CN104546830B - 来自牛樟芝菌丝体的化合物及混合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的化合物及混合物的用途。所述用途包含美白皮肤、对抗皮肤老化、减少疤痕形成、诱发或增强肝脏再生、或在有需要的个体中治疗纤维化或与纤维化相关的疾病。所述化合物优选选自3‑异丁基‑4‑[4‑(3‑甲基‑2‑丁烯氧基)苯基]呋喃‑2,5‑二酮、3‑异丁基‑4‑[4‑(3‑甲基‑2‑丁烯氧基)苯基]‑1H‑吡咯‑2,5‑二酮、3‑异丁基‑4‑[4‑(3‑甲基‑2‑丁烯氧基)苯基]‑1H‑吡咯‑1‑醇‑2,5‑二酮、(3R*,4S*)‑1‑羟基‑3‑异丁基‑4‑[4‑(3‑甲基‑2‑丁烯氧基)苯基]吡咯烷‑2,5‑二酮、或(3R*,4R*)‑1‑羟基‑3‑异丁基‑4‑[4‑(3‑甲基‑2‑丁烯氧基)苯基]吡咯烷‑2,5‑二酮。

Description

来自牛樟芝菌丝体的化合物及混合物的用途
【技术领域】
本发明涉及来自牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌丝体的化合物及混合物的用途。
【背景技术】
牛樟芝(Antrodia cinnamomea T.T.Chang&W.N.Chou，为Antrodia camphorate在分类上的同义词)(Wu等人,1997,Antrodia camphorata(“niu-chang-chih”),newcombination of a medicinal fungus in Taiwan.Bot.Bull.Acad.Sin.,38:273-275)子实体在台湾是一种高价值的民间医药。它被用作解毒剂和用于治疗腹泻、腹痛、高血压、皮肤痒及肝癌。一些牛樟芝子实体中的生物活性成分已被分离，且已被辨识为一系列的多醣体、类固醇、三萜类(triterpenoids)与倍半萜内酯(sesquiterpene lactone)(Lin等人,2007,Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production insubmerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media.BioresourceTechnology,98:2511-2517)。先前的研究已从牛樟芝菌丝体分离出五个新的顺丁烯二酸与丁烯二酸衍生物(化合物1-5)(Nakamura等人,2004,Five new maleic and succinic acidderivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxiceffects on LLC tumor cell line.J Nat Prod,67:46-48)。
美国专利第7109232号公开了五个来自牛樟芝菌丝体的化合物1-5，以及其用途(如保肝、抗炎或抗肿瘤的活性〕与制备方法。上述的化合物1-5在另一篇文献中进一步被称为Antrodin A-E(Phuong do T等人,2009,inhibitory effects of antrodins A-E fromAntrodia cinnamomea and their metabolites on hepatitis C virusprotease.Phytother Res.,Apr；23(4):582-4)。由前案中可发现这五个来自牛樟芝菌丝体的化合物1-5不但在结构上相似，亦具有相似的活性。
【发明内容】
除非另外特别加以定义，于本说明书中所用的名词将具有本领域技术人员可了解的普通且常见的含意。如整个申请案中所使用，下列的术语具有下面所述的含意：
术语“个体”意指动物。优选地，所述动物为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、人、狗、猫等等。在一个优选实施方案中，所述个体为人类。
本发明提供一种组合物在制备用于美白皮肤或对抗皮肤老化的医药品或化妆品中的用途，其中所述组合物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述组合物用于制备外用化妆品或皮肤制剂。在一优选实施方案中，所述组合物抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。在另一优选实施方案中，所述皮肤老化是由氧化性应激造成的，优选地，所述氧化性应激是由紫外线照射引发的。
本发明亦提供一种混合物在制备用于美白皮肤或对抗皮肤老化的医药品或化妆品中的用途，其中所述混合物包含牛樟芝菌丝体的水萃物或有机溶剂萃取物，其中所述水萃物或有机溶剂萃取物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述混合物用于制备外用化妆品或皮肤制剂。在一优选实施方案中，所述混合物抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。在另一优选实施方案中，所述皮肤老化是由氧化性应激造成的，优选地，所述氧化性应激是由紫外线照射引发的。
优选地，所述牛樟芝菌丝体是由深层液态发酵制备的。优选地，所述有机溶剂包括但不限于醇类(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯类(如乙酸乙酰酯)、烷烃(如己烷)及卤代烷烃(如CH3Cl、C2H2Cl2)。优选的有机溶剂为乙醇或对人类不会造成任何副作用的醇类溶剂。
本发明还提供一种组合物在制备用于减少疤痕形成、治疗纤维化、或治疗与纤维化相关的疾病的医药品中的用途，其中所述组合物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述用于减少疤痕形成的医药品适用于具有伤口的个体，所述伤口选自由以下所组成的群组：裂伤、烧伤、穿刺伤、压疮、褥疮、外伤、咬伤、瘘管、溃疡、感染引起的病变、牙周伤口、根管治疗伤口、手术伤口、切口、组织纤维化、及因美容外科手术导致的伤口。
优选地，所述组合物可下调促纤维化基因(包括胶原蛋白I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表达量。
优选地，所述纤维化或与纤维化相关的疾病为：肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、心肌纤维化、血管纤维化、结疤、肝硬化、肝坏死、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、纤维肉瘤、硬皮病或它们的组合。
本发明还提供一种混合物在制备用于减少疤痕形成、治疗纤维化、或治疗与纤维化相关的疾病的医药品中的用途，其中所述混合物包含牛樟芝菌丝体的水萃物或有机溶剂萃取物，其中所述水萃物或有机溶剂萃取物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述用于减少疤痕形成的医药品适用于具有伤口的个体，所述伤口选自由以下所组成的群组：裂伤、烧伤、穿刺伤、压疮、褥疮、外伤、咬伤、瘘管、溃疡、感染引起的病变、牙周伤口、根管治疗伤口、手术伤口、切口、组织纤维化、及因美容外科手术导致的伤口。
优选地，所述混合物可下调促纤维化基因(包括胶原蛋白I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表达量。
优选地，所述纤维化或与纤维化相关的疾病为：肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、皮肤纤维化、心肌纤维化、血管纤维化、结疤、肝硬化、肝坏死、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、纤维肉瘤、硬皮病或它们的组合。
优选地，所述牛樟芝菌丝体是由深层液态发酵制备的。优选地，所述有机溶剂包括但不限于醇类(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯类(如乙酸乙酰 酯)、烷烃(如己烷)及卤代烷烃(如CH3Cl、C2H2Cl2)。优选的有机溶剂为乙醇或对人类不会造成任何副作用的醇类溶剂。
本发明还提供一种组合物在制备用于诱发或增强肝脏再生的医药品中的用途，其中所述组合物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述用于诱发或增强肝脏再生的医药品适用于经历肝切除术的个体。在另一优选实施方案中，所述用于诱发或增强肝脏再生的医药品适用于患有肝纤维化或肝硬化的个体。
本发明还提供一种混合物在制备用于诱发或增强肝脏再生的医药品中的用途，其中所述混合物包含牛樟芝菌丝体的水萃物或有机溶剂萃取物，其中所述水萃物或有机溶剂萃取物包含具有下式的化合物：
或其互变异构形式、其立体异构体、其多晶型物、其盐类、或其溶剂合物，
其中
X为N或O；
R1为H、羟基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；
R2为H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
R3为不存在、H、羟基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；
表示单键或双键；
但若X为O，则R3为不存在；
若表示单键，则所述化合物具有下式：
优选地，所述化合物为3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
优选地，所述用于诱发或增强肝脏再生的医药品适用于经历肝切除术的个体。在另一优选实施方案中，所述用于诱发或增强肝脏再生的医药品适用于患有肝纤维化或肝硬化的个体。
优选地，所述牛樟芝菌丝体是由深层液态发酵制备的。优选地，所述有机溶剂包括但不限于醇类(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯类(如乙酸乙酰 酯)、烷烃(如己烷)及卤代烷烃(如CH3Cl、C2H2Cl2)。优选的有机溶剂为乙醇或对人类不会造成任何副作用的醇类溶剂。
本发明进一步提供一种皮肤美白配方，其包含牛樟芝发酵菌丝体的水萃取物或有机溶剂萃取物作为美白的活性成分，其中所述萃取物包含至少一种选自由以下所组成的群组的化合物：
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，
其中所述
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮与
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮的混合物的浓度等于或大于3μM。
优选地，所述牛樟芝发酵菌丝体是由深层液态发酵制备的。
优选地，所述配方为外用化妆品或皮肤制剂。
