炎，第一生化參數係選自由麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、丙酮酸轉胺酶(GPT)、飯前血糖(GLUAC)、低密度脂蛋白質(LDL)、三酸甘油酯(TG)、膽固醇(CHOL)、鐵蛋白及其組合所組成的群組。在一個具體實施例中，該醫藥組合物用以提高NASH患者血液中的第二生化參數，且第二生化參數至少為高密度脂蛋白質(HDL)。在一個具體實施例中，該醫藥組合物降低NASH患者肝臟的纖維化指數、脂肪肝指數、肝臟發炎指數及/或非酒精性脂肪肝指數。

本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。

第1圖示出非酒精性脂肪變性肝炎患者服用本發明樟芝菌絲體發酵物之前(初診)及三個月後(複診)的血液生化數值。

第2圖示出非酒精性脂肪變性肝炎患者服用本發明樟芝菌絲體發酵物之前(初診)及三個月後(複診)的FibroMax檢測數值。

本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。

樟芝菌絲體的發酵培養

本發明揭露一種用於改善NASH的樟芝菌絲體發酵物的製備方法，在一具體實施例中使用的樟芝(Antrodia camphorata,CCRC-35396)是購自財團法人食品工業發展研究所(FDRDI)生物資源保存及研究中心(BCRC)。所屬技術領域中具有通常知識者均理解用於改善NASH的樟芝品種包括但不限於BCRC(先前稱為CCRC)編號35396、35398、35716、36401、36711、36795、37848、37849、37850、37889、37890、37891、37893、37894、37941及其他生物材料寄存資料庫的樟芝菌種。

首先將樟芝菌絲體接種至平板培養基上，在15~35℃培養5~14天。接著將培養後的樟芝菌絲體接種至燒瓶內的培養基，在15~35℃、pH 2~7、10~250rpm震盪培養數天，較佳為4~14天。再將燒瓶內培養後的樟芝菌絲體接種至發酵槽內的培養基，於15~35℃、pH 2~7、槽壓0.5~1.0kg/cm²及通氣速率0.01-1.5VVM培養4~14天，得到樟芝菌絲體發酵物。通入 發酵槽的氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合。再將樟芝菌絲體發酵物冷凍乾燥，獲得樟芝菌絲體凍乾物，再將該樟芝菌絲體凍乾物磨粉，獲得樟芝菌絲體凍乾粉。

在上述製備方法中，樟芝菌絲體可在25℃、pH 3~7下培養，或在pH 3下培養。在上述製備方法中，燒瓶及發酵槽內可使用相同培養基，培養基的成分包括穀類、豆類、無機鹽類、醣類、酵母抽出物、麥芽抽出物或其組合。

樟芝菌絲體發酵物可在過濾後再進行冷凍乾燥及磨粉等步驟。上述樟芝菌絲體、樟芝菌絲體發酵物、樟芝菌絲體凍乾物或樟芝菌絲體凍乾粉可按照一般製藥技術製備成醫藥組合物或按照一般保健食品加工技術製備成保健食品。醫藥組合物包含了樟芝菌絲體的活性物質，且可進一步添加藥學上可接受的載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑、溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，並製備為口服投藥的錠劑、膠囊、顆粒、丸劑、片劑、粉劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型(以錠劑為例)一般所使用之載體可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑(如硬脂酸鎂)等基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。液狀懸浮液或乳化劑劑型係將活性物質(例如樟芝菌絲體、樟芝菌絲體發酵物、樟芝菌絲體凍乾物或樟芝菌絲體凍乾粉)懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑的油狀物質，並視需要添加適度的甜味劑、風味劑或色素。

在一個具體實施例中，將CCRC-35396菌株接種至2-L Hinton燒瓶中的1L培養基(含1.0%葡萄糖、0.5%黃豆粉狀物、0.5%消化蛋白質、0.01% MgSO₄、0.01%去沫劑KM-72，pH4.0)，在25℃旋轉振盪10天。再將經培養的樟芝菌絲體轉移到含160L上述培養基的200-L醱酵器，在25℃發酵培養12天。將獲得的樟芝菌絲體發酵物進行冷凍乾燥及磨粉，獲得樟芝菌絲體凍乾粉。

