TWI797455B

TWI797455B - 安卓錠化合物用於預防或治療非酒精性脂肪肝病的用途

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Publication number: TWI797455B
Application number: TW109119916A
Authority: TW
Inventors: 許嘉欽; 傅則凱
Original assignee: 善笙生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2023-04-01
Also published as: JP2020200329A; CN112076187B; US20200390745A1; TW202112363A; US11510902B2; CN112076187A

Abstract

本發明提供一種組合物用於製備一預防或治療非酒精性脂肪肝病的藥物之用途，其中該組合物包含安卓錠(Antrodins)。

Description

安卓錠化合物用於預防或治療非酒精性脂肪肝病的用途

本發明係關於一種組合物用於製備一預防或治療非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的藥物之用途，其中該組合物包含一牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的萃取物或安卓錠(Antrodins)。

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為全球最常見的慢性肝病。NAFLD的病因為當肝臟脂肪酸攝取和脂肪酸合成的速率大於肝臟中脂肪酸氧化代謝和輸出的速率，導致三酸甘油酯堆積在肝臟中，造成脂肪病變。NAFLD與代謝綜合症有很高的關聯性，例如：肥胖、高血糖、高血壓和血脂異常。大約30% NAFLD患者會發生慢性發炎，以及發展成非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。持續性的慢性發炎會導致嚴重的肝纖維化、肝硬化(cirrhosis)和肝癌(hepatocellular carcinoma)。NAFLD的流行率預計增加21%，患病人口從8,310萬(2015年)增加到1.009億(2030年)，而NASH的流行率預計會增加63%，病患數從1,652萬增加到2,700萬。NASH患病人口的急速增加顯示NASH可能很快地將取代慢性C型肝炎(chronic hepatitis C)或酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)成為肝癌主要成因，並造成肝臟移植需求。減少肝臟脂肪堆積是治療NAFLD/NASH的藥物目標之一，而其他NAFLD/NASH藥物治療方法包含減少氧化壓力、抗發炎、抗細胞凋亡、抗纖維化/肝硬化和對腸道菌相進行調整。

牛樟芝Antrodia cinnamomea CHANG TT & WN CHOU(為牛樟芝Antrodia camphorate在分類上的同義詞)為牛樟芝屬(多孔菌科，非褶菌目)中一種新的物種，其寄生於特有種牛樟樹(Cinnamomum kanehirai HAY)的內腔心材上。此瀕臨絕種的物種在台灣已被當作中藥，其用治療食物、酒精和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚癢和肝癌。牛樟芝(A.cinnamomea)經熱水萃取的產物具有保肝的功效。有報導指出牛樟芝萃取物在痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)-脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)所誘導之肝中毒的小鼠中具有保肝的功效。

美國專利第7,109,232號提到牛樟芝菌絲體的化合物1-5以及其用途，例如：保肝、抗發炎或抗癌。上述的化合物1-5在其他文獻中進一步命名為安卓錠A-E(Antrodins A-E)(Phuong do T et al.,2009,inhibitory effects of Antrodins A-E from Antrodia cinnamomea and their metabolites on hepatitis C virus protease.Phytother Res.April；23(4)：582-4)。根據先前技藝指出，從牛樟芝菌絲體中分離出的化合物1-5不但在結構相似，且也具有相似的活性。

美國專利第7,732,482號公開一種從牛樟芝菌絲體所分離出的化合物用於治療哺乳類的纖維化的方法，其中纖維化是經由TGF-β所調節，TGF-β與發炎誘導的慢性肝病有關。然而，沒有任何研究指出安卓錠(Antrodin)可用於治療NAFLD/NASH，特別是透過減少脂肪或三酸甘油酯在肝臟中堆積(NAFLD的致病因素)來達成。

本發明提供一種於一個體上預防或治療非酒精性脂肪肝病的方法，包含施予具有罹患非酒精性脂肪肝病的風險或患有非酒精性脂肪肝病的個體一組合物，而該組合物包含一治療有效劑量的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的萃取物或安卓錠(Antrodin)化合物。