优选地，所述配方抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。
本发明进一步提供对抗皮肤老化的配方，其包含牛樟芝发酵菌丝体的水萃取物或有机溶剂萃取物作为对抗皮肤老化的活性成分，其中所述萃取物包含至少一种选自由以下所组成的群组的化合物：
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，
其中所述
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮与
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮的混合物的浓度等于或大于3μM。
优选地，所述牛樟芝发酵菌丝体是由深层液态发酵制备的。
优选地，所述配方为外用化妆品或皮肤制剂。
在一实施方案中，所述皮肤老化是由氧化性应激造成的。在一实施方案中，所述氧化性应激由紫外线照射引发的。
本发明的组合物或混合物可为固体、溶液、乳液、分散剂、微胶粒、微脂体等形式，其中所述组合物或混合物包含与适用于肠内或肠胃外应用的有机或无机的载剂或赋型剂混合的一个或多个作为活性成分的本发明化合物。例如，可将活性成分与通常无毒且在药学上可接受的用于片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液、乳液、悬浮液和任何其它适合使用的形式的载体组合。可以使用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、淀粉糊，三硅酸盐、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中等链长甘油三酯、葡聚醣，和其它适用于制造固体、半固体或液体形式制剂的载体。此外，亦可使用辅剂、稳定剂、增稠剂和着色剂和香料。
本发明的组合物或混合物可为适合口服使用的形式，例如，作为锭剂、片剂、糖锭、水性或油性悬浮液、散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊，或糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物或混合物，可以根据制造医药品领域中已知的任何方法来制备，而该组合物或混合物可以含有一种或多种选自甜味剂(如蔗糖、乳糖或糖精)、矫味剂(如薄荷、冬青油或樱桃油)、着色剂和防腐剂的试剂，以提供药学上优雅和可口的制剂。
含有活性成分与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物的锭剂，也可以通过已知的方法来制造。所用的赋形剂可以是，例如，(1)惰性稀释剂，如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)粒化剂和崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸；(3)结合剂，如黄蓍胶、玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，和(4)润滑剂，如硬脂酸镁、硬 脂酸或滑石。锭剂可以不包衣，或者可以用已知的技术涂布，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在一个较长的时间内持续的作用。例如，也可以采用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可以由美国专利第4256108、4160452和4265874号中所描述的技术涂覆，以形成供控释的渗透压治疗锭剂。
在某些情况下，口服的活性成分可呈硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合。它们也可呈软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
本发明的组合物或混合物亦可为无菌注射悬浮液。此悬浮液可根据已知的方法，使用适合的散布剂、浸润剂和悬浮剂来配制。无菌注射液也可以为以无毒、胃肠道可接受的稀释剂或溶剂来配制的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。无菌、不挥发的油剂常被用作为溶剂或悬浮基质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油剂，包含合成的单酸甘油脂、双酸甘油脂、脂肪酸(包括油酸)、天然植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉花籽油等或合成脂质媒液(如油酸乙酯)等等。如有需要可加入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等等。
可能适用于本发明的组合物或混合物也可以以直肠栓剂的形式给予。这些合成物可藉混合药物与合适的非刺激性赋形剂(如可可脂、聚乙二醇的合成甘油酯)来制备，其在常温下成固态，但是于肠道内会液化及/或溶解以释放药物。
在习知的方法中，本发明的组合物或混合物亦可包含通常在化妆品和皮肤病学领域中的辅剂，如亲水性或亲脂性胶凝剂、保湿剂(如甘油和山梨醇)、脂肪相增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、电解质、溶剂、芳香剂、填充剂、遮蔽剂、颜料、气味吸收剂、着色材料及金属螯合剂。上述各种辅剂的用量是那些所考虑的领域的常规使用量，例如为组合物总重量的0.01％至20％。这些辅剂根据它们的性质可被引入到亲脂相或到亲水相。这些辅剂及它们的浓度，必须使得它们不会不利地影响本发明组合物或混合物的美容及/或皮肤病学性质。
示例性的辅剂有亲水性胶凝剂，如羧乙烯聚合物(carbomer)、丙烯酸类共聚物(如丙烯酸酯/丙烯酸烷酯共聚物或丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯酰胺、多醣、天然树胶和粘土，亦可考虑亲脂性胶凝剂，如改性粘土(如膨润土)、脂肪酸的金属盐、疏水性二氧化硅或硅树胶。
【附图简要说明】
图1显示与肝损害相关的血清参数，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)浓度。与对照组比较，在每日喂食160-320mg/kg牛樟芝的动物中所有参数均显示出显著降低。这意味着每日喂食大于160mg/kg的牛樟芝可提供显著的肝细胞保护作用。ACM 80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝。
图2显示羟脯氨酸浓度及显微镜上天狼星红阳性区域在对照组及治疗组肝脏中的差异比较。此结果显示在每日喂食160-320mg/kg牛樟芝的动物中肝硬化有明显改善。ACM80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝。
图3显示在经牛樟芝治疗后，纤维化前期基因的表达量降低。ACM 80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝。
图4A及4B显示在经牛樟芝治疗后氧化性应激降低。图4A显示抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶)的基因表达量被显著地上调，尤其是在每日喂食320mg/kg牛樟芝的动物中。图4B显示NADPH氧化酶的基因表达量被下调。ACM80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝。
图5显示肝硬化动物的寿命。ACM 80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝；wk：周。
图6显示在经牛樟芝治疗后恢复肝再生能力。ACM 80：每日喂食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日喂食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日喂食320mg/kg牛樟芝。
图7显示与经DMSO处理的对照组细胞比较，在经各个化合物及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的细胞中其肝细胞损伤参数有显著降低。
图8A及8B显示与经H2O2处理的对照组细胞比较，在经各个化合物(即使为低浓度)及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的细胞中，其以谷胱甘肽浓度及谷胱甘肽:氧化型谷胱甘肽(GSH:GSSG)比率作为氧化性应激标记所呈现的氧化还原状态有显著的改善。
图9显示化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物的处理对于初代肝脏星状细胞中的促纤维化基因(包括α-SMA及TIMP-1)的表达量的影响。
图10显示化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物的处理对于初代肝脏星状细胞中的促纤维化基因(包括Collagen-1及TGF-β)的表达量的影响。
图11显示与经转化生长因子β1(TGFb1)处理过的无限增殖肝脏星状细胞比较，化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对于促纤维化基因(包括α-SMA及TIMP-1)表达的防治作用。
图12显示与经TGFb1处理过的无限增殖肝脏星状细胞比较，化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对于促纤维化基因(包括Collagen-1及TGF-β)表达的防治作用。
图13显示分别以溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)分析试验及细胞死亡检测分析试验来呈现肝脏星状细胞增殖及细胞凋亡的差异比较以评估高浓度Hepasim的抗纤维化作用。
图14显示与对照组比较，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)浓度的肝损害相关血清参数在每日喂食320mg/kg的牛樟芝及2种化合物的动物中均显示显著降低。
图15显示羟脯氨酸浓度及显微镜上天狼星红阳性区域在对照组及治疗组肝脏中的差异比较，以评估化合物B及C的抗纤维化作用。
图16显示在喂食牛樟芝及化合物B及C的动物中，纤维化前期基因(包括胶原蛋白I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表达量显著降低。
