TWI622406B - 來自牛樟芝菌絲體的化合物及混合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於來自牛樟芝菌絲體的化合物及包含該化合物的混合物的新穎用途。該新穎用途包含美白皮膚、對抗皮膚老化、減少疤痕形成、誘發或增強肝臟再生、或在有需要的個體中治療纖維化或與纖維化相關的疾病。該化合物較佳係選自3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。

Description

來自牛樟芝菌絲體的化合物及混合物的用途
本發明係關於來自牛樟芝菌絲體的化合物及混合物的用途。
牛樟芝(Antrodia cinnamomea T.T.Chang & W.N.Chou，為Antrodia camphorate在分類上的同義詞)(Wu et al.,1997,Antrodia camphorata("niu-chang-chih"),new combination of a medicinal fungus in Taiwan.Bot.Bull.Acad.Sin.38：273-275)子實體在台灣是一種高價值的民間醫藥。它被用作解毒劑和用於治療腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚癢及肝癌。一些牛樟芝子實體中的生物活性成分已被分離，且已被辨識為一系列的多醣體、類固醇、三萜類(triterpenoids)與倍半萜內酯(sesquiterpene lactone)(Lin et al.,2007,Factors affecting mycelial biomass and exopolysacharide production in submerged cultivation of Antrodia cinnamomea using complex media.Bioresource Technology 98：2511-2517)。先前的研究已從牛樟芝菌絲體分離出五個新的順丁烯二酸與丁烯二酸衍生物(化合物1-5)(Nakamura et al.,2004,Five new maleic and succinic acid derivatives from the mycelium of Antrodia comphorata and their cytotoxic effects on LLC tumor cell line.J Nat Prod 67：46-48)。
美國專利第7109232號揭露五個來自牛樟芝菌絲體的化合物1-5，以及其用途(如保肝、抗發炎或抗腫瘤之活性〕與製備方法。上述的化合物1-5在另一篇文獻中進一步被稱為Antrodin A-E(Phuong do T et al.,2009,inhibitory effects of antrodins A-E from Antrodia cinnamomea and their metabolites on hepatitis C virus protease.Phytother Res.Apr；23(4)：582-4)。由前案中可發現這五個來自牛樟芝菌絲體的化合物1-5不但在結構上相似，亦具有相似的活性。
除非另外特別加以定義，於此敘述中所用的名詞將具有熟知此技藝者可瞭解之普通且常見之含意。如整個申請案中所使用，下列的術語具有下面所述之含意：術語「個體」意指一動物。較佳地，該動物係一哺乳動物，例如小鼠、大鼠、人、狗、貓等等。在一較佳實施例中，該個體係人類。
本發明提供一種組合物在製備用於美白皮膚或對抗皮膚老化的醫藥品或化妝品的用途，其中該組合物包含具有下式之化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O；R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該組合物係用於製備外用化妝品或皮膚製劑。在一較佳實施例中，該組合物抑制酪胺酸酶及黑色素的生成。在另一較佳實施例中，該皮膚老化係由氧化壓力造成，較佳地，該氧化壓力係由紫外線照射引發。
本發明亦提供一種混合物在製備用於美白皮膚或對抗皮膚老化的醫藥品或化妝品的用途，其中該混合物包含牛樟芝菌絲體之水萃物或有機溶劑萃取物，其中該水萃物或有機溶劑萃取物包含具有下式之化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O；R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該混合物係用於製備外用化妝品或皮膚製劑。在一較佳實施例中，該混合物抑制酪胺酸酶及黑色素的生成。在另一較佳實施例中，該皮膚老化係由氧化壓力造成，較佳地，該氧化壓力係由紫外線照射引發。
較佳地，該牛樟芝菌絲體係由深層液態發酵製備。較佳地，該有機溶劑包括但不限於醇類(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯類(如乙酸乙醯酯)、烷烴(如己烷)及鹵代烷烴(如CH3Cl、C2H2Cl2)。較佳的有機溶劑為乙醇或對人類不會造成任何副作用的醇類溶劑。
本發明還提供一種組合物在製備用於減少疤痕形成、治療纖維化、或治療與纖維化相關的疾病的醫藥品的用途，其中該組合物包含具有下式之 化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O；R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該用於減少疤痕形成的醫藥品適用於一具有傷口之個體，該傷口係選自由以下所組成之群組：裂傷、燒傷、穿刺傷、壓瘡、褥瘡、外傷、咬傷、瘻管、潰瘍、感染引起的病變、牙周傷口、根管治療傷口、手術傷口、切口、組織纖維化、及因美容外科手術導致的傷口。
較佳地，該組合物可下調促纖維化基因(包括Collagen I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表現量。
較佳地，該纖維化或與纖維化相關的疾病係：肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、皮膚纖維化、心肌纖維化、血管纖維化、結疤、肝硬化、肝壞死、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病性腎病、類風濕性關節炎、纖維肉瘤、硬 皮病或彼等之組合。
本發明還提供一種混合物在製備用於減少疤痕形成、治療纖維化、或治療與纖維化相關的疾病的醫藥品的用途，其中該混合物包含牛樟芝菌絲體之水萃物或有機溶劑萃取物，其中該水萃物或有機溶劑萃取物包含具有下式之化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O；R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該用於減少疤痕形成的醫藥品適用於一具有傷口之個體，該傷口係選自由以下所組成之群組：裂傷、燒傷、穿刺傷、壓瘡、褥瘡、外傷、咬傷、瘻管、潰瘍、感染引起的病變、牙周傷口、根管治療傷口、手術傷口、切口、組織纖維化、及因美容外科手術導致的傷口。
較佳地，該混合物可下調促纖維化基因(包括Collagen I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表現量。
較佳地，該纖維化或與纖維化相關的疾病係：肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、皮膚纖維化、心肌纖維化、血管纖維化、結疤、肝硬化、肝壞死、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病性腎病、類風濕性關節炎、纖維肉瘤、硬皮病或彼等之組合。
較佳地，該牛樟芝菌絲體係由深層液態發酵製備。較佳地，該有機溶劑包括但不限於醇類(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯類(如乙酸乙醯酯)、烷烴(如己烷)及鹵代烷烴(如CH3Cl、C2H2Cl2)。較佳的有機溶劑為乙醇或對人類不會造成任何副作用的醇類溶劑。
本發明還提供一種組合物在製備用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品的用途，其中該組合物包含具有下式之化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O； R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3- 異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品適用於一經歷肝切除術的個體。在另一較佳實施例中，該用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品適用於一患有肝纖維化或肝硬化的個體。
本發明還提供一種混合物在製備用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品的用途，其中該混合物包含牛樟芝菌絲體之水萃物或有機溶劑萃取物，其中該水萃物或有機溶劑萃取物包含具有下式之化合物：