本發明證實牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的萃取物或安卓錠可治療非酒精性脂肪肝病，其可經由減少肝臟中脂肪油滴的大小、肝臟的重量、肝功能指標的表現、其他相關代謝指數和肝臟中脂質堆積量。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。進一步，此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。於申請專利範圍中和”包含”一詞一起使用時，該用語「一」可意謂一個或超過一個。

本文中的用語「或」其意同「及/或」。

本發明提供一種於一個體上預防或治療非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease)的方法，包含施予一組合物於具有罹患非酒精性脂肪肝病的風險或患有非酒精性脂肪肝病的該個體，且該組合物包含一治療有效劑量的牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的萃取物。

於一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物是一牛樟芝菌絲體的水萃取物或有機溶劑萃取物。於一較佳具體實施例中，該有機溶劑為醇類、酯類、烷烴類或鹵代烷烴類。在一更佳的具體實施例中，該醇類為乙醇。

於一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物包含安卓錠(Antrodin)化合物。於一較佳的具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠A(Antrodin A)、安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)、安卓錠D(Antrodin D)和安卓錠E(Antrodin E)。於一更佳的具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)和安卓錠D(Antrodin D)。於另一具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠B(Antrodin B)和安卓錠C(Antrodin C)。於一較佳的具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠D(Antrodin D)和安卓錠E(Antrodin E)。

本發明提供一種於一個體上預防或治療非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease)的方法，包含施予一組合物於具有罹患非酒精性脂肪肝病的風險或患有非酒精性脂肪肝病的該個體，且該組合物包含一治療有效劑量的具有式(I)之化合物：

或其互變異構形式(tautomeric forms)、其立體異構物(stereoisomers)、其消旋物(racemates)、其代謝物(metabolites)、其多形體(polymorphs)、其鹽類、或其溶劑合物(solvates)；

其中，

X為N或O；

R₁為H、羥基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基；

R₂為H、羥基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

R₃為無、H、羥基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

表示一單鍵或雙鍵；

但若X為O，則R₃為無；

若

表示一單鍵，則該化合物具有下式：

本文中所用的術語「非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)」指的是患者在與無飲酒史或與酒精攝取無關的情況下罹患脂肪肝疾病。脂肪肝(fatty liver)指的是相較於正常三酸甘油酯(triglyceride)在肝細胞中的含量，三酸甘油酯過量堆積在肝細胞中的現象。正常的肝臟中約含有5%脂肪組織，該脂肪的主要成分為三酸甘油酯、脂肪酸、磷脂，膽固醇和膽固醇酯。然而，當脂肪肝發生時，脂肪中大部分的成分會被三酸甘油酯取代。當三酸甘油酯的重量佔肝臟重大於5%時，此肝臟被診斷為脂肪肝。脂肪肝的產生是由於肝細胞中脂質代謝異常或攜帶肝細胞中多餘脂肪離開肝臟的過程有缺失，其中最主要的原因是肝臟內脂質代謝異常。脂肪肝中脂肪堆積的主要成分為三酸甘油酯。該非酒精性脂肪肝病包含非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝癌等，而本發明的組合物包括但不限用於預防或治療脂肪肝病。於一較佳具體實施例中，該非酒精性脂肪肝病包含非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎。