人體臨床試驗

資料處理與統計分析

本發明的人體臨床試驗研究資料由營養師收集台灣台中海線地區醫院肝炎門診的NASH患者病例，並進行資料建檔、編碼及除錯，以SPSS(SPSS 2.0版)統計軟體和Epi Info^TM統計軟體進行統計。在考量該人體臨床試驗的研究目的、研究架構及研究假設後，使用的統計方法包括描述性統計、次數分配表、卡方分析、無母數檢定及迴歸分析等。

受試者條件

本發明具體實施例以台灣台中海線地區醫院肝炎門診的NASH患者(受試者)37人為研究對象，男女患者年齡介於20~80歲，皆無飲酒習慣，且排除孕婦、哺乳婦女、肝硬化、肝癌、攝取營養補充劑、正參與減重者及服用會造成脂肪肝藥物(胺碘酮、葡萄糖皮質素、合成雌激素和異菸酸酊等)的患者。37位患者的初診基本資料如表二所示。

*數值以平均值±標準差(中位數)表示

日本2011年調查發現，體重增加與NAFLD的形成有關，該研究將人口依照身體質量指數(BMI)不同分組分析，BMI正常組(BMI<23kg/m²)發生脂肪肝的比例為2.7%，BMI介於23~25kg/m²的人發生脂肪肝的比例為11%，而BMI介於25~30kg/m²的肥胖者其比例為35-51%，BMI>30kg/m²的肥胖者其比例高達78~80%。可見體重越重，罹患NAFLD機率越大。 由表二可知，本發明受試者多為體重過重(BMI≧24)且腰圍過粗(男性>90公分，女性>80公分)，而腰圍比BMI值更能反應受試患者肝臟三酸甘油酯的囤積，顯示受試者多為脂肪肝的高風險群。

受試者初診肝臟檢測數值

受試者在服用本發明樟芝菌絲體發酵物之前接受抽血及分析其體內生化數值，如表三所示。受試者的GOT及GPT值皆高於閥值(40IU/L)，顯示受試者有肝臟發炎的情況。

此外，並以FibroMax檢測來檢測受試者肝臟情形。如表四所示，受試者初診時普遍都有肝臟輕度門脈纖維化現象(纖維化指數為0.32±0.18)，部分受試者肝臟細胞有中度發炎與壞死現象(肝臟發炎指數為0.46±0.23)，且都有輕度至中度脂肪肝的情況(脂肪肝指數為0.67±0.21)。受試者脂肪肝類型呈現為非酒精性脂肪肝(非酒精肝炎指數為0.50±0.15)，而不是酒精性脂肪肝(酒精肝炎指數為0.02±0.03)。

服藥方式

本發明的用於改善NASH的樟芝菌絲體發酵物經一般製藥技術製備成樟芝菌絲體膠囊，每粒膠囊0.5公克，成分為熱量2.4大卡、蛋白質0.2公克、脂肪0.04公克、碳水化合物0.3公克、糖0.01公克、鈉2毫克以及多醣體5%以上。患者每日早、中、晚口服該樟芝菌絲體膠囊1粒，每日3粒。所屬技術領域中具有通常知識者均理解，放大或縮小上述膠囊的重量，放大或縮小各成分含量、或些微調整上述膠囊的重量或各成分含量，均落於本發明的範圍內。

受試者複診肝臟檢測數值

初診後3個月，37位受試者有31位回診，再次對31位受試者進行營養評估。如表三及相對應的第1圖所示，受試者使用樟芝菌絲體發酵物(膠囊)3個月後的生化數值的GOT、GPT、TG及鐵蛋白平均值顯著地小於服用前。此外，GOT與GPT數值皆顯著下降(p值<0.01)，顯示服用本發 明的樟芝菌絲體發酵物3個月後能有效減少肝臟發炎的情形。過去研究指出NASH患者的肝臟鐵蛋白含量比單純脂肪肝病人的鐵蛋白含量多，表示肝臟過高的鐵蛋白可能會促進脂肪的過氧化作用以及纖維發生，最後導致NASH繼續惡化。而服用本發明的樟芝菌絲體發酵物(膠囊)3個月後，鐵蛋白數值亦顯著降低(p值<0.05)，顯示本發明的樟芝菌絲體發酵物能改善NASH患者肝臟發炎的情形。