或其互變異構形式、其立體異構物、其多形體、其鹽類、或其溶劑合物，其中X係N或O；R1係H、羥基、C1-10烷氧基、C2-10烯氧基或C2-10炔氧基；R2係H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R3係無、H、羥基、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基； 表示一單鍵或雙鍵；但若X係O，則R3係無；若表示一單鍵，則該化合物具有下式：
較佳地，該化合物係3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、或(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮。
較佳地，該用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品適用於一經歷肝切除術的個體。在另一較佳實施例中，該用於誘發或增強肝臟再生的醫藥品適用於一患有肝纖維化或肝硬化的個體。
較佳地，該牛樟芝菌絲體係由深層液態發酵製備。較佳地，該有機溶劑包括但不限於醇類(如CH3OH、C2H5OH、C3H7OH)、酯類(如乙酸乙醯酯)、烷烴(如己烷)及鹵代烷烴(如CH3Cl、C2H2Cl2)。較佳的有機溶劑為乙醇或對人類不會造成任何副作用的醇類溶劑。
本發明進一步提供一種皮膚美白配方，包含牛樟芝發酵菌絲體之水萃取物或有機溶劑萃取物作為美白的活性成分，其中該萃取物包含至少一種選自由以下所組成群組之化合物：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，其中該3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、 3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮與(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮之混合物的濃度係等於或大於3μM。
較佳地，該牛樟芝發酵菌絲體係由深層液態發酵製備。
較佳地，該配方係外用化妝品或皮膚製劑。
較佳地，該配方抑制酪胺酸酶及黑色素的生成。
本發明進一步提供對抗皮膚老化的配方，包含牛樟芝發酵菌絲體之水萃取物或有機溶劑萃取物作為對抗皮膚老化的活性成分，其中該萃取物包含至少一種選自由以下所組成群組之化合物：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，其中該 3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮與(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮之混合物的濃度係等於或大於3μM。
較佳地，該牛樟芝發酵菌絲體係由深層液態發酵製備。
較佳地，該配方係外用化妝品或皮膚製劑。
在一實施例中，該皮膚老化係由氧化壓力造成。在一實施例中，該氧化壓力係由紫外線照射引發。
本發明的組合物或混合物可為固體、溶液、乳液、分散劑、微膠粒、微脂體等形式，其中該組合物或混合物包含一個或多個作為活性成分的本發明化合物，混合適用於腸內或腸胃外應用的有機或無機的載劑或賦型劑。例如，可將活性成分複合通常無毒且在藥學上可接受用於片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液、乳液、懸浮液，和任何其他適合使用的形式的載體。可以使用的載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、明膠、甘露糖醇、澱粉糊，三矽酸鹽、滑石、玉米澱粉、角蛋白、膠體二氧化矽、馬鈴薯澱粉、尿素、中等鏈長甘油三酯、葡聚醣，和其他適用於製造固體、半固體或液體形式 製劑的載體。此外，亦可使用輔劑、穩定劑、增稠劑和著色劑和香料。
本發明的組合物或混合物可為一適合口服使用的形式，例如，作為錠劑、片劑、糖錠、水性或油性懸浮液、散粉劑或顆粒劑、乳劑、硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。用於口服使用的組合物或混合物，可以根據製造醫藥品領域中已知的任何方法來製備，而該組合物或混合物可以含有一種或多種選自甜味劑(如蔗糖、乳糖或糖精)、矯味劑(如薄荷、冬青油或櫻桃油)、著色劑和防腐劑所組成的試劑，以提供藥學上優雅和可口的製劑。
含有活性成分的錠劑與無毒的藥學上可接受的賦形劑的混合物，也可以通過已知的方法來製造。所用的賦形劑可以是，例如，(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)粒化劑和崩解劑，如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或藻酸；(3)結合劑，如黃蓍膠、玉米澱粉、明膠或阿拉伯膠，和(4)潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可以不包衣，或者可以用已知的技術塗佈，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而提供在一個較長的時間內持續的作用。例如，也可以採用一種時間延遲材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們也可以由美國專利第4256108、4160452和4265874號中所描述的技術塗覆，以形成供控釋的滲透壓治療錠劑。
在某些情況下，口服的活性成分可呈硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合。它們也可呈軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)中混合。
本發明的組合物或混合物亦可為無菌注射懸浮液。此懸浮液可根據已知的方法，使用適合的散佈劑、浸潤劑和懸浮劑來配製。無菌注射液也可以為一以無毒、胃腸道可接受的稀釋劑或溶劑來配製的無菌注射溶液或懸浮液，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液。無菌、固定的油劑常被用作為溶劑或懸浮基質。為此目的，可使用任何溫和固定的油劑，包含合成的單酸甘油脂、雙酸甘油脂、脂肪酸(包括油酸)、天然植物油如：芝麻油、椰子油、花生油、棉花籽油等或合成脂質媒液(如油酸乙酯)等等。如有需要可加入緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑等等。
可能適用於此發明的組合物或混合物也可以以直腸塞劑的形式給予。這些合成物可藉混合藥物與合適的非刺激性賦形劑(如可可脂、聚乙二醇的合成甘油酯)來製備，其在常溫下成固態，但是於腸道內會液化及/或溶解以釋放藥物。
在習知的方法中，本發明的組合物或混合物亦可包含通常在化妝品和皮膚病學領域中的佐劑，如親水性或親脂性膠凝劑、保濕劑(如甘油和山梨醇)、脂肪相增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、電解質、溶劑、芳香劑、填充劑、遮蔽劑、顏料、氣味吸收劑、著色材料及金屬螯合劑。上述各種佐劑的用量是那些所考慮的領域的常規使用量，例如為組合物總重量的0.01%至20%。這些佐劑根據它們的性質可被引入到親脂相或到親水相。這些佐劑及它們的濃度，必須使得它們不會不利地影響本發明組合物或混合物的美容及/或皮膚病學性質。
示例性的佐劑有親水性膠凝劑，如羧乙烯聚合物(carbomer)、丙烯酸類共聚物(如丙烯酸酯/丙烯酸烷酯共聚物或丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯醯胺、多醣、天然樹膠和粘土，亦可考慮親脂性膠凝劑，如改性粘土(如膨潤土)、脂肪酸的金屬鹽、疏水性二氧化矽或矽樹膠。
圖1顯示與肝損害相關的血清參數，包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)濃度。與對照組比較，在每日餵食160-320mg/kg牛樟芝的動物中所有參數均顯示出顯著降低。這意味著每日餵食大於160mg/kg的牛樟芝可提供顯著的肝細胞保護作用。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝。
圖2顯示羥脯胺酸濃度及顯微鏡上天狼星紅陽性區域在對照組及治療組肝臟中的差異比較。此結果顯示在每日餵食160-320mg/kg牛樟芝的動物中肝硬化有明顯改善。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝。
圖3顯示在經牛樟芝治療後，纖維化前期基因的表現量降低。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝。
圖4A及4B顯示在經牛樟芝治療後氧化壓力降低。圖4A顯示抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶)的基因表現量被顯著地上調，尤其是在每日餵食320mg/kg牛樟芝的動物中。圖4B顯示NADPH氧化酶的基因表現量被下調。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝。
圖5顯示肝硬化動物的壽命。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝；wk：週。
圖6顯示在經牛樟芝治療後恢復肝再生能力。ACM 80：每日餵食80mg/kg牛樟芝；ACM 160：每日餵食160mg/kg牛樟芝；ACM 320：每日餵食320mg/kg牛樟芝。