本文中所用的術語「預防」指的是施予本發明的組合物去減緩或延遲非酒精性脂肪肝疾病的全部作用。

本文中所用的術語「治療」指的是治療性處理以逆轉、減輕、改善、抑制、減慢或停止有關於疾病或病症(例如NAFLD)之病況發展或嚴重度。該術語「治療」包含減輕或改善至少一種與NAFLD相關的病況、疾病或病症之不良反應或病徵。治療一般是有效的，指的是當一種或多種病徵或臨床指標會減輕。或者，治療是有效的，指的是當疾病的發展減緩或停頓。亦即，「治療」不僅包含病徵或指標的改善，還有與未治療時所預期的相比，病徵的發展或惡化之停止或至少減緩。無論是否可檢測，良好或期望的臨床結果包含但不限於減緩一個或多於一個病徵，疾病程度的減輕，疾病狀態的穩定(即不惡化)，疾病發展的延遲或減慢，疾病狀態的改善或減輕，緩解(無論是部分還是全部)，減少干預措施，縮短住院時間和/或降低死亡率。疾病的術語「治療」還包括疾病的病徵或副作用減輕(包括姑息療法(palliative treatment))。本文中的治療包括或不包含完全的「治癒」。

於一具體實施例中，該化合物為一安卓錠(Antrodin)化合物。於一較佳具體實施例中，該安卓錠化合物係選自由安卓錠A(Antrodin A)(3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]furan-2,5-dione)、安卓錠B(Antrodin B)(3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-1H-pyrrol-2,5-dione)、安卓錠C(Antrodin C)(3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮)(3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]-1H-pyrrol-1-ol-2,5-dione)、安卓錠D(Antrodin D)(3R*,4S*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯碇-2,5-二酮)(3R*,4S*-1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione)和安卓錠E(Antrodin E)(3R*,4R*-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯碇-2,5-二酮)(3R*,4R*-1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)phenyl]pyrrolidine-2,5-dione)所組成的群組。於一更佳具體實施例中，該安卓錠化合物係選自由安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)和安卓錠D(Antrodin D)所組的群組。

於另一具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)或其組合。於一較佳的具體實施例中，該安卓錠化合物包含安卓錠D(Antrodin D)、安卓錠E(Antrodin E)或其消旋物。

在一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量足夠用於減少脂質在肝臟中堆積的量來治療該非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量足夠用於減少脂質在肝臟中堆積的量來治療該非酒精性脂肪肝病。

在另一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量足夠用於降低肝功能指標來治療該非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量足夠用於降低肝功能指標來治療該非酒精性脂肪肝病。

在一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量足夠用於降低代謝症侯群相關指數來治療非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量足夠用於降低代謝症侯群相關指數來治療非酒精性脂肪肝病。在一更佳具體實施例中，該代謝症侯群相關指數包含血糖、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)或總三酸甘油酯(total triglyceride，TG)。

在另一具體實施例中，該化合物進一步治療一脂肪肝相關代謝疾病。於一較佳具體實施例中，該脂肪肝相關代謝疾病包含糖尿病。於一更佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量足夠用於降低血糖和胰島素的表現以治療該脂肪肝相關代謝疾病。

在一具體實施例中，該化合物進一步抑制該非酒精性脂肪肝病引起的發炎反應。在一較佳具體實施例中，該化合物足夠用於降低丙二醛的表現以抑制該非酒精性脂肪肝病引起的發炎反應。

在另一具體實施例中，該化合物的治療有效劑量足夠用於降低胰島素和丙二醛的表現以治療該非酒精性脂肪肝病。

在一具體實施例中，該個體為動物，較佳為哺乳類，更佳為人類。

在一具體實施例中，該組合物為一醫藥組合物。在一較佳具體實施例中，該醫藥組合物可以選擇性包含載體，例如：醫藥上可接受的載體。在一更佳具體實施例中，該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受的載體。該醫藥上可接受的載體是依據特定的所施予之組合物以及施予該組合物的特定方式來決定。因此，該醫藥組合物有多種合適的製劑。該製劑可調配成適用於腸胃外給藥，例如經由靜脈、肌肉、真皮、腹膜和皮下途徑給藥。該醫藥上可接受的載體可包含等滲透壓無菌水溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑，溶質使製劑與預期接受者的血液等滲透壓，該醫藥上可接受的載體也可包含水溶性和非水溶性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、防腐劑、脂質體，微球顆粒和乳化劑。該術語「醫藥上可接受的」指的是化合物和組合物對所施予於哺乳類不會產生過量毒性。

