CN104324023A - 一种Antrodin B在抗肝纤维化疾病中的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Antrodin B(结构如图所示)在抗肝纤维化疾病中的应用，属于医药技术领域，具体涉及Antrodin B对肝星状细胞CFSC-8B的作用及其抗肝纤维化的作用机制。公开了Antrodin B在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物中的用途，在体外/体内抑制肝星状细胞增殖、或抑制肝星状细胞DNA合成的用途。

Description

一种Antrodin B在抗肝纤维化疾病中的应用方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具休涉及Antrodin B在抗肝纤维化疾病中的应用。 

背景技术

肝纤维化(Liver fibrosis)是肝脏遭受长期持续损伤后反复修复的结果，是一种愈合过程中的代偿反应。肝纤维化的病因包括病毒性肝炎，酒精中毒、自身代谢疾病、肥胖、血吸虫病、胆汁淤积、药物毒物、自身免疫性肝病等。肝纤维化的主要变化为细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在肝脏内合成增多.降解减少，最终导致了肝脏内纤维结缔组织及ECM异常积累，其中ECM包括胶原蛋白，纤维连接蛋白，弹性蛋白，层粘连蛋白，透明质酸和蛋白聚糖等。活化的星状细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，分泌I、III、IV型胶原，基质金属蛋白酶、matrix metalloproteinase，MMPs)和金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)等促纤维化因子，对肝纤维化的发生和发展起着重要的作用。 

近年来，大量研究报道了肝纤维化发展的病理机制为HSC的活化、增殖、迁移及细胞外基质合成与降解的失衡，其中TGF-β1和PDGF-BB起了关键的调节作用，TGF-β1在肝纤维化发生与发展过程中可激活HSC，抑制胶原酶，上调胶原蛋白基因表达，促进ECM合成与沉积PDGF是主要由肝脏枯否细胞和HSC分泌的可促进特定细胞群分裂、活化及增殖的细胞因子，能促进胶原的合成与分泌，是最强烈的有丝分裂原。TGF-β1和PDGF介导的信号通路起关键的调控作用 

肝纤维化是肝脏受到各种致病因子损伤后的代偿反应，我国慢性肝病病例日益增多，约有30％的慢性乙型肝炎患者进一步发展为肝硬化及肝癌。研究表明，肝纤维化是可以逆转的病理过程，因此，积极寻找有效低毒的抗肝纤维化药物具有重要现实意义。鉴于HSCs及其功能在肝纤维化形成过程中的重要作用，未来抗肝纤维化一个重要目标就是针对活化的HSCs分泌过剩ECM的直接靶向性，有望提高疗效、抑制纤维化形成、减小毒副作用。 

从药食用真菌中发现的具有活性的天然小分子化合物是药物研究的重要资源，其种类繁多，数量庞大，具有抗细菌、抗氧化、降血压等多种生理功能。近年来，越来越关注从药食用真菌中分离具有多种药理作用且结构多样的的化合物。为新药研究提供更多的先导化台物 

Antrodin B是从樟芝中提取分离得到的属于马来酸和琥珀酸的衍生物，其结构式为： 

该化合物的分子式这C₁₉H₂₃NO₃分子量为313.1678，黄色针状物。 

现有技术中没有揭示Antrodin B具有抗肝硬化和抗肝纤维化的作用 

发明内容

本发明的公开了Antrodin B的新的制药用途。即Antrodin B在制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物中的用途：所述的引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病包括但不限于病毒性肝炎、酒精性肝病、血吸虫病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、先天性酮代谢异常和胆石症。 

本发明的一个目的是提供Antrodin B在制备用于抑制肝星状细胞增殖、或抑制肝星状细胞DNA合成的药物中的用途。 

本发明的又一目的是提供一种制备治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的药物组合物，其特征在于所述方法包括有效量的Antrodin B。 

本发明的再一目的是提供一种在体外/体内抑制肝星状细胞增殖、或抑制肝星状细胞DNA合成的药物组合物，其特征在于所述方法包括有效量的Antrodin B。 

药物组合物，其包含Antrodin B，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；所述药物组合物用于治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化、或者用于治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的疾病、或者用于抑制肝星状细胞增殖、或抑制肝星状细胞DNA合成。 