圖7顯示與經DMSO處理之對照組細胞比較，在經各個化合物及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的細胞中其肝細胞損傷參數有顯著降低。
圖8A及8B顯示與經H2O2處理之對照組細胞比較，在經各個化合物(即使為低濃度)及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的細胞中，其以麩胱甘肽濃度及麩胱甘肽：氧化型麩胱甘肽(GSH：GSSG)比率作為氧化壓力標記所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善。
圖9顯示化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物的處理對於初代肝臟星狀細胞中的促纖維化基因(包括α-SMA及TIMP-1)的表現量的影響。
圖10顯示化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物的處理對於初代肝臟星狀細胞中的促纖維化基因(包括Collagen-1及TGF-β)的表現量的影響。
圖11顯示與經轉化生長因子β1(TGFb1)處理過之無限增殖肝臟星狀細胞比較，化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物對於促纖維化基因(包括α-SMA及TIMP-1)表現的防治作用。
圖12顯示與經TGFb1處理過的無限增殖肝臟星狀細胞比較，化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物對於促纖維化基因(包括Collagen-1及TGF-β)表現的防治作用。
圖13顯示分別以溴化去氧尿嘧啶(BrdU)分析試驗及細胞死亡檢測分析試驗來呈現肝臟星狀細胞增殖及細胞凋亡的差異比較以評估高濃度Hepasim的抗纖維化作用。
圖14顯示與對照組比較，包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)濃度之肝損害相關血清參數在每日餵食320mg/kg之牛樟芝及2種化合物的動物中均顯示顯著降低。
圖15顯示羥脯胺酸濃度及顯微鏡上天狼星紅陽性區域在對照組及治療組肝臟中的差異比較，以評估化合物B及C的抗纖維化作用。
圖16顯示在餵食牛樟芝及化合物B及C的動物中，纖維化前期基因(包括Collagen I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表現量顯著降低。
圖17A及17B顯示在餵食牛樟芝及化合物B及C的動物中，抗氧化酶(包 括CuZnSOD、MnSOD、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶)的基因表現量被顯著地上調，且NADPH氧化酶(為產生活性氧物質(ROS)的主要酵素)的基因表現量被顯著地下調。
圖18顯示在以化合物B及C治療的肝硬化動物中，其以麩胱甘肽濃度及麩胱甘肽：氧化型麩胱甘肽(GSH：GSSG)比率作為氧化壓力標記所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善。
圖19顯示與曝露於紫外線之對照組細胞比較，在經各個化合物(即使為低濃度)及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的細胞中，其以穀胱甘肽濃度及GSH：GSSG比率作為氧化壓力標記所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善。
圖20顯示在經化合物B及C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的初代肝臟星狀細胞中，所有4種促纖維化基因的表現量均顯著地被下調。
本發明可能以不同的形式實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1：用於肝纖維化的牛樟芝-對於肝硬化動物以3種不同劑量之牛樟芝施以為期6週之治療 方法 肝硬化動物模式
自國立台灣大學動物中心取得7週齡之雄性Wistar大鼠(150至180公克)。於標準條件下飼養大鼠，所有實驗均在符合國立台灣大學實驗動物照護及使用委員會所制定之「實驗動物照護及使用規範」下被執行。每日給予大鼠二乙基亞硝胺(DEN)溶液(Sigma,St Louis,MO)作為為期9週之主要飲用水，之後換為為期2週之常用水。在第一週以100ppm(容量/容量)做為開始。每週測量一次動物之平均體重，且其飲用水中之二乙基亞硝胺濃度按當週相對於第一週之體重比調整。
萃取物的製備
以CHCl3回流萃取來自台灣善笙生物科技股份有限公司之粉狀牛樟芝菌絲體(ACM)。以無菌之蒸餾水將精細研磨的牛樟芝粉製備成3種不同劑量(80、160及320mg/kg)並於第5到第11週間每日經由胃管餵食大鼠。於第11週時犧牲部分動物並將其肝臟取為樣本以做為病理檢驗及基因表現分析試驗之用。
肝臟再生的計算
在停止施予二乙基亞硝胺溶液2週後(第11週)，以90mg/kg的氯胺酮(ketamine)及5mg/kg的甲苯噻嗪(xylazine)麻醉部分動物。在中線剖腹手術後，將中葉及左側葉切下以完成70%部分肝切除術(PHx)。在手術前後均立刻進行核磁共振影像掃描，並於手術後第7天再次掃描。在每一張1毫米厚之核磁共振切片中以電子繪圖方式畫出肝臟的邊界並自動量測肝的「切面面積」(標準軟體，Advantage Workstation；GE Healthcare, Waukesha,WI)。依據卡瓦列里(Cavalieri)的方法，將所有測量出的肝截面相加會得出總肝體積(表面積[mm2]×切片厚度[mm])。在最後一次的核磁共振影像掃描後，即犧牲這些動物且將其肝臟取樣以用於溴化去氧尿嘧啶(BrdU)染色。
每一隻動物的肝臟再生百分比係以下式計算：肝臟再生百分比=((L7-L0)x 100)/(L-1-L0)
其中L7為第7天的肝體積。L0為部分肝切除術後的即時肝體積且L-1為部分肝切除術前的肝體積。
血清的生化分析
自每一隻小鼠的後眼窩脈管叢收集1毫升的血液樣本並立刻於4℃以1300xg離心，將血漿保存於-20℃以供肝功能測試使用。使用市售之酵素型試劑組及一比色分析儀(Dri-Chem 3000,Fuji Photo Film Co,Tokyo,Japan)來測定丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)的濃度。
測量肝臟中的羥脯 胺酸含量
將羥脯胺酸的濃度定量以測定無腫瘤肝樣本中的肝膠原蛋白含量。簡而言之，用一研杵將肝樣本(介於15到25毫克之間)於含有20毫升6N鹽酸之微量離心管內小心研磨。接著加入額外之6N鹽酸以製備一總體積為30mL/mg的組織並藉此沖下殘留於研杵上的碎塊組織。於120℃將鹽酸 內之研磨組織水解16小時。在冰上短暫降溫之後以8000g離心10分鐘，將上清液移至一新管內；以水補足經蒸發而失去的體積。加入等量之6N氫氧化鈉並混合，使用石蕊試紙將該溶液的酸鹼值調整至pH 4-9。將40微升的中和樣本溶液移至一96孔酶聯免疫吸附試驗(ELISA)盤中並於每一孔中以含有5mL 7%氯胺T(Sigma,St Louis,MO,USA)及20mL醋酸/檸檬酸緩衝液(57g三水合醋酸鈉、37.5g二水合檸檬酸三鈉、5.5g檸檬酸、385mL異丙醇，並溶於水中以達到1公升之最終體積)之溶液使其氧化。之後加入150mL的艾利希溶液(Ehrlich’s solution)。將2g之對二甲氨基苯甲醛(pdimethylamino-benzaldehyde)(Sigma)溶於3mL之60% HClO4(Merck,Darmstadt,Germany)再與9mL之異丙醇混合，以製備艾利希溶液。將最終之混合物於60℃培養35分鐘，然後於室溫下培養10分鐘，用560nm之波長來測定其吸光度。用相同方法來處理含100、80、60、40、20及0mg/mL 4-羥基-L-脯氨酸(Sigma)的標準溶液。其標準曲線在此範圍內為線性(r=0.98)。肝羥脯胺酸濃度值是以每公克溼組織中含多少毫克來呈現。
免疫組織化學及組織染色
將肝樣本以福馬林固定並嵌入於石蠟中以供天狼星紅(Sirius red)染色使用。將肝切片於一苦味酸飽和水溶液(Wako,Osaka,Japan)中以0.1%(重量/體積比)天狼星紅(Sigma,St Louis,MO)染色1小時以偵測肝纖維化。在染色之後，以酸化水[0.5%(重量/重量)冰醋酸於水中]沖洗玻 片2次，再用100%乙醇將玻片脫水3次。在二甲苯中清洗玻片，封於樹脂介質之中，再於光學顯微鏡下觀察。用數位相機系統HC-2500及圖像分析軟件Image-Pro Plus測量天狼星紅陽性區域。在如前所述之70%肝切除術後第7天進行對肝臟的BrdU免疫染色，以偵測部分切除術後的肝再生能力。將切片浸於抗BrdU小鼠單株抗體1：100(MO744殖株BU20A；DAKO Sweden AB)60分鐘，之後浸於二次抗體，即生物素標記抗小鼠多株兔抗體1：400(E0464；DAKO Sweden AB)25分鐘，以進行BrdU染色。之後將切片浸於ABC Vectastain標準套組(PK 6100；Vector Laboratories,Burlingame,CA)30分鐘並與DAB ImmPACT(Vector Laboratories)受質作用5分鐘。將切片以蘇木精(Mayers Hematoxylin；Histolab,Göteborg,Sweden)對比染色。用染色陽性之肝細胞核對肝細胞總數的比率來計算BrdU標記指數。於光學顯微鏡下(400倍)計算切片中15個隨機計數區域的累計平均值。