該組合物(包括牛樟芝菌絲體的萃取物或化合物)和醫藥上可接受的載體可經由本領域已知多種不同路徑施予於對象。在一具體實施例中，該組合物和該醫藥上可接受的載體可經由外部、靜脈、皮下、局部、口服或通過肌肉或吸入施予。該醫藥組合物將經由消化系統或循環系統遞送至目標位置。

該組合物(包括牛樟芝菌絲體的萃取物或化合物)和醫藥上可接受的載體可透過無菌水溶液或分散液、水性懸浮液、油乳劑、水在油包油的乳劑、特定的乳化液、長停留時間的乳化劑、黏性乳液、微乳劑、奈米乳劑、脂質體、微粒、微球、奈米球、奈米顆粒、微汞以及天然或合成聚合物的幾種可持續釋放劑。該醫藥上可接受的載體和該組合物還可以製成氣霧劑、片劑、丸劑、膠囊劑、無菌粉劑、栓劑、洗劑、乳膏、軟膏、糊劑、凝膠劑、水凝膠、持續遞送裝置或其他可用於藥物遞送的製劑。

本文中所使用的術語「治療有效劑量」是指該治療劑量可預防、降低、停止或逆轉當該個體開始接受治療前之該個體在特定情況下病徵發展，或部分/完全緩解在特定情況下已存在的病徵。

在一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量範圍為0.01mg/Kg至100mg/Kg。在一較佳具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量範圍為0.05mg/Kg至80mg/Kg。在一更佳具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量範圍為0.1mg/Kg至50mg/Kg。

在另一具體實施例中，該化合物的治療有效劑量範圍為0.01mg/Kg至100mg/Kg。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量範圍為0.05mg/Kg至80mg/Kg。在一更佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量範圍為0.1mg/Kg至50mg/Kg。

本發明進一步提供一種組合物用於製備一預防或治療非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的藥物之用途，其中該組合物包含一牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的萃取物。

本發明也提供一種組合物用以製備預防或治療非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的藥物，其中該組合物包含一治療有效劑量的具有式(I)之化合物：

其中，

X為N或O；

R₁為H、羥基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯氧基或C_2-10炔氧基；

R₂為H、羥基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

R₃為無、H、羥基、C_1-10烷基、C_2-10烯基或C_2-10炔基；

表示一單鍵或雙鍵；

但若X為O，則R₃為無；

若

表示一單鍵，則該化合物具有下式：

於一具體實施例中，該非酒精性脂肪肝病包含非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎。

於一具體實施例中，該化合物為一安卓錠(Antrodin)化合物。於一較佳具體實施例中，該安卓錠化合物係選自由安卓錠A(Antrodin A)、安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)、安卓錠D(Antrodin D)和安卓錠E(Antrodin E)所組成的群組。於一更佳具體實施例中，該安卓錠化合物係選自由安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)和安卓錠D(Antrodin D)所組的群組。

在一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量藉由減少脂質在肝臟中堆積的量以治療非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量藉由減少脂質在肝臟中堆積的量以治療非酒精性脂肪肝病。

在另一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量藉由降低肝功能指標以治療該非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量藉由降低肝功能指標以治療該非酒精性脂肪肝病。

在一具體實施例中，該牛樟芝菌絲體的萃取物的治療有效劑量藉由降低代謝症侯群相關指數以治療該非酒精性脂肪肝病。在一較佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量藉由降低代謝症侯群相關指數以治療該非酒精性脂肪肝病。在一更佳具體實施例中，該代謝症侯群相關指數包含血糖、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)或總三酸甘油酯(total triglyceride，TG)。

在另一具體實施例中，該化合物進一步治療一脂肪肝相關代謝疾病。於一較佳具體實施例中，該脂肪肝相關代謝疾病包含糖尿病。於一更佳具體實施例中，該化合物的治療有效劑量藉由降低血糖和胰島素的表現以治療該脂肪肝相關代謝疾病。