图17A及17B显示在喂食牛樟芝及化合物B及C的动物中，抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶)的基因表达量被显著地上调，且NADPH氧化酶(为产生活性氧物质(ROS)的主要酵素)的基因表达量被显著地下调。
图18显示在以化合物B及C治疗的肝硬化动物中，其以谷胱甘肽浓度及谷胱甘肽:氧化型谷胱甘肽(GSH:GSSG)比率作为氧化性应激标记所呈现的氧化还原状态有显著的改善。
图19显示与曝露于紫外线的对照组细胞比较，在经各个化合物(即使为低浓度)及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的细胞中，其以谷胱甘肽浓度及GSH:GSSG比率作为氧化性应激标记所呈现的氧化还原状态有显著的改善。
图20显示在经化合物B及C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的初代肝脏星状细胞中，所有4种促纤维化基因的表达量均显著地被下调。
【具体实施方式】
本发明可能以不同的形式实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同方面及特点中的代表。
实施例1：用于肝纤维化的牛樟芝–对于肝硬化动物以3种不同剂量的牛樟芝施以为期6周的治疗
方法
肝硬化动物模型
自国立台湾大学动物中心取得7周龄的雄性Wistar大鼠(150至180公克)。于标准条件下饲养大鼠，所有实验均在符合国立台湾大学实验动物照护及使用委员会所制定的“实验动物照护及使用规范”下执行。每日给予大鼠二乙基亚硝胺(DEN)溶液(Sigma,StLouis,MO)作为为期9周的主要饮用水，之后换为为期2周的常用水。在第一周以100ppm(容量/容量)做为开始。每周测量一次动物的平均体重，且其饮用水中的二乙基亚硝胺浓度按当周相对于第一周的体重比调整。
萃取物的制备
以CHCl3回流萃取来自台湾善笙生物科技股份有限公司的粉状牛樟芝菌丝体(ACM)。以无菌蒸馏水将精细研磨的牛樟芝粉制备成3种不同剂量(80、160及320mg/kg)并于第5到第11周间每日经由胃管喂食大鼠。于第11周时处死部分动物并将其肝脏取为样本以做为病理检验及基因表达分析试验之用。
肝脏再生的计算
在停止施予二乙基亚硝胺溶液2周后(第11周)，以90mg/kg的氯胺酮(ketamine)及5mg/kg的甲苯噻嗪(xylazine)麻醉部分动物。在中线剖腹手术后，将中叶及左侧叶切下以完成70％部分肝切除术(PHx)。在手术前后均立刻进行核磁共振影像扫描，并于手术后第7天再次扫描。在每一张1毫米厚的核磁共振切片中以电子绘图方式画出肝脏的边界并自动量测肝的“切面面积”(标准软件，Advantage Workstation；GE Healthcare,Waukesha,WI)。依据卡瓦列里(Cavalieri)的方法，将所有测量出的肝截面相加会得出总肝体积(表面积[mm2] ×切片厚度[mm])。在最后一次的核磁共振影像扫描后，即处死这些动物且将其肝脏取样以用于溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)染色。
每一只动物的肝脏再生百分比以下式计算：
肝脏再生百分比＝((L7-L0)x 100)/(L-1-L0)
其中L7为第7天的肝体积。L0为部分肝切除术后的实时肝体积且L-1为部分肝切除术前的肝体积。
血清的生化分析
自每一只小鼠的后眼窝脉管丛收集1毫升的血液样本并立刻于4℃以1300xg离心，将血浆保存于-20℃以供肝功能测试使用。使用市售的酵素型试剂组及比色分析仪(Dri-Chem 3000,Fuji Photo Film Co,Tokyo,Japan)来测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)的浓度。
测量肝脏中的羟脯氨酸含量
将羟脯氨酸的浓度定量以测定无肿瘤肝样本中的肝胶原蛋白含量。简而言之，用研杵将肝样本(介于15到25毫克之间)于含有20毫升6N盐酸的微量离心管内小心研磨。接着加入额外的6N盐酸以制备总体积为30mL/mg的组织并藉此冲下残留于研杵上的碎块组织。于120℃将盐酸内的研磨组织水解16小时。在冰上短暂降温之后以8000g离心10分钟，将上清液移至新管内；以水补足经蒸发而失去的体积。加入等量的6N氢氧化钠并混合，使用石蕊试纸将该溶液的酸碱值调整至pH 4–9。将40微升的中和样本溶液移至96孔酶联免疫吸附试验(ELISA)盘中并于每一孔中以含有5mL 7％氯胺T(Sigma,St Louis,MO,USA)及20mL醋酸/柠檬酸缓冲液(57g三水合醋酸钠、37.5g二水合柠檬酸三钠、5.5g柠檬酸、385mL异丙醇，并溶于水中以达到1升的最终体积)的溶液使其氧化。之后加入150mL的艾利希溶液(Ehrlich’s solution)。将2g的对二甲氨基苯甲醛(pdimethylamino-benzaldehyde)(Sigma)溶于3mL的60％HClO4(Merck,Darmstadt,Germany)再与9mL的异丙醇混合，以制备艾利希溶液。将最终的混合物于60℃培养35分钟，然后于室温下培养10分钟，用560nm的波长来测定其吸光度。用相同方法来处理含100、80、60、40、20及0mg/mL 4-羟基-L-脯氨酸(Sigma)的标准溶液。其标准曲线在此范围内为线性(r＝0.98)。肝羟脯氨酸浓度值是以每克湿组织中含多少毫克来呈现。
免疫组织化学及组织染色
将肝样本以福尔马林固定并嵌入于石蜡中以供天狼星红(Sirius red)染色使用。将肝切片于苦味酸饱和水溶液(Wako,Osaka,Japan)中以0.1％(重量/体积比)天狼星红(Sigma,St Louis,MO)染色1小时以侦测肝纤维化。在染色之后，以酸化水[0.5％(重量/重量)冰醋酸于水中]冲洗玻片2次，再用100％乙醇将玻片脱水3次。在二甲苯中清洗玻片，封于树脂介质之中，再于光学显微镜下观察。用数字相机系统HC-2500及图像分析软件Image-Pro Plus测量天狼星红阳性区域。在如前所述的70％肝切除术后第7天进行对肝脏的BrdU免疫染色，以侦测部分切除术后的肝再生能力。将切片浸于抗BrdU小鼠单克隆抗体1:100(MO744殖株BU20A；DAKO Sweden AB)60分钟，之后浸于二次抗体，即生物素标记抗小鼠多克隆兔抗体1:400(E0464；DAKO Sweden AB)25分钟，以进行BrdU染色。之后将切片浸于ABCVectastain标准试剂盒(PK 6100；Vector Laboratories,Burlingame,CA)30分钟并与DABImmPACT(Vector Laboratories)受质作用5分钟。将切片以苏木精(Mayers Hematoxylin；Histolab,Sweden)对比染色。用染色阳性的肝细胞核对肝细胞总数的比率来计算BrdU标记指数。于光学显微镜下(400倍)计算切片中15个随机计数区域的累计平均值。
胶原蛋白表达及氧化性应激的实时定量反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)分析
以约0.5×0.5cm的面积测量大鼠肝组织样本。用一电动研杵在1mL的TRIzol缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中将每块组织均质化，再与0.5mL的氯仿/异戊醇(24：1)混合，于4℃以12,000xg离心10分钟。将上清液移至一干净的管内，加入异丙醇，混合均匀并于-80℃储存一整夜。将反应混合物于4℃以12,000xg离心30分钟以产出一RNA粗沉淀物，用70％乙醇清洗沉淀物并使其在空气中晾干。使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波长下的吸光值来测量全部RNA的浓度。以市售的高容量RNA到cDNA套组试剂盒(HighCapacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)来进行反转录反应。按照制造商的使用说明-于37℃反应60分钟，于95℃反应5分钟，并维持在4℃，将每20μl反应中的2μg总RNA制成cDNA。将所得到的cDNA调成100ng/μl的最终浓度并构成一基质以供之后实验所需。用StepOnePlus实时聚合 酶连锁反应系统(Applied Biosystems,USA)来进行实时聚合酶连锁反应以扩大并侦测基因表达。在含有2μl的模板DNA、5μl的2X TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl的含探针、前置及反置引子正向及反向引物的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反应混合物中分析样本，其中并使用以下所述的定量聚合酶连锁反应标靶：(a)大鼠α-SMA，试剂编号Rn01759928_g1、；(b)大鼠TIMP-1，试剂编号Rn00587558_m1；、(c)大鼠TGF-β，试剂编号Rn00572010_m1、；(d)大鼠胶原蛋白Ι，试剂编号Rn 01463838_m1、；(e)大鼠CuZnSOD，试剂编号Rn00566938_m1、；(f)大鼠MnSOD，试剂编号Rn00690587_g1、；(g)大鼠过氧化氢酶，试剂编号Rn00560930_m1、；(h)大鼠谷胱甘肽过氧化物酶，试剂编号Rn00577994_g1、；(i)大鼠NADPH氧化酶，试剂编号Rn00585380_m1及(j)大鼠GAPDH，试剂编号Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH将所有结果标准化以控制mRNA浓度的变异。按照制造商的使用说明，用Ct比较法(ΔΔCt)进行相对定量。所用的循环条件如下：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，之后以每循环含95℃ 15秒及60℃ 1分钟进行40个循环。
结果
肝损害参数的改善
在实验末期，与对照组比较，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)浓度的肝损害相关血清参数在每日喂食160-320mg/kg牛樟芝的动物中均显示显著的降低(图1)。这意味着每日喂食大于160mg/kg的牛樟芝可提供显著的肝细胞保护作用。
肝纤维化的改善
比较羟脯氨酸浓度及显微镜上天狼星红阳性区域在对照组及治疗组肝脏中的差异以评估牛樟芝的抗纤维化作用。此结果显示在每日喂食160-320mg/kg牛樟芝的动物中肝硬化有明显改善(图2)。
纤维化前期基因表达量的降低
在经牛樟芝治疗后，纤维化前期基因(包括α-SMA、TIMP及TGF-β)的表达量在每日喂食160-320mg/kg牛樟芝的动物中显著降低，并在每日320mg/kg组中观察到显著下调的胶原蛋白Ι基因表达量(图3)。.