可采用常规加工方法，制成Antrodin B的注射液、口服液、胶囊、片剂、颗粒剂、提取物再混合等剂型。 

术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。 

通常本发明药物组合物含有0.1 Antrodin B99.9％重量百分比的有效成分Antrodin B。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如有需要，可将有效成分Antrodin B与一众或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅料结合，制成可作为任用的适当的给药形式或剂量形式。 

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂醇。可以是普通制剂、缓释制剂、控制制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等：润湿剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等、还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片、或双层片和多层片，为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体，关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液刑、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯由梨醇脂肪酸酯等。另外为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。 

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其他材料。 

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或冶疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是本领域的做法是，给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。 

术语“预防和/或治疗有效剂量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。 

术语“受试者”可以指患者或者其他接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。 

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有 关。 

本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明的药物组合物以有效成分(Antrodin B)计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001Antrodin B1000mg/kg体重/天，例如介于0.01Antrodin B100mg/kg体重/天，例如介于0.1Antrodin B10mg/kg体重/天。 

根据本发明的药物组合物可以有效的预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。 

附图说明

图1为Antrodin B的结构式。 

图2为Antrodin B对CFSC-8B细胞存活率的影响。 

数值表示增值率(％)；与对照组相比，**P＜0.01 

图3为Antrodin B对PDGF-BB刺激细胞划痕损伤的作用 

与对照组相比，**P＜0.01；与PDGF-BB组相比，##P＜0.01 

图4为Antrodin B对TGF-β1诱导细胞划痕损伤的作用。 

与对照组相比，**P＜0.01；与TGF-β1诱导组相比，##P＜0.01 

图5为Antrodin B对PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞迁移的作用 

注：a：对照组；b：PDGF-BB(10ng/mL)；c：Silybin(25μM)+PDGF-BB(10ng/mL)； 

d：Antrodin B(6μM)+PDGF-BB(10ng/mL)；e：Antrodin B(12μM)+PDGF-BB(10ng/mL)； 

f：Antrodin B(25μM)+PDGF-BB(10ng/mL)； 

与对照组相比，**P＜0.01；与PDGF-BB诱导组相比，##P＜0.01。 

图6为Antrodin B对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞迁移的作用 

注：a：对照组；b：TGF-β1(10ng/mL)；c：Silybin(25μM)+TGF-β1(10ng/mL)； 

d：Antrodin B(6μM)+TGF-β1(10ng/mL)；e：Antrodin B(12μM)+TGF-β1(10ng/mL)； 

f：Antrodin B(25μM)+TGF-β1(10ng/mL)； 

与对照组相比，**P＜0.01；与TGF-β1诱导组相比，##P＜0.01 

图7为Antrodin B对PDGF-BB诱导的α-SMA，Col1，Col3及Fn mRNA表达量的影响。 

与对照组相比，**P＜0.01；与PDGF-BB诱导组相比，##P＜0.01。 

图8为Antrodin B对TGF-β1诱导的α-SMA，Col1，Col3及Fn mRNA表达量的影响。 

与对照组相比，**P＜0.01；与TGF-β1诱导组相比，##P＜0.01 

图9为Antrodin B对PDGF-BB刺激CFSC-8B细胞p-ERK，p-JNK，p-P38蛋白表达的影响。 

与对照组相比，**P＜0.01；与PDGF-BB诱导组相比，##P＜0.01。 

图10为Antrodin B对TGF-β1诱导CFSC-8B细咆α-SMA，Col1，p-Smad2，p-Smad3蛋白表达影响。 

(A)Antrodin B对α-SMA，Col1蛋白表达影响(B)Antrodin B对p-Smad2.p-Smad3蛋白表达影响。 

与对照组相比，**P＜0.01；与TGF-β1诱导组相比，##P＜0.01 

具体实施方式

通过下列实施例可以更好地理解本发明，它们只是解释本发明，而不对其加以限制。 

实施例1Antrodin B对CFSC-8B细胞生长的影响。 

MTT法检测细胞毒性：称取0.5gMTT粉末，溶于100mL PBS中，配制成终浓度为5mg/mL的MTT溶液，并用微孔滤膜过滤除菌。 

实验步骤如下： 

(1)胰蛋白酶消化对数期细胞，96孔板每孔加入3000个细胞，每孔100μL细胞悬液，边缘孔加入 膜靠近内室那一面的未迁移细胞。 

(6)将Transwell小室转移到预先加入500μL 4％多聚甲醛的孔中，固定30min。 

(7)取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入500μL 0.1％结晶紫染液的孔中，染色20min，用清水冲洗数次。 