在一具體實施例中，該化合物抑制該非酒精性脂肪肝病引起的發炎反應。在一較佳具體實施例中，該化合物藉由降低丙二醛的表現以抑制該非酒精性脂肪肝病引起的發炎反應。

在另一具體實施例中，該化合物的治療有效劑量藉由降低胰島素和丙二醛的表現以治療該非酒精性脂肪肝病。

在一具體實施例中，該組合物為一醫藥組合物。在一較佳實施例中，該醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受的載體。該醫藥組合物可透過消化系統或循環系統將藥物遞送至目標位置。

圖1為以小於100μg/ml安卓錠(Antrodin)處理Hep G2細胞株的細胞存活率。

圖2為以安卓錠(Antrodin)處理游離脂肪酸誘導脂質堆積的Hep G2細胞株。

圖3為給予Hepasim^®後的肝臟外觀和肝臟之蘇木紫-伊紅染色切片(×100倍放大)。

圖4為給予安卓錠B(Antrodin B)或安卓錠C(Antrodin C)治療後的肝臟外觀。

圖5為給予安卓錠B(Antrodin B)或安卓錠C(Antrodin C)治療後的肝臟之蘇木紫-伊紅染色切片(×100倍放大)。

以下實施例為非限制性且僅為本發明的各方面和特色的代表。

材料和方法

1.細胞中脂質堆積的抑制

1.1 細胞培養

人類肝癌細胞株Hep G2以含10%胎牛血清、100U/ml盤尼西林(penicillin)和100mg/ml鏈黴素(streptomycin)的DMEM-HG(Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose)培養液培養在37℃且含5% CO₂的細胞培養箱。

1.2 細胞存活率測試

Hepasim^®為從牛樟芝菌絲體分離出的混合物，其是從牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌絲體的水或有機溶劑萃取物所製備。牛樟芝菌絲體萃取物包含安卓錠B-E(Antrodins B-E)。5×10³ Hep G2細胞種植在96孔盤24小時，之後取不同濃度的Hepasim^®、安卓錠B(Antrodin B)、安卓錠C(Antrodin C)和安卓錠D(Antrodin D)共同培養72小時。處理後，細胞與阿爾瑪藍(alamar blue，10%，w/v)共同培養3小時，之後讀吸光值540nm和630nm。細胞存活率計算方式為[測試組的(OD570-OD600)/對照組的(OD570-OD600)]×100。

1.3 游離脂肪酸(Free fatty acids，FFA)誘導脂質堆積和油紅(Oil Red)檢測

1×10⁵ Hep G2細胞種植在96孔盤並以含1% BSA但不含血清的細胞培養液培養24小時。為了誘導脂質堆積，上述細胞改種植在含有0.33mM棕櫚酸(palmitic acid)和0.66mM油酸(oleic acid)的混合液中24小時，該混合液是溶於有添加或不添加安卓錠之無血清培養液內。在脂質堆積和安卓錠處理後，細胞以PBS進行清洗，然後用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)在室溫下固定15分鐘。固定後的細胞以PBS清洗5分鐘，然後使用60%異丙醇(isopropanol)潤洗2次，接著用1ml油紅(Oil Red)試劑共同培養10分鐘。細胞內脂質的定量分析方式為以0.5ml異丙醇萃取附著在細胞脂質上的染劑，之後以吸光值490nm測量。

2 動物模式中脂肪肝疾病相關指數的改善

2.1 所使用的8週大的C57BL/6JNarl(B6)雄性小鼠購買於國家動物實驗中心(台北，台灣)。所有的動物飼養於溫度為23±2℃以及光暗各12小時的動物房中。

2.2 動物分組

根據「健康食品之護肝保健功效評估方法」(衛生福利部食品藥物管理署，台灣)，所有8週大的實驗小鼠隨機分成對照組、高脂飼料組和測試組(高脂飼料加餵不同劑量Hepasim^®、安卓錠B或安卓錠C)。每一組含有3至4隻小鼠。

2.3 實驗方法(預防型流程)