膠原蛋白表現及氧化壓力的即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析
以約0.5×0.5cm的面積測量大鼠肝組織樣本。用一電動研杵在1mL的TRIzol緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中將每塊組織均質化，再與0.5mL之氯仿/異戊醇(24： 1)混合，於4℃以12,000xg離心10分鐘。將上清液移至一乾淨的管內，加入異丙醇，混合均勻並於-80℃儲存一整夜。將反應混合物於4℃以12,000xg離心30分鐘以產出一RNA粗沉澱物，用70%乙醇清洗沉澱物並使其在空氣中晾乾。使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波長下的吸光值來測量全部RNA的濃度。以一市售之高容量RNA到cDNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)來進行反轉錄反應。按照製造商的使用說明-於37℃反應60分鐘，於95℃反應5分鐘，並維持在4℃，將每20μl反應中的2μg總RNA製成cDNA。將所得到的cDNA調成100ng/μl的最終濃度並構成一基質以供之後實驗所需。用StepOnePlus即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems,USA)來進行即時聚合酶連鎖反應以擴大並偵測基因表現。在含有2μl之樣板DNA、5μl之2X TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl之含探針、前置及反置引子的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反應混合物中分析樣本，其中並使用以下所述之定量聚合酶連鎖反應標靶：(a)大鼠α-SMA，試劑編號Rn01759928_g1、(b)大鼠TIMP-1，試劑編號Rn00587558_m1、(c)大鼠TGF-β，試劑編號Rn00572010_m1、(d)大鼠Collagen I，試劑編號Rn 01463838_m1、(e)大鼠CuZnSOD，試劑編號Rn00566938_m1、(f)大鼠MnSOD，試劑編號Rn00690587_g1、(g)大鼠過氧化氫酶，試劑編號Rn00560930_m1、(h)大鼠麩胱甘肽過氧化物酶，試劑編號Rn00577994_g1、(i)大鼠NADPH氧化酶，試劑編號Rn00585380_m1及(j)大鼠GAPDH，試劑編號 Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH將所有結果標準化以控制mRNA濃度的變異。按照製造商的使用說明，用Ct比較法(△△Ct)進行相對定量。所用之循環條件如下：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，之後以每循環含95℃ 15秒及60℃ 1分鐘進行40個循環。
結果 肝損害參數的改善
在實驗末期，與對照組比較，包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)濃度之肝損害相關血清參數在每日餵食160-320mg/kg牛樟芝的動物中均顯示顯著的降低(圖1)。這意味著每日餵食大於160mg/kg的牛樟芝可提供顯著的肝細胞保護作用。
肝纖維化的改善
比較羥脯胺酸濃度及顯微鏡上天狼星紅陽性區域在對照組及治療組肝臟中的差異以評估牛樟芝的抗纖維化作用。此結果顯示在每日餵食160-320mg/kg牛樟芝的動物中肝硬化有明顯改善(圖2)。
纖維化前期基因表現量的降低
在經牛樟芝治療後，纖維化前期基因(包括α-SMA、TIMP及TGF-β)的表現量在每日餵食160-320mg/kg牛樟芝的動物中顯著降低，並在每日320mg/kg組中觀察到顯著下調的Collagen I基因表現量(圖3)。
氧化壓力的降低
在經牛樟芝治療後，抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶)的基因表現量被顯著地上調，尤其是在每日餵食320mg/kg牛樟芝的動物中。所有這些基因的表現量均顯著地提高，且NADPH氧化酶(產生活性氧物質(ROS)的主要酵素)的基因表現量被下調。這意味著每日以320mg/kg的牛樟芝治療可顯著降低氧化壓力及伴隨的肝纖維化(圖4A及4B)。
延長肝硬化動物的壽命
在誘發肝硬化的過程中，監測部分動物的壽命。經過12週後，所有對照組動物均死亡，然而，經每日餵食80、160、320mg/kg牛樟芝的動物其生存率分別為33%、50%及90%(圖5)。注意到經牛樟芝治療後肝硬化動物的壽命延長，且每日160-320mg/kg之牛樟芝可顯著地延長肝硬化動物的生存。
肝切除術後肝再生能力的恢復
在70%肝切除術後，對照組、每日80、160及320mg/kg牛樟芝組在手術後第7天的生存率分別為12.5%、25%、75%及87.5%。對照組的進食量僅為手術前的55%。然而，治療組的動物在術後第7天並無食慾喪失的跡象。以肝的大小及BrdU陽性面積來呈現肝再生狀況，在每日接受160-320mg/kg牛樟芝治療的動物中，其BrdU標記指數及肝再生百分比均顯示出顯著增加(圖6)。
實施例2：用於肝纖維化的Hepasim-Hepasim的細胞研究
本實驗是被設計來驗證牛樟芝的抗纖維化作用來自Hepasim的假設。
方法 細胞
AML12細胞(小鼠肝細胞)係取自於生物資源保存及研究中心(BCRC)並於含有1%抗黴抗生素(Gibco by Invitrogen)及15%胎牛血清(Gibco by Invitrogen)的DMEM培養液(Dulbecco’s modified Eagle media,Gibco by Invitrogen)中培養。人類肝星狀細胞(HSC)細胞株係取自於美國的ScienCell研究實驗室並於完全培養液，即含2%胎牛血清(ScienCell研究實驗室)、1%星狀細胞生長補充液(ScienCell研究實驗室)及1%青黴素/鏈黴素溶液(ScienCell研究實驗室)的星狀細胞培養液(ScienCell研究實驗室)中培養。TGF-β1可活化肝星狀細胞是習知的，以該肝星狀細胞做為陽性對照組，將肝星狀細胞種於培養盤中24小時，之後將細胞換為含10ng TGF-β1(PeproTech,USA)的培養液。經腹膜內注射氯胺酮及甲苯噻嗪以麻醉C57BL/6小鼠來進行初代肝星狀細胞的分離。將肝上下腔靜脈紮起並以導管插入肝下下腔靜脈。以含0.5mM含EGTA的無鈣鹽溶液原位(in situ)灌注小鼠肝臟(每分鐘8毫升，於37℃ 5分鐘)，再分別以二步驟含0.05%膠原蛋白酶D及鏈黴蛋白酶的緩衝液(Roche Molecular Biochemicals,ndianapolis,Ind)灌注5及10分鐘。於培養皿上將摘下之肝臟輕輕地切碎再於含有蛋白酶的緩衝液中於37℃另外培養25分鐘。之後，用70μm之細 胞過濾器過濾肝臟。將細胞離心並收集，再用8.2% Nycodenz(Accurate Chemical and Scientific Corp.)分離。於37℃含5%二氧化碳的溼潤大氣下培養該細胞株。
Hepasim化合物的製備
Hepasim化合物，亦即下述實驗中之化合物A至E，等同於美國專利號7109232中所揭露之化合物1至5，其亦被稱作Antrodin A-E。
化合物A：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮
化合物B：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮
化合物C：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮
化合物D：(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮
化合物E：(3R*,4R*)-1-經基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮
用以製備此五種化合物的方法與美國專利號7109232中所揭露的方法相同。
應注意到在下列實例中，「化合物D」係指化合物D與化合物E的消旋混合物，且其中化合物D與化合物E的比率 較佳為1：1至2：1。在一實施例中，該化合物D與化合物E的比率為約1.62：1。
Hepasim化合物對於以H 2 O 2 在AML12肝細胞株中所誘發之肝損害的作用
為了測定這些化合物對於H2O2(一種習知的細胞損傷誘導物)作用後的肝細胞的保肝作用，以測量AML12細胞株所分泌的上清液中丙胺酸轉胺酶(ALT)的濃度來檢驗其對肝細胞損害的作用。將細胞於含有不同濃度(3及10μM)Hepasim化合物(A、B、C、及D)的1%胎牛血清中培養72小時再以H2O2處理2小時。用Infinity ALT分析試劑組(Thermo Scientific)來測量上清液中的ALT濃度。
Hepasim化合物處理後之細胞活性氧物質分析試驗