(8)拍照及检测：使用正置显微镜对Transwell小室拍照，33％醋酸抽提结晶紫10min，酶标仪在570nm处测定OD值，通过OD值可间接反映由小室内迁移到小室外面的细胞数。 

结果如图3(B)及图4(B)所示，10ng/mL PDGF-BB和10ng/mL TGF-β1刺激细胞24h后，细胞迁移率高于对照组，差异极显著(**P＜0.01)，Antrodin B(6、12、25μM)与PDGF-BB或TGF-β1共孵育组细胞迁移率低于诱导组(##P＜0.01)，结果表明一定剂量的Antrodin B可抑制PDGF-BB和TGF-β1诱导的细胞迁移。 

通过细胞小室迁移实验进一步验证了Antrodin B可抑制10ng/mL PDGF-BB及TGF-β1诱导CFSC-8B细胞迁移，结果如图5和图6所示，PDGF-BB及TGF-β1可促进CFSC-8B细胞由小室内迁移到小室外表面，与对照组相比差异极显著(**P＜0.01)，Antrodin B可极显著抑制PDGF-BB及TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞迁移(##P＜0.01)，且呈现剂量相关性。 

实施例4 Antrodin B对肝纤维化相关基因表达的影响 

按照Trizol和反转录试剂盒说明书操作，提取细胞总RNA和反转录出cDNA的第一链，按照荧光定量PCR检测试剂盒说明书操作检测肝纤维化相关基因表达量变化。 

荧光定量PCR反应体系：17uL体系 

反应程序：50℃，2min，95℃，10min，1cycle，95℃，15s，60℃，1min，40cycles。采用2-ΔΔCt法[60]对α-SMA、Collagen I(Col1)、Collagen III(Col3)和Fibronectin(Fn)基因的表达水平进行相对定量，计算各相关基因的表达倍数。肝纤维化相关基因引物序列如表1所示。 

表1 肝纤维化基因引物序列 

结果如图7及图8所示，10ng/mL PDGF-BB和10ng/mL TGF-β1作用CFSC-8B细胞24h可极显著诱导HSC活化标记α-SMA mRNA表达，上调细胞外基质Col1、Col3及Fn mRNA表达(**P＜0.01)；而Antrodin B(6、12、25μM)与细胞共孵育后可抑制PDGF-BB及TGF-β1诱导的α-SMA、Col1、Col3及Fn mRNA表达水平，差异极显著(##P＜0.01)，且具有剂量相关性，结果表明Antrodin B可抑制PDGF-BB及TGF-β1诱导的肝星状细胞活化及胞外基质的表达。 

实施例5 Antrodin B对PDGF-BB/MAPK信号通路的影响。 

操作步骤： 

(1)蛋白质样品的制备 

①药物作用至设定的时间后，将培养液吸掉，加入3mL PBS洗涤细胞。 无菌PBS。 

(2)将孔板放入培养箱培养24h，每孔加入100μL不同浓度梯度Antrodin B，设6个平行孔。 

(3)药物作用结束后，加入10μL MTT溶液并混匀。 

(4)孵育4h后吸弃培养液，加入150μL DMSO，待甲瓒溶解后检测570nm处的吸光值。 

(5)通过Graphpad软件计算IC50值。细胞存活率(％)＝(药物组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100％。 

如图2，Antrodin B在0-25μM作用浓度范围内对CFSC-8B细胞存活率无明显抑制作用，细胞存活率均在80％以上，但在高质量浓度的Antrodin B作用下，CFSC-8B存活率受到抑制，所以本实验选定Antrodin B在0-25μM浓度范围内与CFSC-8B细胞孵育48h进行后续研究通过Graphpad软件分析得出Antrodin B与CFSC-8B细胞共孵育48h的IC50值为59.99μM。 