對照組給予18週正常飼料，其他組別給予18週高脂飼料。對照組和高脂飼料組以管餵的方式給予去離子水，而Hepasim組每天以管餵的方式給予30mg/Kg Hepasim^®。每週記錄每組小鼠的體重。18週結束後，全部小鼠以過量的CO₂犧牲。小鼠犧牲的同時，從小鼠心臟採血。為了分離出血清，全血在4℃下用冷凍離心機以15,700×g離心5分鐘。從小鼠取出肝臟後，以冰生理食鹽水浸潤。肝臟樣本用於多種檢測和組織病理學觀察。

2.4 實驗方法(治療型流程)

對照組給予20週正常飼料，其他組別給予20週高脂飼料。對照組和高脂飼料組以管餵的方式給予去離子水，而安卓錠B或安卓錠C組從第11周到第20周每天以管餵的方式給予10或30mg/Kg安卓錠B或安卓錠C的劑量。每週記錄每組小鼠的體重。20週結束後，全部小鼠以CO₂犧牲。小鼠犧牲的同時，從小鼠的心臟採血。為了分離血清，全血在4℃下用冷凍離心機以15,700×g離心5分鐘。從小鼠取出肝臟後，以冰生理食鹽水浸潤。肝臟樣本用於多種檢測和組織病理學觀察。

2.5 各項指數的測定方式

保存的肝臟樣本(0.1g)以1ml PBS均質化，之後在4℃下用冷凍離心機以15,700×g離心5分鐘去移除沉澱物。血清和肝臟的天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和總三酸甘油酯(total triglyceride，TG)的含量以相應的檢測套組(Randox)測量。全血中的血糖以血糖機(Roche)偵測。血清中胰島素以胰島素之小鼠ELISA套組(Invitrogen)偵測。肝臟中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量是使用脂質過氧化(Lipid Peroxidation)檢測套組(比色/螢光)(abcam，#ab118977)偵測。肝臟樣本用於多種檢測和組織病理學觀察。

2.6 組織學觀察

小鼠肝臟取出後，以10%中性福馬林進行固定。肝臟樣本藉由放置於不同濃度之乙醇(30、50、70、95、99.5%)以及二甲苯(xylene)進行脫水。最後，肝臟樣本以石蠟切片進行包埋。為了蘇木紫-伊紅 (haematoxylin-eosin，H&E)染色，肝臟組織切片置入二甲苯30分鐘脫蠟，然後依序置於99.5%乙醇10分鐘、95%乙醇5分鐘、70%乙醇1分鐘，50%乙醇1分鐘和30%乙醇1分鐘進行復水，之後浸泡於蒸餾水10分鐘。為了染色細胞核，樣本浸泡於蘇木紫溶液中4分鐘後，浸泡於蒸餾水數分鐘，接著浸泡於伊紅溶液中2分鐘，進行細胞質染色，之後浸泡於蒸餾水10分鐘。最後，樣本依序置於90%乙醇2分鐘，99.5%乙醇2分鐘，二甲苯20分鐘，之後以封片膠封片。

2.7 統計與分析

所有結果以平均值±標準誤差來表示。顯著差異的分析以雙尾學生t檢定(two-tailed Student's t-test)來分析。P<0.05代表兩組別有統計上之顯著差異。

結果

1 細胞中脂質堆積的抑制

1.1 細胞存活率測試

阿爾瑪藍(Alamar blue)處理後，所有組別的吸光值與對照組無顯著差異(圖1)。此結果指出，Hepasim^®(對照組)、安卓錠B、安卓錠C和安卓錠D的濃度低於100μg/ml下對Hep G2細胞沒有細胞毒性。

1.2 油紅(Oil Red)分析

油紅分析為一種直接檢測細胞中脂質堆積的方法。所有組別的細胞以游離脂肪酸去孵育來誘導細胞中脂質的堆積。與未以游離脂肪酸去孵育來誘導細胞中脂質的堆積的空白組(blank group)相比，對照組多了60%的脂質於細胞中。