氧化性应激的降低
在经牛樟芝治疗后，抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶)的基因表达量被显著地上调，尤其是在每日喂食320mg/kg牛樟芝的动物中。所有这些基因的表达量均显著地提高，且NADPH氧化酶(产生活性氧物质(ROS)的主要酵素)的基因表达量被下调。这意味着每日以320mg/kg的牛樟芝治疗可显著降低氧化性应激及伴随的肝纤维化(图4A及4B)。
延长肝硬化动物的寿命
在诱发肝硬化的过程中，监测部分动物的寿命。经过12周后，所有对照组动物均死亡，然而，经每日喂食80、160、320mg/kg牛樟芝的动物其生存率分别为33％、50％及90％(图5)。注意到经牛樟芝治疗后肝硬化动物的寿命延长，且每日160-320mg/kg的牛樟芝可显著地延长肝硬化动物的生存。
肝切除术后肝再生能力的恢复
在70％肝切除术后，对照组、每日80、160及320mg/kg牛樟芝组在手术后第7天的生存率分别为12.5％、25％、75％及87.5％。对照组的进食量仅为手术前的55％。然而，治疗组的动物在术后第7天并无食欲丧失的迹象。以肝的大小及BrdU阳性面积来呈现肝再生状况，在每日接受160-320mg/kg牛樟芝治疗的动物中，其BrdU标记指数及肝再生百分比均显示出显著增加(图6)。
实施例2：用于肝纤维化的Hepasim-Hepasim的细胞研究
本实验是被设计来验证牛樟芝的抗纤维化作用来自Hepasim的假设。
方法
细胞
AML12细胞(小鼠肝细胞)取自于生物资源保存及研究中心(BCRC)并于含有1％抗霉抗生素(Gibco by Invitrogen)及15％胎牛血清(Gibco by Invitrogen)的DMEM培养液(Dulbecco’s modified Eagle media,Gibco by Invitrogen)中培养。人类肝星状细胞(HSC)细胞株取自于美国的ScienCell研究实验室并于完全培养液，即含2％胎牛血清(ScienCell研究实验室)、1％星状细胞生长补充液(ScienCell研究实验室)及1％青霉素/链霉素溶液(ScienCell研究实验室)的星状细胞培养液(ScienCell研究实验室)中培养。TGF-β1可活化肝星状细胞是习知的，以该肝星状细胞做为阳性对照组，将肝星状细胞种于培养盘中24小时，之后将细胞换为含10ng TGF-β1(PeproTech,USA)的培养液。经腹膜内注射氯胺酮及甲苯噻嗪以麻醉C57BL/6小鼠来进行初代肝星状细胞的分离。将肝上下腔静脉扎起并以导管插入肝下下腔静脉。以含0.5mM含EGTA的无钙盐溶液原位(in situ)灌注小鼠肝脏(每分钟8毫升，于37℃5分钟)，再分别以二步骤含0.05％胶原蛋白酶D及链霉蛋白酶的缓冲液(Roche Molecular Biochemicals,ndianapolis,Ind)灌注5及10分钟。于培养皿上将摘下的肝脏轻轻地切碎再于含有蛋白酶的缓冲液中于37℃另外培养25分钟。之后，用70μm的细胞过滤器过滤肝脏。将细胞离心并收集，再用8.2％Nycodenz(Accurate Chemicaland Scientific Corp.)分离。于37℃含5％二氧化碳的湿润大气下培养该细胞株。
Hepasim化合物的制备
Hepasim化合物，亦即下述实验中的化合物A至E，等同于美国专利号7109232中所公开的化合物1至5，其亦被称作Antrodin A-E。
化合物A：3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮
化合物B：3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮
化合物C：3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮
化合物D：(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮
化合物E：(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮
用以制备此五种化合物的方法与美国专利号7109232中所公开的方法相同。
应注意到在下列实例中，“化合物D”是指化合物D与化合物E的消旋混合物，且其中化合物D与化合物E的比率优选为1:1至2:1。在一实施方案中，所述化合物D与化合物E的比率为约1.62:1。
Hepasim化合物对于以H2O2在AML12肝细胞株中所诱发的肝损害的作用
为了测定这些化合物对于H2O2(一种习知的细胞损伤诱导物)作用后的肝细胞的保肝作用，以测量AML12细胞株所分泌的上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)的浓度来检验其对肝细胞损害的作用。将细胞于含有不同浓度(3及10μM)Hepasim化合物(A、B、C、及D)的1％胎牛血清中培养72小时再以H2O2处理2小时。用Infinity ALT分析试剂组(Thermo Scientific)来测量上清液中的ALT浓度。
Hepasim化合物处理后的细胞活性氧物质分析试验
使用市售试剂盒(#K264-100,BioVision)来测量谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。从这些数据中算出GSH/GSSG的比率。将制造商的使用指引做若干修改以进行该分析。简言之，立刻将细胞沉淀物(约10毫克)均质化，从每一样本中取60μl并移至一含过氯酸且事先降温过的管内，以13,000xg离心2分钟，收集上清液并储存在-80℃直到被分析。如制造商所述以进行分析。简言之，将低温的3N KOH加入至每一样本并混合，以13,000xg离心10分钟。对每一样本，使用10微升样本量及适当缓冲液，并用90μl的分析缓冲液来侦测GSH，混合10μl的谷胱甘肽还原酶以侦测总谷胱甘肽，以10μl的GSH淬灭剂来侦测GSSG，于室温下放置40分钟，于340/420nm波长下读取每一样本的吸光值3分钟。以DC蛋白质浓度分析试验(Bio-Rad)来决定每一样本的蛋白质浓度。每一样本的信号以该样本的蛋白质含量标准化。
细胞的RNA萃取及定量反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)
收取呈指数级增长的细胞并将其种于一6孔微量盘中。将每孔中的细胞收集起来并移至装有1mL TRIzol缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的微量离心管中，然后与0.5mL的氯仿/异戊醇(24：1)混合，将微量离心管于4℃以12,000xg离心10分钟。将上清液移至干净的管中，加入异丙醇，混合均匀并储存于-80℃一整夜。将反应混合物于4℃以12,000xg离心30分钟以产出RNA粗沉淀物，用70％乙醇清洗沉淀物并使其在空气中晾干。用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波长下的吸光值来测量总RNA的浓度。
以市售的高容量RNA到cDNA试剂盒(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(AppliedBiosystems,USA)来进行反转录反应。按照制造商的使用说明-于37℃反应60分钟，于95℃反应5分钟，并维持在4℃，将每20μl反应中的2μg总RNA制成cDNA。将所得到的cDNA调成100ng/μl的最终浓度并构成基质以供之后实验所需。
用StepOnePlus实时聚合酶连锁反应系统(Applied Biosystems,USA)来进行实时聚合酶连锁反应以扩大并侦测基因表达。在含有2μl的模板DNA、5μl的2X TaqMan PCRMaster Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City, CA,USA)、0.5μl的含探针、正向及反向引物的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反应混合物中分析样本，其中并使用以下所述的定量聚合酶连锁反应标靶：(a)α-SMA，试剂编号Rn01759928_g1；(b)TIMP-1，试剂编号Rn00587558_m1；(c)TGF-β1，试剂编号Rn00572010_m1；(d)胶原蛋白Ι，试剂编号Rn 01463838_m1；(e)GAPDH，试剂编号Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH将所有结果标准化以控制mRNA浓度的变异。按照制造商的使用说明，用Ct比较法(ΔΔCt)进行相对定量。所用的循环条件如下：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，之后以每循环含95℃ 15秒及60℃ 1分钟进行40个循环。
Hepasim化合物对初代肝星状细胞内促纤维化基因表达的防治作用