实施例2 体外PDGF-BB刺激细胞增殖模型的建立及Antrodin B对PDGF-BB刺激CFSC-8B细胞增殖的影响。 

用胰蛋白酶消化对数生长期CFSC-8B细胞并接种于96孔板，每孔5000个细胞，100μL每孔，24h后用含有0.5％FBS的培养基同步化处理细胞24h，加入不同浓渡的PDGF-BB(5、10、20ng/mL)及Silybin(25μM)，设有空白组和对照组，每组设6个复孔，分别作用24h、36h、48h、72h后，每孔加入10μL WST-1，在培养箱中作用1h后，剧烈震荡1min，用酶标仪在450nm处检测吸光值，参考波长为690nm。细胞增殖率(％)＝(药物组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100％。结果如表1所示：与对照组比较，5-20ng/mL PDGF-BB在24h，36h，48h，72h均可诱导CFSC-8B细胞增殖，差异极显著(**P＜0.01)，且具有剂量及时间相关性，其中PDGF-BB在20ng/mL和10ng/mL作用浓度对细胞的促增殖作用效果相近，所以选择10ng/mL PDGF-BB作用48h为最佳细胞增殖模型。 

与不加外源性刺激因子的对照组比较，10ng/mL PDGF-BB作用48h可极显著促进CFSC-8B细胞增殖(**P＜0.01)，而6，12，25μM Antrodin B作用细胞后可极显著抑制PDGF-BB刺激的CFSC-8B细胞增殖(##P＜0.01)，抑制率与Antrodin B的浓度成正比，其中25μM Antrodin B的抑制率为69.08％，与Silybin(25μM)的抑制率(67.81％)相当。 

实施例3 Antrodin B对CFSC-8B细胞迁移的影响。 

细胞划痕损伤修复实验(Wound-healing assay)操作步骤如下： 

(1)用marker笔在6孔板背后划5条横线，方便拍照可找到相对应的视野。 

(2)细胞接种孔板：胰酶消化对数期细胞，细胞计数后稀释细胞悬液浓度至3×105个/mL,加入1mL细胞悬液，每孔加入1mL完全细胞培养基以使细胞均匀分布。 

(3)细胞同步化处理：0.5％FBS同步化处理细胞24h。 

(4)用黄枪头垂直于背后的横线向下滑动划痕。 

(5)沿壁慢慢加入PBS洗涤细咆，注意不要冲散单层贴壁细胞，加入0.5％FBS培养基配制的含有不同浓度Antrodin B的细胞培养基。 

(6)将细胞培养板放入培养箱，在不同时间点取样给细胞拍照，使用Image J软件分析细胞图片，采集数据并分析。 

细胞小室迁移实验(Transwell migration assay)操作步骤如下： 

(1)细胞同步化处理：0.5％FBS细胞培养基饥饿细胞24h。 

(2)制备单细胞悬液：胰酶消化细胞，加入含0.5％FBS的培养基吹打混匀，计数并稀释细胞悬液浓度至2×105个/mL。 

(3)接种细胞：向Transwell小室加入100μL细胞悬液，放入预先每孔加入500μL含有10％FBS细胞培养基的24孔板中。 

(4)将用0.5％FBS的培养基配制的含有TGF-β1或PDGF-BB及不同浓度Antrodin B的培养液加入Transwell小室，继续在培养箱常规培养24h。 

(5)取出Transwell小室，吸干上室液体，加入PBS洗一遍并吸干，用棉签擦去Transwell上室PVDF 

②将100μL含蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂的总蛋白抽提试剂加入细胞培养皿，冰上裂解30min后用干净的细胞刮棒将细胞刮起(注意操作一定要迅速)，并转移到EP管中。 

③于4℃下12000×g离心10min，取上清。 

(2)蛋白质含量的测定：操作过程见BCA蛋白浓度检测试剂盒。 

(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 

①电泳样品的制备：将1体积5×loading buffer和4体积的细胞裂解液混合作为蛋白电泳的空白对照样品，样品蛋白和5×loading buffer一起混匀煮沸3-5min使蛋白变性 

②配制胶，在分离胶的上面加入1mL ddH2O，约40min后加入浓缩胶并插好梳子。 

③待胶凝固后，开始电泳，80V，30min；100V，约2h 

(4)非变性凝胶电泳(Native-PAGE)：是指蛋白质在电泳中保持活性，具有天然的电荷及形状，在电泳中根据蛋白质的分子量及所带的电荷分开，其操作过程和SDS-PAGE类似，只是Native-PAGE蛋白样品无需和loading buffer一起煮沸，在凝胶的制备及跑胶缓冲液中 