在測試組中，相較於對照組，安卓錠B、安卓錠C和安卓錠D明顯降低細胞中脂質堆積(圖2)。10μg/ml和100μg/ml安卓錠B處理分別降低12.8%和9.3%的細胞中脂質堆積；10μg/ml和100μg/ml安卓錠C分別降低20.6%和24.1%的細胞中脂質堆積；100μg/ml安卓錠D降低18.6%的細胞中脂質堆積。

2 動物模式中脂肪肝疾病相關指數的改善

2.1 Hepasim^®顯著降低高脂飼料造成的體重和肝臟重增加

相較於對照組(正常飼料)，高脂飼料組中體重和肝臟重兩者都增加。在測試組中，給予小鼠30mg/Kg Hepasim^®可顯著降低高脂飼料造成的體重和肝臟重增加。14週結束後，Hepasim組的體重和肝臟重相較於高脂飼料組分別下降32.7%和35.2%。所有的數據顯示於表一中。

表一、餵食後體重及肝臟重變化(預防型流程)

2.2 Hepasim^®的治療顯著改善脂肪肝疾病相關指數

高脂飼料組的ALT、AST、TG、TC在血清中的含量相較於對照組快速增加；而相較於高脂飼料組，Hepasim^®降低高脂飼料誘導的ALT、AST、TG、TC增加，分別降低約68%，70%，28.8%，27.5%。此外，Hepasim^®能顯著降低肝臟中TG和TC的含量，分別降低約28.8%和20.6%。所有的數據顯示於表二及表三。

表二、餵食後血清中ALT、AST、TG和TC(預防型流程)

表三、餵食後肝臟中TG和TC(預防型實驗設計)

2.3 肝臟外觀和肝臟切片的免疫組織化學染色法

相較於對照組，高脂飼料組中小鼠肝臟外觀呈現較粉白，其為脂肪肝的特徵；但Hepsim組中小鼠肝臟沒有觀察到相同的特徵。根據肝臟切片的蘇木紫-伊紅染色，高脂飼料組中小鼠肝臟內有較多的脂肪油滴，而Hepasim^®明顯減少肝臟中脂肪油滴的增加(圖3)。

3.安卓錠治療改善動物模型中脂肪肝疾病相關指數

3.1 安卓錠B和安卓錠C降低高脂飼料造成的體重和肝臟重增加

高脂飼料組中小鼠體重及肝臟重相較於對照組(正常飼料)明顯的增加。在第20周結束的時候，餵食高脂飼料及10mg/Kg安卓錠B、10mg/Kg安卓錠C或30mg/Kg安卓錠C，相較於高脂飼料組，可分別減少了14%、4.5%或12.9%的體重增加率。體重增加率=[(各測試組的體重-對照組的體重)/對照組的體重]x 100%。餵食10mg/Kg安卓錠B、10mg/Kg安卓錠C或30mg/Kg安卓錠C的組別亦顯著抑制肝臟肥大。所有的數據顯示於表四中。

表四、餵食後的體重、體重增加率和肝臟重(治療型流程)

3.2 安卓錠B或安卓錠C的治療改善脂肪肝疾病相關指數

高脂飼料組中小鼠血清中的血糖、ALT、AST、TG和TC的含量相比於對照組都顯著的增加，然而10mg/Kg安卓錠C的治療與高脂飼料相比分別減少34.78%、12.3%、39.35%、1.57%和66.83%的血糖、ALT、AST、TG和TC之增加量。30mg/Kg安卓錠C的治療與高脂飼料相比可以分別減少79.48%、48.96%、74.17%、21.96%和86.26%的血糖、ALT、AST、TG和TC之增加量。這些結果指出安卓錠C可以顯著改善脂肪肝疾病。所有的數據顯示於表五。

表五、餵食後血清中血糖、ALT、AST、TG和TC(治療型流程)