在不使用任何促纤维化试剂的情况下，于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中将小鼠初代肝星状细胞培养7天以达全面活化。在自然情况下细胞将会在7天之内被自发性地活化至纤维化。使细胞与两种不同浓度的Hepasim化合物接触72小时。之后萃取其RNA并接着以实时定量PCR测量Collagen-1、TGF-β1、α-SMA及TIMP-1的mRNA。
Hepasim化合物对于经重组TGF-β处理过的无限增殖肝星状细胞的促纤维化基因表达的抑制作用
为了检验Hepasim化合物对于经TGF-β处理过的肝星状细胞的额外抗纤维化作用，将未活化的肝星状细胞以每孔5x105个细胞的数量种于6孔培养盘中，并以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养7天。将培养液换成含1％胎牛血清及各种不同浓度的Hepasim化合物且不含任何促纤维化试剂的DMEM培养液额外培养72小时，接着以促纤维化试剂TGF-β(3ng/ml)额外处理48小时。用定量实时聚合酶连锁反应来测量Collagen-1、TGF-β、α-SMA及TIMP-1的mRNA量。
以BrdU分析试验及WST-1分析试验来分析细胞增殖
细胞增殖ELISA及BrdU试剂盒被设计来定量细胞增殖，基于测量增殖细胞于合成DNA过程中对BrdU的吸收。简言之，将细胞以每孔10,000个细胞种于含有100μl培养液的96孔盘(Nunc,Denmark)中并培养24小时以使细胞附着，之后以3种不同浓度(8μM、24μM及80μM)的化合物A、B、C或D与其作用24小时、48小时及72小时，并将该培养盘培养于37℃。在培养过后，以每 孔10μl的BrdU(Roche Diagnostic Inc.)标记培养液并将细胞于37℃继续培养16小时。用离心机以200xg离心10分钟以去除标记的培养液并将其吹干。用200μl的FixDenat溶液固定细胞并于室温下培养30分钟。将FixDenat溶液移除，加入100μl的抗BrdU-POD并于室温下培养90分钟。培养结束后，以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗微孔盘3次并加入100μl的基质溶液培养30分钟。加入终止溶液(25μl的1M H2SO4)并用ELISA分析仪在450nm波长下测量该样本的吸光值。
细胞凋亡
用一侦测细胞死亡的ELISA试剂盒(Roche Diagnostic Inc.)以三明治免疫分析试验系统来侦测细胞凋亡。使用基于三明治酵素免疫分析试验的方法，Roche细胞死亡侦测ELISA试剂盒可在质与量上侦测到给定样本中被切开的DNA/组织蛋白复合物(核小体)的量。将细胞(每孔10,000个细胞)种于含100μl培养液的96孔盘(Nunc,Denmark)中并培养24小时以使细胞附着，之后以3种不同浓度(8μM、24μM及80μM)的化合物A、B、C或D与其作用24小时、48小时及72小时，并将该培养盘培养于37℃。培养后，将该96孔盘以200xg离心10分钟并去除抛弃上清液，接着用多道移液管(multipipetman)于每孔加入200μl的裂解缓冲液并于室温下培养30分钟，以200xg离心力将微孔盘中的溶解产物离心10分钟。在离心过后，将20μl的上清液移至涂有链霉亲合素(streptavidin)的微孔盘中，再将80μl的免疫试剂加入至每一孔中。将微孔盘以粘合箔(adhesive foil)盖住并培养于一振荡器上于室温下轻轻摇动2小时。培养过后，以250-300μl培养缓冲液清洗微孔盘3次并加入100μl ABTS溶液培养30分钟或直到颜色呈现足以进行光度测量的程度。将ABTS终止溶液加入并用ELISA分析仪在450nm波长下测量该样本的吸光值，参考波长为490nm。
结果
肝损害参数的改善
与DMSO处理过的对照组细胞比较，在经各个化合物处理过的细胞中，其有关肝损害的主要参数丙氨酸转氨酶(ALT)有显著的下降。这意味着不论是低(3μM)或高(10μM)浓度的化合物A至D都有显著的肝细胞保护作用，且发现H2O2引起的肝损害的改善与所有4种化合物具有剂量依赖性关系(图7)。
Hepasim化合物处理后的细胞活性氧物质分析试验
与经H2O2处理的对照组细胞比较，在经各个化合物(即使为低浓度)处理过的细胞中，其以谷胱甘肽浓度及作为氧化性应激标记的GSH：GSSG比率所呈现的氧化还原状态有显著的改善。这意味着不论是低(3μM)或高(10μM)浓度的化合物A至D透过清除自由基而达到显著的肝细胞保护作用(图8A及8B)。
Hepasim化合物在初代肝脏星状细胞中对于促纤维化基因表达的防治作用
图9显示化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物的处理对于初代肝脏星状细胞中的促纤维化基因(包括α-SMA及TIMP-1)的表达量的影响。化合物B及C被发现具有剂量依赖性效应。
图10显示化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物的处理对于初代肝脏星状细胞中的促纤维化基因(包括Collagen-1及TGF-β)的表达量的影响。化合物B及C被发现具有剂量依赖性效应。
Hepasim化合物在经重组TGF-β1处理后的无限增殖肝星状细胞中对于其促纤维化基因表达的抑制作用
图11显示与经转化生长因子β1(TGFb1)处理过的无限增殖肝脏星状细胞比较，化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对于促纤维化基因(包括α-SMA及TIMP-1)表达的防治作用。化合物B及C被发现具有剂量依赖性效应。
图12显示与经TGFb1处理过的无限增殖肝脏星状细胞比较，化合物A至D及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对于促纤维化基因(包括Collagen-1及TGF-β)表达的防治作用。化合物B及C被发现具有剂量依赖性效应。
较高浓度的Hepasim对肝星状细胞的治疗作用
以BrdU分析试验及细胞死亡检测分析试验分别来比较肝星状细胞增殖及细胞凋亡的差异，以评估较高浓度Hepasim(24-80μM)的抗纤维化作用。其结果显示在经化合物B及C处理过的子组中明显的肝星状细胞凋亡现象及对其增殖的抑制作用，高浓度(80μM)的化合物D展现相同但较迟(72小时后)的作用(图13)。相较于其它化合物，化合物B展现最强的作用。
结论
细胞研究的总结显示所有化合物均对肝损害有明显的保护作用。化合物B及C也展现对经TGF-β处理过的无限增殖肝星状细胞及初代肝星状细胞的抗纤维 化作用。根据所有活体外实验，化合物B及C做为为了进一步测定抗纤维化的活体内实验的候选物。
实施例3：用于肝纤维化的Hepasim-化合物B及C的抗纤维化作用的动物实验
化合物B及C在细胞研究中展现最强的抗纤维化作用。进一步针对化合物B及C的动物实验是被设计用以再次评定该两种化合物在临床上对于肝硬化的效用。
方法
肝硬化动物模型
自国立台湾大学动物中心取得7周龄的雄性Wistar大鼠(150至180克)。于标准条件下饲养大鼠，所有实验均在符合国立台湾大学实验动物照护及使用委员会所制定的“实验动物照护及使用规范”下执行。每日给予大鼠二乙基亚硝胺(DEN)溶液(Sigma,St Louis,MO)作为为期9周的主要饮用水，之后换为为期2周的常用水。在第一周以100ppm(容量/容量)做为开始。每周测量一次动物的平均体重，且其饮用水中的二乙基亚硝胺浓度按当周相对于第一周的体重比调整。
Hepasim化合物的制备
如以上实施例2中所述，Hepasim化合物(亦即化合物A至E)等同于美国专利号7109232中所公开的化合物1至5。用以制备Hepasim化合物的方法与美国专利号7109232中所公开的方法相同。
Hepasim化合物B及C萃取自牛樟芝。以无菌蒸馏水制备精制的化合物B(7mg/kg)、C(14mg/kg)及320mg/kg的牛樟芝并于第5至第11周以一胃管每日分别喂食大鼠。于第11周时处死部分动物并将其肝脏取样以做为病理检验及基因表达分析试验之用。
血清的生化分析
自每一只小鼠的后眼窝脉管丛收集1毫升的血液样本并立刻于4℃以1300xg离心，将血浆保存于-20℃以供肝功能测试使用。使用市售的酵素型试剂组及比色分析仪(Dri-Chem 3000,Fuji Photo Film Co,Tokyo,Japan)来测定丙氨 酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)的浓度。
测量肝脏中的羟脯氨酸含量