使用一市售套組(# K264-100,BioVision)來測量麩胱甘肽(GSH)及氧化型麩胱甘肽(GSSG)。從這些數據中算出GSH/GSSG的比率。將製造商的使用指引做若干修改以進行該分析。簡言之，立刻將細胞沉澱物(約10毫克)均質化，從每一樣本中取60μl並移至一含過氯酸且事先降溫過的管內，以13,000xg離心2分鐘，收集上清液並儲存在-80℃直到被分析。如製造商所述以進行分析。簡言之，將低溫之3N KOH加入至每一樣本並混合，以13,000xg離心10分鐘。對每一樣本，使用10微升樣本量及適當緩衝液，並用90μl之分析緩衝液來偵測GSH，混合10μl之穀胱甘肽還原酶以偵測總穀胱甘肽，以10μl之GSH淬滅劑來偵測GSSG，於室溫下放置40分鐘，於340/420nm波長下讀取每一樣本之吸光值3分鐘。以DC蛋白 質濃度分析試驗(Bio-Rad)來決定每一樣本的蛋白質濃度。每一樣本的信號以該樣本的蛋白質含量標準化。
細胞之RNA萃取及定量反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
收取呈指數級增長之細胞並將其種於一6孔微量盤中。將每孔中的細胞收集起來並移至裝有1mL TRIzol緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之微量離心管中，然後與0.5mL之氯仿/異戊醇(24：1)混合，將微量離心管於4℃以12,000xg離心10分鐘。將上清液移至一乾淨的管中，加入異丙醇，混合均勻並儲存於-80℃一整夜。將反應混合物於4℃以12,000xg離心30分鐘以產出一RNA粗沉澱物，用70%乙醇清洗沉澱物並使其在空氣中晾乾。用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波長下的吸光值來測量總RNA的濃度。
以一市售之高容量RNA到cDNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)來進行反轉錄反應。按照製造商的使用說明-於37℃反應60分鐘，於95℃反應5分鐘，並維持在4℃，將每20μl反應中的2μg總RNA製成cDNA。將所得到的cDNA調成100ng/μl的最終濃度並構成一基質以供之後實驗所需。
用StepOnePlus即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems,USA)來進行即時聚合酶連鎖反應以擴大並偵測基因表現。在含有2μl之樣板DNA、5μl之2X TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl之含探針、前置及反置引子的 20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反應混合物中分析樣本，其中並使用以下所述之定量聚合酶連鎖反應標靶：(a)α-SMA，試劑編號Rn01759928_g1、(b)TIMP-1，試劑編號Rn00587558_m1、(c)TGF-β1，試劑編號Rn00572010_m1、(d)Collagen I，試劑編號Rn 01463838_m1、(e)GAPDH，試劑編號Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH將所有結果標準化以控制mRNA濃度的變異。按照製造商的使用說明，用Ct比較法(△△Ct)進行相對定量。所用之循環條件如下：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，之後以每循環含95℃ 15秒及60℃ 1分鐘進行40個循環。
Hepasim化合物對初代肝星狀細胞內促纖維化基因表現的防治作用
在不使用任何促纖維化試劑的情況下，於含有10%胎牛血清的DMEM培養液中將小鼠初代肝星狀細胞培養7天以達全面活化。在自然情況下細胞將會在7天之內被自發性地活化至纖維化。使細胞與兩種不同濃度之Hepasim化合物接觸72小時。之後萃取其RNA並接著以即時定量PCR測量Collagen-1、TGF-β1、α-SMA及TIMP-1的mRNA。
Hepasim化合物對於經重組TGF-β處理過之無限增殖肝星狀細胞的促纖維化基因表現的抑制作用
為了檢驗Hepasim化合物對於經TGF-β處理過之肝星狀細胞的額外抗纖維化作用，將未活化之肝星狀細胞以每孔5x105個細胞的數量種於一6孔培養盤中，並以含10%胎牛血清之DMEM培養液培養7天。將培養液換成 含1%胎牛血清及各種不同濃度的Hepasim化合物且不含任何促纖維化試劑之DMEM培養液額外培養72小時，接著以促纖維化試劑TGF-β(3ng/ml)額外處理48小時。用定量即時聚合酶連鎖反應來測量Collagen-1、TGF-β、α-SMA及TIMP-1的mRNA量。
以BrdU分析試驗及WST-1分析試驗來分析細胞增殖
細胞增殖ELISA及BrdU套組係被設計來定量細胞增殖，基於測量增殖細胞於合成DNA過程中對BrdU的吸收。簡言之，將細胞以每孔10,000個細胞種於含有100μl培養液的一96孔盤(Nunc,Denmark)中並培養24小時以使細胞附著，之後以3種不同濃度(8μM、24μM及80μM)的化合物A、B、C或D與其作用24小時、48小時及72小時，並將該培養盤培養於37℃。在培養過後，以每孔10μl之BrdU(Roche Diagnostic Inc.)標記培養液並將細胞於37℃繼續培養16小時。用離心機以200xg離心10分鐘以去除標記的培養液並將其吹乾。用200μl之FixDenat溶液固定細胞並於室溫下培養30分鐘。將FixDenat溶液移除，加入100μl之抗BrdU-POD並於室溫下培養90分鐘。培養結束後，以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗微孔盤3次並加入100μl之基質溶液培養30分鐘。加入終止溶液(25μl之1M H2SO4)並用ELISA分析儀在450nm波長下測量該樣本之吸光值。
細胞凋亡
用一偵測細胞死亡之ELISA套組(Roche Diagnostic Inc.)以一三明治免疫分析試驗系統來偵測細胞凋亡。使用基於三明治酵素免疫分析試驗的 方法，Roche細胞死亡偵測ELISA套組可在質與量上偵測到一給定樣本中被切開的DNA/組織蛋白複合物(核小體)的量。將細胞(每孔10,000個細胞)種於含100μl培養液的一96孔盤(Nunc,Denmark)中並培養24小時以使細胞附著，之後以3種不同濃度(8μM、24μM及80μM)的化合物A、B、C或D與其作用24小時、48小時及72小時，並將該培養盤培養於37℃。培養後，將該96孔盤以200xg離心10分鐘並去除拋棄上清液，接著用多道移液管(multipipetman)於每孔加入200μl之裂解緩衝液並於室溫下培養30分鐘，以200xg離心力將微孔盤中的溶解產物離心10分鐘。在離心過後，將20μl之上清液移至塗有鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)的微孔盤中，再將80μl的免疫試劑加入至每一孔中。將微孔盤以粘合箔(adhesive foil)蓋住並培養於一振盪器上於室溫下輕輕搖動2小時。培養過後，以250-300μl之培養緩衝液清洗微孔盤3次並加入100μl之ABTS溶液培養30分鐘或直到顏色呈現足以進行光度測量的程度。將ABTS終止溶液加入並用ELISA分析儀在450nm波長下測量該樣本之吸光值，參考波長為490nm。
結果 肝損害參數的改善
與DMSO處理過的對照組細胞比較，在經各個化合物處理過的細胞中，其有關肝損害的主要參數丙胺酸轉胺酶(ALT)有顯著的下降。這意味著不論是低(3μM)或高(10μM)濃度的化合物A至D都有顯著的肝 細胞保護作用，且發現H2O2引起之肝損害的改善與所有4種化合物具有劑量依賴關係(圖7)。
Hepasim化合物處理後的細胞活性氧物質分析試驗
與經H2O2處理之對照組細胞比較，在經各個化合物(即使為低濃度)處理過的細胞中，其以穀胱甘肽濃度及作為氧化壓力標記的GSH：GSSG比率所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善。這意味著不論是低(3μM)或高(10μM)濃度的化合物A至D透過清除自由基而達到顯著的肝細胞保護作用(圖8A及8B)。
Hepasim化合物在初代肝臟星狀細胞中對於促纖維化基因表現的防治作用
圖9顯示化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物的處理對於初代肝臟星狀細胞中的促纖維化基因(包括α-SMA及TIMP-1)的表現量的影響。化合物B及C被發現具有劑量依賴效應。
圖10顯示化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物的處理對於初代肝臟星狀細胞中的促纖維化基因(包括Collagen-1及TGF-β)的表現量的影響。化合物B及C被發現具有劑量依賴效應。
Hepasim化合物在經重組TGF-β1處理後之無限增殖肝星狀細胞中對於其促纖維化基因表現的抑制作用
圖11顯示與經轉化生長因子β1(TGFb1)處理過之無限增殖肝臟星狀細胞比較，化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物對於促纖維化基因(包 括α-SMA及TIMP-1)表現的防治作用。化合物B及C被發現具有劑量依賴效應。
圖12顯示與經TGFb1處理過的無限增殖肝臟星狀細胞比較，化合物A至D及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物對於促纖維化基因(包括Collagen-1及TGF-β)表現的防治作用。化合物B及C被發現具有劑量依賴效應。
較高濃度的Hepasim對肝星狀細胞的治療作用