无SDS、巯基乙醇等变性剂，在冰浴条件下跑电泳。 

(5)转膜：利用电转仪通过控制电流进行转膜进而用于免疫学分析。 

(6)封闭：5％脱脂奶粉室温孵育PVDF膜1h。 

(7)孵育一抗：TBST洗膜3次，每次5min。在封口袋里，将一抗和膜一起4℃孵育过夜。 

(8)洗涤：TBST洗膜3次，每次5min。 

(9)孵育二抗：在封口袋里，将二抗和膜一起室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。 

(10)显色：采用增强化学发光法对靶蛋白进行显色。 

(11)凝胶图象及数据分析：利用Image J软件计算靶蛋白相对值，将对照组的值设为1用以比较。 

结果如图9所示，对照组的信号转导途径处于低水平状态，PDGF-BB刺激CFSC-8B细胞MAPK途径下游信号分子包括磷酸化细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、磷酸化氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，p-JNK)及磷酸化丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，p-P38)蛋白表达水平较正常对照组增强(**P＜0.01).6μM、12μM Antrodin B可极显著抑制PDGF-BB刺激CFSC-8B细胞p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表达水平(##P＜0.01)。结果表明，肝纤维化中肝星状细胞MAPK信号通路中的ERK，JNK，P38信号通路都被激活，介导肝纤维化进程.因此Antrodin B可能通过干预PDGF-BB/MAPK信号通路从而具有抗肝纤维化活性。 

实施例6 Antrodin B对TGF-B1/Smads信号通路的影响。 

为了进一步研究Antrodin B对TGF-β1诱导HSC活化和ECM产生的作用及机制.本实验研究了TGF-β1下游信号分子Smad2/3介导的信号通路。CFSC-8B细胞与Antrodin B6.12μM)预处理1h，加入10ng/mL TGF-β1继续作用1h后，Western Blotting检测相关蛋白表达量，实验结果如图10(A)所示，与对照组比较，10ng/mL TGF-β1可极显著增强CFSC-8B细胞α-SMA及Coll蛋白表达水平(**P＜0.01)，利用TGF-β1信号通路抑制剂SB431542及Antrodin B(6、12μM)作用CFSC-8B细胞后可极显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA、Coll蛋白表达水平(##P＜0.01).实验结果表明Antrodin B可从蛋白水平抑制TGF-β1诱导的 

HSC活化和ECM沉积。如图10(B)所示，与对照组比较，10ng/mL TGF-β1诱导CFSC-8B细胞h，p-Smad2及p-Smad3蛋白表达水平增强，Antrodin B可下调TGF-β1诱导Smad2/3蛋白磷酸化水平，且具有剂量相关性。以上结果表明Antrodin B可能是通过负调控TGF-β1/Smad2/3信号通路从而抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化和ECM的沉积。 

综上所述，Antrodin B可抑制PDGF-BB刺激细胞增殖、PDGF-BB和TGF-β1诱导细胞迁移及肝星状细胞活化、胞外基质沉积，Antrodin B可下调PDGF-BB刺激p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表达，抑制TGF-β1诱导p-Smad2和p-Smad3蛋白表达，以上结果表明Antrodin B可通过负调控PDGF-BB/MAPK信号通路及TGF-β1/Smad2/3信号通路从而抑制PDGF-BB刺激的细胞增殖、PDGF-BB和TGF-β1诱导的细胞迁移、肝星状细胞活化及胞外基质沉积，具有较好的抗肝纤维化活性。 

Claims (2)

1.一种治疗和/或辅助治疗和/或预防肝纤维化和/或肝硬化的方法，其特征在于所述的方法使用了有效量的Antrodin B；所述的引起肝纤维化和/或肝硬化的疾病包括但不限于病毒性肝炎、酒精性肝病、血吸虫病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病、先天性酮代谢异常和胆石症 。

2.一种在体外/体内抑制肝星状细胞增殖、或抑制肝星状细胞DNA合成的方法，所述方法包括使用有效量的Antrodin B。