将羟脯氨酸的浓度定量以测定无肿瘤肝样本中的肝胶原蛋白含量。简言之，用研杵将肝样本(介于15到25毫克之间)于含有20毫升6N盐酸的微量离心管内小心研磨。接着加入额外的6N盐酸以制备总体积为30mL/mg的组织并藉此冲下残留于研杵上的碎块组织。于120℃将盐酸内的研磨组织水解16小时。在冰上短暂降温之后以8000g离心10分钟，将上清液移至新管内；以水补足经蒸发而失去的体积。加入等量的6N氢氧化钠并混合，使用石蕊试纸将该溶液的酸碱值调整至pH 4–9。将40微升的中和样本溶液移至96孔酶联免疫吸附试验(ELISA)盘中并于每一孔中以含有5mL 7％氯胺T(Sigma,St Louis,MO,USA)及20mL醋酸/柠檬酸缓冲液(57g三水合醋酸钠、37.5g二水合柠檬酸三钠、5.5g柠檬酸、385mL异丙醇，并溶于水中以达到1升的最终体积)的溶液使其氧化。之后加入150mL的艾利希溶液(Ehrlich’ssolution)。将2g对二甲氨基苯甲醛(pdimethylamino-benzaldehyde)(Sigma)溶于3mL60％HClO4(Merck,Darmstadt,Germany)再与9mL异丙醇混合，以制备艾利希溶液。将最终的混合物于60℃培养35分钟，然后于室温下培养10分钟，用560nm的波长来测定其吸光度。用相同方法来处理含100、80、60、40、20及0mg/mL 4-羟基-L-脯氨酸(Sigma)的标准溶液。其标准曲线在此范围内为线性(r＝0.98)。肝羟脯氨酸浓度值是以每克湿组织中含多少毫克来呈现。
免疫组织化学及组织染色
将肝样本以福尔马林固定并嵌入于石蜡中以供天狼星红(Sirius red)染色使用。将肝切片于苦味酸饱和水溶液(Wako,Osaka,Japan)中以0.1％(重量/体积比)天狼星红(Sigma,St Louis,MO)染色1小时以侦测肝纤维化。在染色之后，以酸化水[0.5％(重量/重量)冰醋酸于水中]冲洗玻片2次，再用100％乙醇将玻片脱水3次。在二甲苯中清洗玻片，封于树脂介质之中，再于光学显微镜下观察。用数字相机系统HC-2500及图像分析软件Image-Pro Plus测量天狼星红阳性区域。
胶原蛋白表达及氧化性应激的实时定量反转录聚合酶连锁反应分析
以约0.5×0.5cm的面积测量大鼠肝组织样本。用电动研杵在1mL的TRIzol 缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中将每块组织均质化，再与0.5mL氯仿/异戊醇(24：1)混合，于4℃以12,000xg离心10分钟。将上清液移至干净的管内，加入异丙醇，混合均匀并于-80℃储存一整夜。将反应混合物于4℃以12,000xg离心30分钟以产出RNA粗沉淀物，用70％乙醇清洗沉淀物并使其在空气中晾干。使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波长下的吸光值来测量全部RNA的浓度。以市售的高容量RNA到cDNA试剂盒(High CapacityRNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)来进行反转录反应。按照制造商的使用说明-于37℃反应60分钟，于95℃反应5分钟，并维持在4℃，将每20μl反应中的2μg总RNA制成cDNA。将所得到的cDNA调成100ng/μl的最终浓度并构成基质以供之后实验所需。用StepOnePlus实时聚合酶连锁反应系统(Applied Biosystems,USA)来进行实时聚合酶连锁反应以扩大并侦测基因表达。在含有2μl模板DNA、5μl2X TaqMan PCR Master Mix(AppliedBiosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl含探针、正向及反向引物的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反应混合物中分析样本，其中并使用以下所述的定量聚合酶连锁反应标靶：(a)大鼠α-SMA，试剂编号Rn01759928_g1；(b)大鼠TIMP-1，试剂编号Rn00587558_m1；(c)大鼠TGF-β1，试剂编号Rn00572010_m1；(d)大鼠胶原蛋白Ι，试剂编号Rn 01463838_m1；(e)大鼠CuZnSOD，试剂编号Rn00566938_m1；(f)大鼠MnSOD，试剂编号Rn00690587_g1；(g)大鼠过氧化氢酶，试剂编号Rn00560930_m1；(h)大鼠谷胱甘肽过氧化物酶，试剂编号Rn00577994_g1；(i)大鼠NADPH氧化酶，试剂编号Rn00585380_m1及(j)大鼠GAPDH，试剂编号Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH将所有结果标准化以控制mRNA浓度的变异。所用的循环条件如下：50℃ 2分钟，95℃10分钟，之后以每循环含95℃ 15秒及60℃ 1分钟进行40个循环。
结果
肝损害参数的改善
在实验结束时，与对照组比较，包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素及谷氨酰转肽酶(γ-GT)浓度的肝损害相关血清参数在每日喂食320mg/kg牛樟芝及两种化合物的动物中均显示显著降低(图14)。这意味着化合物B及C有显著的肝细胞保护作用。
肝纤维化的改善
比较羟脯氨酸浓度及显微镜上天狼星红阳性区域在对照组及治疗组肝脏中的差异，以评估化合物B及C的抗纤维化作用。此结果显示在以牛樟芝及化合物B及C喂食的动物中肝硬化有明显的改善(图15)。
纤维化前期基因表达量的降低
在喂食牛樟芝及化合物B及C的动物中，纤维化前期基因(包括胶原蛋白I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表达量显著降低(图16)。
氧化性应激的降低
经治疗之后，抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶)的基因表达量在喂食牛樟芝及化合物B及C的动物中被显著地上调，且NADPH氧化酶(为产生活性氧物质(ROS)的主要酵素)的基因表达量被显著地下调(图17A及17B)。
在以化合物B及C治疗的肝硬化动物中，其以谷胱甘肽浓度及谷胱甘肽:氧化型谷胱甘肽(GSH:GSSG)比率作为氧化性应激标记所呈现的氧化还原状态有显著的改善(图18)。这意味着以化合物B及C治疗可显著降低氧化性应激及伴随的肝纤维化。
结论
动物实验的总结表示化合物B及C可在肝硬化动物中展现抗纤维化作用并做为良好的自由基清除物，化合物B及C亦可降低肝脏中的氧化性应激。
实施例4：用于皮肤损害的Hepasim-Hepasim的细胞研究
本实验是被设计来验证牛樟芝的抗纤维化及抗氧化作用来自于Hepasim的假设。探究Hepasim在抑制疤痕的过度形成及在治疗如氧化还原反应及曝露于紫外线下对皮肤造成的物理伤害的可能角色。在此实施例中，使用真皮纤维母细胞CG1639及皮肤角质细胞来研究Hepasim对皮肤的作用。真皮纤维母细胞为生长在皮肤真皮层内的细胞，负责生成结缔组织及使皮肤从伤害中恢复。
方法
细胞
真皮纤维母细胞株CG1639取自于生物资源保存及研究中心(BCRC)并于含有1％抗霉抗生素(Gibco,Invitrogen)及15％胎牛血清(Gibco,Invitrogen)的 DMEM培养液(Gibco,Invitrogen)中培养。大鼠胎儿皮肤角质细胞(FRSK细胞株)取自于日本卫生科学研究资源库(HSRRB)并于含有10％胎牛血清(Gibco,Invitrogen)及1％抗霉抗生素(Gibco,Invitrogen)的EMEM培养液(Eagle’s minimal essential media,Gibco,Invitrogen)中培养。B16F10细胞为一种啮齿类动物黑色素瘤细胞株，购自于美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)并于含有10％胎牛血清(FBS；HyClone Lab.Inc.,Logan,UT)、0.02％抗霉抗生素溶液(青霉素，每毫升10000单位；链霉素，每毫升10000μg及双性杀霉素B，每毫升25μg；Invitrogen,Carlsbad,CA)的EMEM培养液(Eagle’s Minimum EssentialMedium；Sigma,St.Louis,MO)中培养。于37℃含5％二氧化碳的潮湿大气下培养此三种细胞株。
Hepasim化合物的制备
如上面实施例2中所述，Hepasim化合物(亦即化合物A至E)等同于美国专利号7109232中所公开的化合物1至5。用以制备Hepasim化合物的方法与美国专利号7109232中所公开的方法相同。
应注意到在下列实例中，“化合物D”是指化合物D与化合物E的消旋混合物，且其中化合物D与化合物E的比率优选为1:1至2:1。在一实施例中，所述化合物D与化合物E的比率为约1.62:1。
Hepasim化合物对经紫外线照射过的黑色素瘤细胞及角质细胞的作用
为了探究直接紫外线照射对黑色素生成及氧化性应激的诱发，于HANKS’平衡盐溶液(Sigma)中以8J cm-2紫外线A(UVA；FL15BLB,352nm,15W；Toshiba,Tokyo,Japan)及10mJcm-2紫外线B(UVB；G15T8E,306nm,15W；Sankyo Denki,Tokyo,Japan)照射黑色素瘤细胞及角质细胞。用UVX模式数字辐射计(Model UVX Digital Radiometer；UVP Inc.,Upland,CA)来测量紫外线的强度。