以BrdU分析試驗及細胞死亡檢測分析試驗分別來比較肝星狀細胞增殖及細胞凋亡的差異，以評估較高濃度Hepasim(24-80μM)的抗纖維化作用。其結果顯示在經化合物B及C處理過的子組中明顯的肝星狀細胞凋亡現象及對其增殖的抑制作用，高濃度(80μM)之化合物D展現相同但較遲(72小時後)的作用(圖13)。相較於其他化合物，化合物B展現最強的作用。
結論
細胞研究的總結顯示所有化合物均對肝損害有明顯的保護作用。化合物B及C也展現對經TGF-β處理過之無限增殖肝星狀細胞及初代肝星狀細胞的抗纖維化作用。根據所有活體外實驗，化合物B及C是做為為了進一步決定抗纖維化之活體內實驗的候選物。
實施例3：用於肝纖維化之Hepasim-化合物B及C的抗纖維化作用的動物實驗
化合物B及C在細胞研究中展現最強的抗纖維化作用。進一步針對化合物B及C的動物實驗是被設計用以再次評定該兩種化合物在臨床上對於肝硬化的效用。
方法 肝硬化動物模式
自國立台灣大學動物中心取得7週齡之雄性Wistar大鼠(150至180公克)。於標準條件下飼養大鼠，所有實驗均在符合國立台灣大學實驗動物照護及使用委員會所制定之「實驗動物照護及使用規範」下被執行。每日給予大鼠二乙基亞硝胺(DEN)溶液(Sigma,St Louis,MO)作為為期9週之主要飲用水，之後換為為期2週之常用水。在第一週以100ppm(容量/容量)做為開始。每週測量一次動物之平均體重，且其飲用水中之二乙基亞硝胺濃度按當週相對於第一週之體重比調整。
Hepasim化合物的製備
如以上實施例2中所述，Hepasim化合物(亦即化合物A至E)等同於美國專利號7109232中所揭露之化合物1至5。用以製備Hepasim化合物的方法與美國專利號7109232中所揭露的方法相同。
Hepasim化合物B及C係萃取自牛樟芝。以無菌蒸餾水製備精製的化合物B(7mg/kg)、C(14mg/kg)及320mg/kg之牛樟芝並於第5至第11 週以一胃管每日分別餵食大鼠。於第11週時犧牲部分動物並將其肝臟取樣以做為病理檢驗及基因表現分析試驗之用。
血清的生化分析
自每一隻小鼠的後眼窩脈管叢收集1毫升的血液樣本並立刻於4℃以1300xg離心，將血漿保存於-20℃以供肝功能測試使用。使用市售之酵素型試劑組及一比色分析儀(Dri-Chcm 3000,Fuji Photo Film Co,Tokyo,Japan)來測定丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)的濃度。
測量肝臟中的羥脯胺酸含量
將羥脯胺酸的濃度定量以測定無腫瘤肝樣本中的肝膠原蛋白含量。簡言之，用一研杵將肝樣本(介於15到25毫克之間)於含有20毫升6N鹽酸之微量離心管內小心研磨。接著加入額外之6N鹽酸以製備一總體積為30mL/mg的組織並藉此沖下殘留於研杵上的碎塊組織。於120℃將鹽酸內之研磨組織水解16小時。在冰上短暫降溫之後以8000g離心10分鐘，將上清液移至一新管內；以水補足經蒸發而失去的體積。加入等量之6N氫氧化鈉並混合，使用石蕊試紙將該溶液的酸鹼值調整至pH 4-9。將40微升的中和樣本溶液移至一96孔酶聯免疫吸附試驗(ELISA)盤中並於每一孔中以含有5mL 7%氯胺T(Sigma,St Louis,MO,USA)及20mL醋酸/檸檬酸緩衝液(57g三水合醋酸鈉、37.5g二水合檸檬酸三鈉、5.5g檸檬酸、385mL異丙醇，並溶於水中以達到1公升之最終體積)之溶液使其氧化。 之後加入150mL的艾利希溶液(Ehrlich’s solution)。將2g之對二甲氨基苯甲醛(pdimethylamino-benzaldehyde)(Sigma)溶於3mL之60% HClO4(Merck,Darmstadt,Germany)再與9mL之異丙醇混合，以製備艾利希溶液。將最終之混合物於60℃培養35分鐘，然後於室溫下培養10分鐘，用560nm之波長來測定其吸光度。用相同方法來處理含100、80、60、40、20及0mg/mL 4-羥基-L-脯氨酸(Sigma)的標準溶液。其標準曲線在此範圍內為線性(r=0.98)。肝羥脯胺酸濃度值是以每公克溼組織中含多少毫克來呈現。
免疫組織化學及組織染色
將肝樣本以福馬林固定並嵌入於石蠟中以供天狼星紅(Sirius red)染色使用。將肝切片於一苦味酸飽和水溶液(Wako,Osaka,Japan)中以0.1%(重量/體積比)天狼星紅(Sigma,St Louis,MO)染色1小時以偵測肝纖維化。在染色之後，以酸化水[0.5%(重量/重量)冰醋酸於水中]沖洗玻片2次，再用100%乙醇將玻片脫水3次。在二甲苯中清洗玻片，封於樹脂介質之中，再於光學顯微鏡下觀察。用數位相機系統HC-2500及圖像分析軟件Image-Pro Plus測量天狼星紅陽性區域。
膠原蛋白表現及氧化壓力的即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應分析
以約0.5×0.5cm的面積測量大鼠肝組織樣本。用一電動研杵在1mL的TRIzol緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中將每塊組織均質化，再與0.5mL之氯仿/異戊醇(24：1)混合，於4℃以12,000xg離心10分鐘。將上清液移至一乾淨的管內，加入異丙醇，混合均勻並於-80℃儲存一整夜。將反應混合物於4℃以12,000xg離心30分鐘以產出一RNA粗沉澱物，用70%乙醇清洗沉澱物並使其在空氣中晾乾。使用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,USA)以在260nm波長下的吸光值來測量全部RNA的濃度。以一市售之高容量RNA到cDNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)來進行反轉錄反應。按照製造商的使用說明-於37℃反應60分鐘，於95℃反應5分鐘，並維持在4℃，將每20μl反應中的2μg總RNA製成cDNA。將所得到的cDNA調成100ng/μl的最終濃度並構成一基質以供之後實驗所需。用StepOnePlus即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems,USA)來進行即時聚合酶連鎖反應以擴大並偵測基因表現。在含有2μl之樣板DNA、5μl之2X TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl之含探針、前置及反置引子的20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反應混合物中分析樣本，其中並使用以下所述之定量聚合酶連鎖反應標靶：(a)大鼠α-SMA，試劑編號Rn01759928_g1、(b)大鼠TIMP-1，試劑編號Rn00587558_m1、(c)大鼠TGF-β1，試劑編號Rn00572010_m1、(d)大鼠Collagen I，試劑編號Rn 01463838_m1、(e)大鼠CuZnSOD，試劑編號Rn00566938_m1、(f)大鼠MnSOD，試劑編號 Rn00690587_g1、(g)大鼠過氧化氫酶，試劑編號Rn00560930_m1、(h)大鼠麩胱甘肽過氧化物酶，試劑編號Rn00577994_g1、(i)大鼠NADPH氧化酶，試劑編號Rn00585380_m1及(j)大鼠GAPDH，試劑編號Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH將所有結果標準化以控制mRNA濃度的變異。所用之循環條件如下：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，之後以每循環含95℃ 15秒及60℃ 1分鐘進行40個循環。
結果 肝損害參數之改善
在實驗結束時，與對照組比較，包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、總膽紅素及麩胺醯轉肽脢(γ-GT)濃度之肝損害相關血清參數在每日餵食320mg/kg之牛樟芝及兩種化合物的動物中均顯示顯著降低(圖14)。這意味著化合物B及C有顯著的肝細胞保護作用。
肝纖維化的改善
比較羥脯胺酸濃度及顯微鏡上天狼星红陽性區域在對照組及治療組肝臟中的差異，以評估化合物B及C的抗纖維化作用。此結果顯示在以牛樟芝及化合物B及C餵食的動物中肝硬化有明顯的改善(圖15)。
纖維化前期基因表現量的降低
在餵食牛樟芝及化合物B及C的動物中，纖維化前期基因(包括Collagen I、α-SMA、TIMP-1及TGF-β)的表現量顯著降低(圖16)。
氧化壓力的降低
經治療之後，抗氧化酶(包括CuZnSOD、MnSOD、過氧化氫酶及麩胱甘肽過氧化物酶)的基因表現量在餵食牛樟芝及化合物B及C的動物中被顯著地上調，且NADPH氧化酶(為產生活性氧物質(ROS)的主要酵素)的基因表現量被顯著地下調(圖17A及17B)。
在以化合物B及C治療的肝硬化動物中，其以麩胱甘肽濃度及麩胱甘肽：氧化型麩胱甘肽(GSH：GSSG)比率作為氧化壓力標記所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善(圖18)。這意味著以化合物B及C治療可顯著降低氧化壓力及伴隨之肝纖維化。
結論
動物實驗的總結表示化合物B及C可在肝硬化動物中展現一抗纖維化作用並做為一良好的自由基清除物，化合物B及C亦可降低肝臟中的氧化壓力。
實施例4：用於皮膚損害的Hepasim-Hepasim的細胞研究
本實驗是被設計來驗證牛樟芝的抗纖維化及抗氧化作用係來自於Hepasim的假設。探究Hepasim在抑制疤痕的過度形成及在治療如氧化還原反應及曝露於紫外線下對皮膚造成的物理傷害的可能角色。在此實施例中，使用真皮纖維母細胞CG1639及皮膚角質細胞來研究Hepasim對皮膚 的作用。真皮纖維母細胞為生長在皮膚真皮層內的細胞，負責生成結締組織及使皮膚從傷害中恢復。