^&數值以平均值±標準差(中位數)表示

^#以無母數分析/兩個相關檢定

*表示P<0.05，**表示p<0.01

進一步利用FibroMax檢測受試者服用本發明的樟芝菌絲體發酵物(膠囊)3個月後肝纖維化、脂肪堆積及發炎的狀態程度是否受到改善。如表四及相對應的第2圖所示，受試者於服用本發明樟芝菌絲體發酵物3個月後，肝臟發炎指數及脂肪肝指數顯著地小於服用前(肝臟發炎指數的P值為0.002；脂肪肝指數的P值為0.003)。此外，纖維化指數、非酒精肝炎指數亦降低。酒精肝炎指數並無顯著差異且趨近於0，表示本案受試者確實 為NASH患者，而不是AFLD患者。

^&數值以平均值±標準差(中位數)表示

^#以無母數分析/兩個相關檢定

**表示p<0.01

前述實驗結果顯示，NASH患者常見的營養診斷為體重過重、肥胖、脂肪攝取過多、熱量攝取過多、醣類攝取型態不理想以及體能活動不足。在服用本發明的樟芝菌絲體發酵物(膠囊)3個月後，NASH患者肝功能顯著改善，其GOT、GPT及肝臟發炎指數顯著下降，其TG、鐵蛋白以及脂肪肝指數也顯著下降。故樟芝菌絲體可應用於改善非酒精性脂肪肝或NASH的領域。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims (9)

1. 一種樟芝(Antrodia camphorata)菌絲體發酵物的用途，其係用於製備用於改善非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的一醫藥組合物。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該醫藥組合物用以降低一NASH患者血液中的一第一生化參數並顯著下降該NASH患者的肝臟發炎，該第一生化參數係選自由麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、丙酮酸轉胺酶(GPT)、飯前血糖(GLUAC)、低密度脂蛋白質(LDL)、三酸甘油酯(TG)、膽固醇(CHOL)、鐵蛋白及其組合所組成的群組，該醫藥組合物用以提高該NASH患者血液中的一第二生化參數，且該第二生化參數至少為高密度脂蛋白質(HDL)。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該醫藥組合物降低一NASH患者肝臟的一指數，該指數係選自由一纖維化指數、一脂肪肝指數、一肝臟發炎指數、一非酒精性脂肪肝指數所組成的群組其中之一。
4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該樟芝菌絲體發酵物是以包括以下的步驟製備：(a)接種一樟芝菌絲體至一第一培養基，並於15~35℃及pH 2~7下培養4~14天；以及(b)將經培養的樟芝菌絲體從該第一培養基轉移至一第二培養基，並於15~35℃及pH 2~7下培養4~14天，獲得該樟芝菌絲體發酵物，其中該第一及該第二培養基包括1.0%葡萄糖、0.5%黃豆粉狀物、0.5%消化蛋白質、0.01% MgSO₄及0.01%去沫劑，且該第一及該第二培養基的pH值為4.0。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中步驟(a)的該樟芝菌絲體是來自培養於一平板培養基上的樟芝菌絲體。
6. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該樟芝菌絲體發酵物更是以包括以下的步驟製備： (c)冷凍乾燥該樟芝菌絲體發酵物，獲得一樟芝菌絲體凍乾物；以及(d)將該樟芝菌絲體凍乾物磨粉，獲得一樟芝菌絲體凍乾粉。
7. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中步驟(a)是在一燒瓶進行。
8. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中步驟(b)是在一發酵槽進行，該發酵槽的槽壓為0.5~1.0kg/cm²，通入該發酵槽的一氣體的通氣速率為0.01-1.5VVM。
9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中該氣體係選自由空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣及其組合所組成的群組。