在紫外线A照射之前，将两种不同浓度(3或10μM)的Hepasim化合物A至D与B16F10及FRSK细胞作用72小时。将DMEM培养液换成磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)以避免在紫外线照射前生成源自培养液的毒性光照产物。于紫外线A照射24小时后收集细胞并进行分析试验。以离心将收集的细胞沉淀并使其在含50mM Tris–HCl、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1％(v/v)Triton X-100、苯甲基磺酰氟(PMSF)(100mg/ml)及胃蛋白酶抑制物(pepstatin A)(1mg/ml于DMSO中)及亮肽素(leupeptin)(1mg/ml于水中)且pH值为6.8的溶解缓 冲液中溶解以制备细胞溶解物。以10,000rpm将细胞离心10分钟并收集所有细胞溶解物且储存于-80℃。
黑色素含量分析试验
为测量黑色素含量，在冰上用超声波将B16F10细胞震碎并将该混合物离心(25000g，10分钟，4℃)。将上清液移除并于60℃将沉淀物溶解于0.85N KOH中20分钟。同时间并培养标准黑色素(Sigma)。接着以405nm波长的吸光值进行黑色素含量的分光光度分析。
酪氨酸酶活性分析试验
测量L-DOPA的氧化速率来评估暴露在紫外线下的B16F10细胞的酪氨酸酶活性。如以下所述来进行该分析试验，将作为受质的20mM L-DOPA加入96孔盘内的每个细胞溶解物中，于37℃每隔10分钟用分光光度计于475nm的波长以分光光度法测量多巴色素(dopachrome)形成的吸光值达1小时。与酪氨酸酶(2034U/mg)标准曲线比较以计算酪氨酸酶活性并以每毫克蛋白质多少单位来表示。用未照射且未经处理的对照组细胞的酪氨酸酶活性(每毫克蛋白质多少单位)的百分比(100％)来表示数据。
经紫外线照射的角质细胞的细胞活性氧物质分析试验
用市售的试剂盒(#K264-100,BioVision)来测量谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。从这些数据中决定GSH/GSSG比率。将制造商的使用指引做若干修改以进行该分析。简言之，立刻将细胞沉淀物(约10毫克)均质化，从每一样本中取60μl并移至一含过氯酸且事先降温过的管内，以13,000xg离心2分钟，收集上清液并储存在-80℃直到被分析。如制造商所述以进行分析。简言之，将低温的3N KOH加入至每一样本并混合，以13,000xg离心10分钟。对每一样本，使用10微升样本量及适当缓冲液，并用90μl分析缓冲液来侦测GSH，混合10μl谷胱甘肽还原酶以侦测总谷胱甘肽，以10μl GSH淬灭剂来侦测GSSG，于室温下放置40分钟，于340/420nm波长下读取每一样本的吸光值3分钟。以DC蛋白质浓度分析试验(Bio-Rad)来测定每一样本的蛋白质浓度。每一样本的信号以该样本的蛋白质含量标准化。
细胞的RNA萃取及定量反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)
以市售的高容量RNA到cDNA试剂盒(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(AppliedBiosystems,USA)来进行反转录反应。按照制造商的使用说明—于37℃ 反应60分钟，于95℃反应5分钟，并维持在4℃，将每20μl反应中的2μg总RNA制成cDNA。将所得到的cDNA调成100ng/μl的最终浓度并构成基质以供之后实验所需。
用StepOnePlus实时聚合酶连锁反应系统(Applied Biosystems,USA)来进行实时聚合酶连锁反应以扩大并侦测基因表达。在含有2μl模板DNA、5μl2X TaqMan PCR MasterMix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl含探针、正向及反向引物的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反应混合物中分析样本，其中并使用以下所述的定量聚合酶连锁反应标靶：(a)α-SMA，试剂编号Rn01759928_g1；(b)TIMP-1，试剂编号Rn00587558_m1；(c)TGF-β1，试剂编号Rn00572010_m1；(d)胶原蛋白Ι，试剂编号Rn 01463838_m1；(e)GAPDH，试剂编号Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH将所有结果标准化以控制mRNA浓度的变异。按照制造商的使用说明，用Ct比较法(ΔΔCt)进行相对定量。所用的循环条件如下：50℃2分钟，95℃ 10分钟，之后以每循环含95℃ 15秒及60℃ 1分钟进行40个循环。
Hepasim化合物对真皮纤维母细胞株内促纤维化基因表达的防治作用
以两种不同浓度的Hepasim化合物与真皮纤维母细胞(CG1639细胞)作用72小时。之后萃取其RNA并接着以实时定量PCR测量xagen-1、TGF-β1、α-SMA及TIMP-1的mRNA。
结果
Hepasim抑制紫外线照射后的黑色素生成
藉由研究紫外线照射对B16F10细胞内黑色素含量的影响来测定Hepasim的抗黑色素生成作用。未经紫外线照射的B16F10细胞显示每毫克蛋白质含7.4±0.3μg的黑色素量，经紫外线光源照射过的B16F10细胞的黑色素生成量则大幅增加了33.80±4.6％(P<0.001)。在紫外线照射之前给予10μM Hepasim化合物B及C使得黑色素形成降低(化合物B：29.40±4.3％；化合物C：28.92±5.3％)，经化合物A及D作用过的黑色素肿瘤细胞亦显示黑色素含量降低(化合物A：23.25±5.5％，P＝0.04；化合物D：26.32±2.3％，P＝0.037)。
进一步探讨该抗黑色素生成作用是否来自于其对酪氨酸酶(黑色素合成的速率限制步骤酵素)的抑制作用。在未经紫外线照射的对照组细胞中，B16F10细 胞经观察含有每毫克蛋白质3.0±0.5单位。紫外线照射在B16F10细胞中显示其导致52.55±4.36％(P<0.001)酪氨酸酶活性的增加。以3及10μM的化合物A至D处理，在B16F10细胞内，针对紫外线调控的酪氨酸酶活性，可达到浓度依赖性的保护作用(3μM化合物A：43.50±3.5％；10μM化合物A：26.75±2.3％；3μM化合物B：51.65±4.6％；10μM化合物B：42.32±6.7％；3μM化合物C：48.55±3.7％；10μM化合物C：40.55±3.9％；3μM化合物D：38.5±4.5％；10μM化合物D：29.25±2.6％)。
经Hepasim化合物处理后的细胞活性氧物质分析试验
与曝露于紫外线的对照组细胞比较，在经各个化合物(即使为低浓度)及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的细胞中，其以谷胱甘肽浓度及GSH:GSSG比率作为氧化性应激标记所呈现的氧化还原状态有显著的改善(图19)。这意味着不论是低(3μM)或高(10μM)浓度的化合物A至D，均透过清除自由基而达到显著的角质细胞保护作用。
Hepasim化合物对真皮纤维母细胞内促纤维化基因表达的防治作用
在经化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理过的真皮纤维母细胞中，所有4种促纤维化基因的表达量均显著地被下调，且化合物B及C被发现有剂量依赖性效应(图20)。
结论
细胞研究的总结显示所有化合物均对氧化性应激(如阳光照射)对角质细胞的损害有显著的保护作用。化合物B及C也展现对真皮纤维母细胞的抗纤维化作用。这意味着其具有预防肥厚性疤痕形成的潜力。在紫外线照射的活体外(in vitro)实验中，Hepasim化合物展现出降低细胞内黑色素累积的能力，且看起来可做为进一步抗黑色素生成之活体内实验的候选物，并应将高剂量列入考虑。
实施例5：牛樟芝菌丝体的萃取物
水萃取物
将牛樟芝的发酵菌丝体加入85℃热水中(菌丝体与水的重量比为1:5)并均匀地搅拌4小时。接着将该反应混合物冷却至30℃并使用分离器分离液体。将该液体藉由真空蒸发浓缩以得到牛樟芝菌丝体水萃取物。
乙醇萃取物
将牛樟芝的发酵菌丝体加入乙醇中(菌丝体与乙醇的重量比为1:5)，加热至60-65℃并搅拌。接着将该反应混合物冷却至40℃并使用分离器分离液体。将该液体藉由真空蒸发浓缩以得到牛樟芝菌丝体乙醇萃取物。
在一例示性实施例中，牛樟芝菌丝体乙醇萃取物中Hepasim化合物的比例如下所示：
化合物A：13.13％；
化合物B：0.52％；
化合物C：20.8％；
化合物D：9.47％；
化合物E：5.85％。
牛樟芝菌丝体是以深层液态发酵预先准备的，如T.L.M.Stamford等人所发表的Food Science，“Protein enrichment of cashew wastes for animal feeds”，可参见http://www.unu.edu/unupress/food/8F101e/8F101E0b.htm。
牛樟芝菌丝体(ACM)乙醇萃取物用于部分前述实施例的分析试验中，且实验数据显示于图7-12、19-20。所有的实验方法均相同，除了把Hepasim化合物替换为牛樟芝菌丝体乙醇萃取物。