方法 細胞
真皮纖維母細胞株CG1639係取自於生物資源保存及研究中心(BCRC)並於含有1%抗黴抗生素(Gibco,Invitrogen)及15%胎牛血清(Gibco,Invitrogen)的DMEM培養液(Gibco,Invitrogen)中培養。大鼠胎兒皮膚角質細胞(FRSK細胞株)係取自於日本衛生科學研究資源庫(HSRRB)並於含有10%胎牛血清(Gibco,Invitrogen)及1%抗黴抗生素(Gibco,Invitrogen)的EMEM培養液(Eagle’s minimal essential media,Gibco,Invitrogen)中培養。B16F10細胞為一種齧齒類動物黑色素瘤細胞株，係購自於美國典型培養物保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)並於含有10%胎牛血清(FBS；HyClone Lab.Inc.,Logan,UT)、0.02%抗黴抗生素溶液(青黴素，每毫升10000單位；鏈黴素，每毫升10000μg及雙性殺黴素B，每毫升25μg；Invitrogen,Carlsbad,CA)的EMEM培養液(Eagle’s Minimum Essential Medium；Sigma,St.Louis,MO)中培養。於37℃含5%二氧化碳的潮濕大氣下培養此三種細胞株。
Hepasim化合物的製備
如上面實施例2中所述，Hepasim化合物(亦即化合物A至E)等同於美國專利號7109232中所揭露之化合物1至5。用以製備Hepasim化合物的方法與美國專利號7109232中所揭露的方法相同。
應注意到在下列實例中，「化合物D」係指化合物D與化合物E的消旋混合物，且其中化合物D與化合物E的比率較佳為1：1至2：1。在一實施例中，該化合物D與化合物E的比率為約1.62：1。
Hepasim化合物對經紫外線照射過之黑色素瘤細胞及角質細胞的作用
為了探究直接紫外線照射對黑色素生成及氧化壓力的誘發，於一HANKS’平衡鹽溶液(Sigma)中以8 J cm-2之紫外線A(UVA；FL15BLB,352nm,15W；Toshiba,Tokyo,Japan)及10mJ cm-2之紫外線B(UVB；G15T8E,306nm,15W；Sankyo Denki,Tokyo,Japan)照射黑色素瘤細胞及角質細胞。用一UVX模式數位輻射計(Model UVX Digital Radiometer；UVP Inc.,Upland,CA)來測量紫外線的強度。
在紫外線A照射之前，將兩種不同濃度(3或10μM)之Hepasim化合物A至D與B16F10及FRSK細胞作用72小時。將DMEM培養液換成磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)以避免在紫外線照射前生成源自培養液的毒性光照產物。於紫外線A照射24小時後收集細胞並進行分析試驗。以離心將收集之細胞沉澱並使其在含50mM Tris-HCl、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1%(v/v)Triton X-100、苯甲基磺醯氟(PMSF)(100mg/ml) 及胃蛋白酶抑制物(pepstatin A)(1mg/ml於DMSO中)及亮肽素(leupeptin)(1mg/ml於水中)且pH值為6.8的溶解緩衝液中溶解以製備細胞溶解物。以10,000rpm將細胞離心10分鐘並收集所有細胞溶解物且儲存於-80℃。
黑色素含量分析試驗
為測量黑色素含量，在冰上用超音波將B16F10細胞震碎並將該混合物離心(25000g，10分鐘，4℃)。將上清液移除並於60℃將沉澱物溶解於0.85N KOH中20分鐘。同時間並培養標準黑色素(Sigma)。接著以405nm波長的吸光值進行黑色素含量的分光光度分析。
酪胺酸酶活性分析試驗
測量L-DOPA的氧化速率來評估暴露在紫外線下之B16F10細胞的酪胺酸脢活性。如以下所述來進行該分析試驗，將作為受質之20mM L-DOPA加入96孔盤內的每個細胞溶解物中，於37℃每隔10分鐘用一分光光度計於475nm的波長以分光光度法測量多巴色素(dopachrome)形成的吸光值達1小時。與酪胺酸脢(2034U/mg)標準曲線比較以計算酪胺酸脢活性並以每毫克蛋白質多少單位來表示。用未照射且未經處理之對照組細胞的酪胺酸脢活性(每毫克蛋白質多少單位)的百分比(100%)來表示數據。
經紫外線照射之角質細胞的細胞活性氧物質分析試驗
用一市售之套組(# K264-100,BioVision)來測量麩胱甘肽(GSH)及氧化型麩胱甘肽(GSSG)。從這些數據中決定GSH/GSSG比率。將製造 商的使用指引做若干修改以進行該分析。簡言之，立刻將細胞沉澱物(約10毫克)均質化，從每一樣本中取60μl並移至一含過氯酸且事先降溫過的管內，以13,000xg離心2分鐘，收集上清液並儲存在-80℃直到被分析。如製造商所述以進行分析。簡言之，將低溫之3N KOH加入至每一樣本並混合，以13,000xg離心10分鐘。對每一樣本，使用10微升樣本量及適當緩衝液，並用90μl之分析緩衝液來偵測GSH，混合10μl之穀胱甘肽還原酶以偵測總穀胱甘肽，以10μl之GSH淬滅劑來偵測GSSG，於室溫下放置40分鐘，於340/420nm波長下讀取每一樣本之吸光值3分鐘。以DC蛋白質濃度分析試驗(Bio-Rad)來決定每一樣本的蛋白質濃度。每一樣本的信號以該樣本的蛋白質含量標準化。
細胞之RNA萃取及定量反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
以一市售之高容量RNA到cDNA套組(High Capacity RNA-to-cDNA Kit)(Applied Biosystems,USA)來進行反轉錄反應。按照製造商的使用說明一於37℃反應60分鐘，於95℃反應5分鐘，並維持在4℃，將每20μl反應中的2μg總RNA製成cDNA。將所得到的cDNA調成100ng/μl的最終濃度並構成一基質以供之後實驗所需。
用StepOnePlus即時聚合酶連鎖反應系統(Applied Biosystems,USA)來進行即時聚合酶連鎖反應以擴大並偵測基因表現。在含有2μl之樣板DNA、5μl之2X TaqMan PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)、0.5μl之含探針、前置及反置引子的 20X分析混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Foster City,CA,USA)的10μl反應混合物中分析樣本，其中並使用以下所述之定量聚合酶連鎖反應標靶：(a)α-SMA，試劑編號Rn01759928_g1、(b)TIMP-1，試劑編號Rn00587558_m1、(c)TGF-β1，試劑編號Rn00572010_m1、(d)Collagen I，試劑編號Rn 01463838_m1、(e)GAPDH，試劑編號Rn1462662_g1。以管家基因GAPDH將所有結果標準化以控制mRNA濃度的變異。按照製造商的使用說明，用Ct比較法(△△Ct)進行相對定量。所用之循環條件如下：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，之後以每循環含95℃ 15秒及60℃ 1分鐘進行40個循環。
Hepasim化合物對真皮纖維母細 胞株內促纖維化基因表現的防治作用
以兩種不同濃度之Hepasim化合物與真皮纖維母細胞(CG1639細胞)作用72小時。之後萃取其RNA並接著以即時定量PCR測量Collagen-1、TGF-β1、α-SMA及TIMP-1的mRNA。
結果 Hepasim抑制紫外線照射後的黑色素生成
藉由研究紫外線照射對B16F10細胞內黑色素含量的影響來確定Hepasim的抗黑色素生成作用。未經紫外線照射的B16F10細胞顯示每毫克蛋白質含7.4±0.3μg的黑色素量，經紫外線光源照射過的B16F10細胞的黑色素生成量則大幅增加了33.80±4.6%(P<0.001)。在紫外線照射之前給予10μM Hepasim化合物B及C使得黑色素形成降低(化合物B：29.40± 4.3%；化合物C：28.92±5.3%)，經化合物A及D作用過的黑色素腫瘤細胞亦顯示黑色素含量降低(化合物A：23.25±5.5%，P=0.04；化合物D：26.32±2.3%，P=0.037)。
進一步探討該抗黑色素生成作用是否來自於其對酪胺酸酶(黑色素合成的速率限制步驟酵素)的抑制作用。在未經紫外線照射的對照組細胞中，B16F10細胞經觀察含有每毫克蛋白質3.0±0.5單位。紫外線照射在B16F10細胞中顯示其導致52.55±4.36%(P<0.001)酪氨酸酶活性的增加。以3及10μM的化合物A至D處理，在B16F10細胞內，針對紫外線調控的酪胺酸酶活性，可達到濃度依賴的保護作用(3μM化合物A：43.50±3.5%；10μM化合物A：26.75±2.3%；3μM化合物B：51.65±4.6%；10μM化合物B：42.32±6.7%；3μM化合物C：48.55±3.7%；10μM化合物C：40.55±3.9%；3μM化合物D：38.5±4.5%；10μM化合物D：29.25±2.6%)。
經Hepasim化合物處理後的細胞活性氧物質分析試驗