3.3 安卓錠B或安卓錠C的治療改善高脂飼料小鼠之血漿中胰島素

糖尿病與脂肪肝有高度的相關性，且許多脂肪肝患者也有高血糖的症狀。安卓錠透過上述實驗已被證明可以降低高脂飼料之小鼠的血糖。另一項糖尿病指標：血漿中胰島素，也可因安卓錠B或安卓錠C的治療而改善。與對照組相比，高脂飼料的小鼠之血漿中胰島素從0.5ng/ml上升到2.2ng/ml。10mg/Kg安卓錠B、30mg/kg安卓錠B、10mg/Kg安卓錠C或30mg/Kg安卓錠C的治療則分別降低223.6%、69.1%、81.8%或176.3%的血漿中胰島素增加率。血漿中胰島素增加率=[(各測試組的血漿中胰島素含量-對照組的血漿中胰島素含量)/對照組的血漿中胰島素含量]x 100%。此結果指出安卓錠B和安卓錠C都可以改善脂肪肝相關代謝疾病，其包含糖尿病。所有的數據顯示於表六。

表六、餵食後血漿中胰島素含量(治療型流程)

3.4 安卓錠B或安卓錠C的治療改善高脂飼料小鼠的氧化壓力

丙二醛(MDA)，一種活性氧物質(Reactive oxygen species，ROS)的衍生物，為體內氧化壓力的常用指標。在此實驗中，高脂飼料顯著的增加小鼠體內MDA含量達226%，此結果指出高脂飼料提升小鼠體內氧化壓力。10mg/Kg安卓錠B、30mg/Kg安卓錠B、10mg/Kg安卓錠C或30mg/Kg安卓錠C則分別降低24.8%、129.6%、86%或136.7%之小鼠體內MDA的增加率。此結果指出安卓錠B或安卓錠C能夠(但不限於)透過降低氧化壓力去改善與發炎相關之肝臟疾病。所有數據顯示於表七。

表七、餵食後小鼠肝臟中丙二醛含量(治療型實驗設計)

3.5 安卓錠B或安卓錠C治療的高脂飼料小鼠之肝臟外觀和肝臟切片的免疫組織化學染色法

肝臟切片的蘇木紫-伊紅染色或肝臟外觀(油堆積或肥大)是發炎或脂肪肝相關的肝臟疾病的指標之一。高脂飼料組之小鼠的肝臟相較於對照組呈現粉白，其為脂肪肝的特徵；但在安卓錠B或安卓錠C組則沒有觀察到相同的特徵(圖4)。根據肝臟切片的蘇木紫-伊紅染色，高脂飼料組中小鼠肝臟內有較多的脂肪油滴，但10mg/Kg安卓錠B、30mg/Kg安卓錠B、10mg/Kg安卓錠C或30mg/Kg安卓錠C的治療則明顯降低肝臟中脂肪油滴的增加(圖5)。這些結果清楚指出安卓錠B或安卓錠C可以顯著改善發炎或脂肪肝相關的肝臟疾病。

在此所適當地舉例說明本發明，其可能在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或非本文中特定揭示的限制情況下實施。術語和表示作為說明書的描述而非限制，以及無意圖使用這些術語和表示，其排除任何等同於所示及說明的特點或其部分，但需認識的是，在本發明的專利申請範圍內有可能有各種不同的改變。因此，應了解雖然已根據優選實施方案及任意的特點來具體公開了本發明，但是本領域技術人員仍會修改和改變其中所公開的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明要求保護的範圍內。

Claims

一種化合物用以製備預防或治療非酒精性脂肪肝病的藥物之用途，其中該化合物為3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮或3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮。
如請求項1所述之用途，其中該化合物藉由減少脂質在肝臟中堆積的量以預防或治療該非酒精性脂肪肝病。
如請求項1所述之用途，其中該化合物進一步降低胰島素和丙二醛的表現。
如請求項1所述之用途，其中該化合物的治療有效劑量範圍為0.01mg/Kg至100mg/Kg。