实施例6：疤痕形成的动物模型
动物模型
建立肥厚性疤痕的兔耳模型。简言之，准备12只新西兰白兔(体重2.5-3.0公斤)以用来在无菌条件下使其受伤。使用1cm的穿刺活检工具在每只耳朵的腹侧软骨下创造四个全层厚1cm的圆形伤口。接着用手术刀片将软骨膜从软骨切下。将浓度为1％w/v的试验试剂(包括化合物B、C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物)每日施予至实验组的伤口(每个伤口10mL)持续14天，而对照组则接受等量的1％w/v生理食盐水。
胶原蛋白I及胶原蛋白III的定量
使用ELISA试剂盒(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN,USA)根据操作手册进行胶原蛋白I及胶原蛋白III的定量。
蛋白质印迹法(Western Blot)
溶解疤痕组织，然后将蛋白质试样变性，然后在10.6％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜。将膜于室温下培养在含5％脱脂牛奶和0.05％Tween-20的TBS中1小时，并以初级抗体(稀释度1:300)于4℃处理一整夜。隔天以TBST清洗该膜15分钟。随后，将该膜与结合有辣根过氧化物酶的AffiniPure山羊抗兔抗体(稀释度1：3000)于室温下培养1小时并以TBST清洗21分钟。接着使用ECL侦测该膜。进一步以Quantity One软件4.1.1(Bio-Rad,Hercules,CA)分析蛋白质印迹法的结果。
结果
化合物B、C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物在兔耳模型上减缓疤痕的形成
所有的伤口均有足够的疤痕成熟并显示结疤的组织学证据。对照组的平均疤痕厚度(SEI)为3.71±0.31，其显著地高于以化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理的组别(在第14天的平均疤痕厚度分别为1.93±0.51、2.10±0.24及2.13±0.44，P<0.05)。对照组的平均表皮厚度(ETI)为5.08±0.44，而化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理组的平均表皮厚度则分别为2.23±0.31,3.10±0.14及3.35±0.24(P<0.05)。这表示经化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理的伤口，其表皮厚度显著减少。
在组织学上，对照组疤痕的真皮层显著增厚，且真皮内乳突层和网状层之间的边界是模糊的；胶原纤维密集而胶原束错乱，细胞数目亦增加。而经化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理14天的疤痕的表皮基底层则是平整的，真皮层中没有显著增厚，胶原纤维排列良好，且细胞数目很少。
测试剂对胶原蛋白I及胶原蛋白III合成的影响
为了评估测试剂对基质生成的分子影响，测量胶原蛋白I及胶原蛋白III(其构成了大部分的疤痕细胞外基质)的蛋白密度。如同预期，在化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理组中，胶原蛋白I的密度在第14天显著减少(p<0.05)，而胶原蛋白III的密度虽然在第7天没有显著减少但在第14天有显著减少(p<0.05)。
测试剂对α-SMA及TGF-β1表达量的效果
肌纤维母细胞的持续存在是肥厚型疤痕的一个显著特点，其有助于过多的基质生产。蛋白质印迹法分析显示在化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理组中α-SMA的表达量与对照组相比减少(p<0.05)。蛋白质印迹法分析 亦显示在化合物B、化合物C及牛樟芝菌丝体乙醇萃取物处理组中第14天的TGF-β1表达量与对照组相比显著减少(p<0.05)。
本领域技术人员能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的化合物、组合物、萃取物及混合物、其制造程序与方法及其用途是优选实施方案的代表，其为示范性的且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何本领域技术人员能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。
说明书中提及的所有专利及出版品，都以和本发明有关领域的一般技艺为准。所有专利和出版物都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版物都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部分的名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据优选实施方案及任意的特点来具体公开了本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所公开的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明要求保护的范围内。

Claims (16)

1.一种组合物在制备用于美白皮肤的医药品或化妆品中的用途，其中所述组合物包含具有下式的化合物：
其中所述化合物为
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物用于制备外用化妆品或皮肤制剂。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。
4.一种混合物在制备用于皮肤美白的医药品或化妆品中的用途，其中所述混合物包含牛樟芝(Antrodia cinnamomea)发酵菌丝体的水萃取物或有机溶剂萃取物作为美白的活性成分，其中所述萃取物包含至少一种选自由以下所组成的群组的化合物：
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，
其中所述
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮与
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮的混合物的浓度等于或大于3μM。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述牛樟芝发酵菌丝体是由深层液态发酵制备的。
6.如权利要求4所述的用途，其为外用化妆品或皮肤制剂。
7.如权利要求4所述的用途，其抑制酪氨酸酶及黑色素的生成。
8.一种组合物在制备用于对抗皮肤老化的医药品或化妆品中的用途，其中所述组合物包含具有下式的化合物：
其中所述化合物为
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述组合物用于制备外用化妆品或皮肤制剂。
10.如权利要求8项所述的用途，其中所述皮肤老化是由氧化性应激造成的。
11.如权利要求10项所述的用途，其中所述氧化性应激是由紫外线照射引发的。
12.一种混合物在制备用于对抗皮肤老化的医药品或化妆品中的用途，其中所述混合物包含牛樟芝发酵菌丝体的水萃取物或有机溶剂萃取物作为对抗皮肤老化的活性成分，其中所述萃取物包含至少一种选自由以下所组成的群组的化合物：
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及
(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，
其中所述
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、
3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或
(3R*,4S*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮与(3R*,4R*)-1-羟基-3-异丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮的混合物的浓度等于或大于3μM。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述牛樟芝发酵菌丝体是由深层液态发酵制备的。
14.如权利要求12所述的用途，其为外用化妆品或皮肤制剂。
15.如权利要求12所述的用途，其中所述皮肤老化是由氧化性应激造成的。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述氧化性应激是由紫外线照射引发的。
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