與曝露於紫外線之對照組細胞比較，在經各個化合物(即使為低濃度)及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的細胞中，其以穀胱甘肽濃度及GSH：GSSG比率作為氧化壓力標記所呈現的氧化還原狀態有顯著的改善(圖19)。這意味著不論是低(3μM)或高(10μM)濃度的化合物A至D，均透過清除自由基而達到顯著的角質細胞保護作用。
Hepasim化合物對真皮纖維母細胞內促纖 維化基因表現的防治作用
在經化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理過的真皮纖維母細胞中，所有4種促纖維化基因的表現量均顯著地被下調，且化合物B及C被發現有劑量依賴效應(圖20)。
結論
細胞研究的總結顯示所有化合物均對氧化壓力(如陽光照射)對角質細胞的損害有顯著的保護作用。化合物B及C也展現對真皮纖維母細胞的抗纖維化作用。這意味著其具有預防肥厚性疤痕形成的潛力。在紫外線照射的活體外(in vitro)實驗中，Hepasim化合物展現出降低細胞內黑色素累積的能力，且看起來可做為進一步抗黑色素生成之活體內實驗的候選物，並應將高劑量列入考量。
實施例5：牛樟芝菌絲體的萃取物 水萃取物
將牛樟芝的發酵菌絲體加入85℃熱水中(菌絲體與水的重量比為1：5)並均勻地攪拌4小時。接著將該反應混合物冷卻至30℃並使用一分離器分離液體。將該液體藉由真空蒸發濃縮以得到牛樟芝菌絲體水萃取物。
乙醇萃取物
將牛樟芝的發酵菌絲體加入乙醇中(菌絲體與乙醇的重量比為1：5)，加熱至60-65℃並攪拌。接著將該反應混合物冷卻至40℃並使用一分離器分離液體。將該液體藉由真空蒸發濃縮以得到牛樟芝菌絲體乙醇萃取物。
在一例示性實施例中，牛樟芝菌絲體乙醇萃取物中Hepasim化合物的比例係如下所示：化合物A：13.13%；化合物B：0.52%；化合物C：20.8%；化合物D：9.47%；化合物E：5.85%。
牛樟芝菌絲體係以深層液態發酵預先準備，如T.L.M.Stamford等人所發表之Food Science“Protein enrichment of cashew wastes for animal feeds”，可參見http：//www.unu.edu/unupress/food/8F101e/8F101E0b.htm。
牛樟芝菌絲體(ACM)乙醇萃取物係用於部份前述實施例的分析試驗中，且實驗數據係顯示於圖7-12、19-20。所有的實驗方法均相同，除了把Hepasim化合物替換為牛樟芝菌絲體乙醇萃取物。
實施例6：疤痕形成的動物模式 動物模式
建立肥厚性疤痕的兔耳模式。簡言之，準備12隻紐西蘭白兔(體重2.5-3.0公斤)以用來在無菌條件下使其受傷。使用1cm的穿刺活檢工具在每隻耳朵的腹側軟骨下創造四個全層厚1cm的圓形傷口。接著用手術刀片將軟骨膜從軟骨切下。將濃度為1% w/v的試驗試劑(包括化合物B、C及 牛樟芝菌絲體乙醇萃取物)每日施予至實驗組的傷口(每個傷口10mL)持續14天，而對照組則接受等量的1% w/v生理食鹽水。
膠原蛋白I及膠原蛋白III的定量
使用ELISA套組(R & D Systems Inc.,Minneapolis,MN,USA)根據操作手冊進行膠原蛋白I及膠原蛋白III的定量。
西方墨點轉漬法(Western Blot)
溶解疤痕組織，然後將蛋白質試樣變性，然後在10.6%聚丙烯醯胺凝膠上分離，並轉移至聚偏二氟乙烯膜。將膜於室溫下培養在含5%脫脂牛奶和0.05%Tween-20的TBS中1小時，並以初級抗體(稀釋度1：300)於4℃處理一整夜。隔天以TBST清洗該膜15分鐘。隨後，將該膜與結合有辣根過氧化物酶的AffiniPure山羊抗兔抗體(稀釋度1：3000)於室溫下培養1小時並以TBST清洗21分鐘。接著使用ECL偵測該膜。進一步以Quantity One軟體4.1.1(Bio-Rad,Hercules,CA)分析西方墨點轉漬法的結果。
結果 化合物B、C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物在兔耳模型上減緩疤痕的形成
所有的傷口均有足夠的疤痕成熟並顯示結疤的組織學證據。對照組的平均疤痕厚度(SEI)為3.71±0.31，其顯著地高於以化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理的組別(在第14天的平均疤痕厚度分別為1.93±0.51、2.10±0.24及2.13±0.44，P<0.05)。對照組的平均表皮厚度(ETI) 為5.08±0.44，而化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理組的平均表皮厚度則分別為2.23±0.31,3.10±0.14及3.35±0.24(P<0.05)。這表示經化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理的傷口，其表皮厚度顯著減少。
在組織學上，對照組疤痕的真皮層顯著增厚，且真皮內乳突層和網狀層之間的邊界是模糊的；膠原纖維密集而膠原束錯亂，細胞數目亦增加。而經化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理14天的疤痕的表皮基底層則是平整的，真皮層中沒有顯著增厚，膠原纖維排列良好，且細胞數目很少。
測試劑對膠原蛋白I及膠原蛋白III合成的影響
為了評估測試劑對基質生成的分子影響，測量膠原蛋白I及膠原蛋白III(其構成了大部分的疤痕細胞外基質)的蛋白密度。如同預期，在化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理組中，膠原蛋白I的密度在第14天顯著減少(p<0.05)，而膠原蛋白III的密度雖然在第7天沒有顯著減少但在第14天有顯著減少(p<0.05)。
測試劑對α-SMA及TGF-β1表現量的效果
肌纖維母細胞的持續存在是肥厚型疤痕的一個顯著特點，其有助於過多的基質生產。西方墨點轉漬法分析顯示在化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理組中α-SMA的表現量與對照組相比減少(p<0.05)。 西方墨點轉漬法分析亦顯示在化合物B、化合物C及牛樟芝菌絲體乙醇萃取物處理組中第14天的TGF-β1表現量與對照組相比顯著減少(p<0.05)。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之化合物、組合物、萃取物及混合物、其製造程序與方法及其用途乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已 根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

Claims (8)

  1. 一種混合物在製備用於美白皮膚的醫藥品或化妝品的用途，其中該混合物包含牛樟芝發酵菌絲體之有機溶劑萃取物作為美白的活性成分，其中該萃取物包含至少一種選自由以下所組成群組之化合物：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，其中該3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮與(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮之混合物的濃度係等於或大於3μM。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該牛樟芝發酵菌絲體係由深層液態發酵製備。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其係用於製備外用化妝品或皮膚製劑。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其抑制酪胺酸酶及黑色素的生成。
  5. 一種混合物在製備用於對抗由氧化壓力造成的皮膚老化的醫藥品或化妝品的用途，其中該混合物包含牛樟芝發酵菌絲體之有機溶劑萃取物作為對抗由氧化壓力造成的皮膚老化的活性成分，其中該萃取物包含至少一種選自由以下所組成群組之化合物：3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮、及(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮，其中該3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]呋喃-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-1-醇-2,5-二酮、或(3R*,4S*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮與(3R*,4R*)-1-羥基-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯烷-2,5-二酮之混合物的濃度係等於或大於3μM。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該牛樟芝發酵菌絲體係由深層液態發酵製備。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其係用於製備外用化妝品或皮膚製劑。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該氧化壓力係由紫外線照射引發。
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