CN112010942A - 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 - Google Patents
一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112010942A CN112010942A CN202010889790.9A CN202010889790A CN112010942A CN 112010942 A CN112010942 A CN 112010942A CN 202010889790 A CN202010889790 A CN 202010889790A CN 112010942 A CN112010942 A CN 112010942A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- actinomycin
- mobile phase
- supercritical
- volume ratio
- ethanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 118
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 108700004665 actinomycin X Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title description 13
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- ZGROOAYIFKLEPE-IRFLANFNSA-N actinomycin X2 Chemical compound CC(C)[C@H](C(N(CCC1)[C@@H]1C(N(C)CC(N(C)[C@@H](C(C)C)C(O[C@H](C)[C@@H]1NC(C(C(C(OC2=C(C)C=C3)=C(C)C4=O)=NC2=C3C(N[C@@H]([C@@H](C)OC([C@H](C(C)C)N(C)C(CN(C)C([C@H](CC(C2)=O)N2C([C@@H](C(C)C)N2)=O)=O)=O)=O)C2=O)=O)=C4N)=O)=O)=O)=O)=O)NC1=O ZGROOAYIFKLEPE-IRFLANFNSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 108700037376 actinomycin X2 Proteins 0.000 claims abstract description 40
- GQZJMUMSSGCVFS-UHFFFAOYSA-N actinomycin-X2 Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CC(=O)CN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 GQZJMUMSSGCVFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- ZGROOAYIFKLEPE-UHFFFAOYSA-N isoactinomycin-X2 Natural products CC(C)C1NC(=O)C(NC(=O)C2=C(N)C(=O)C(=C3Oc4c(C)ccc(C(=O)NC5C(C)OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C6CC(=O)CN6C(=O)C(NC5=O)C(C)C)c4N=C23)C)C(C)OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C7CCCN7C1=O ZGROOAYIFKLEPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000004808 supercritical fluid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 25
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 25
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 22
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 claims description 15
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 14
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 11
- 241000208341 Hedera Species 0.000 claims description 10
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 10
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 8
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- NOTFZGFABLVTIG-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylethyl acetate Chemical compound CC(=O)OCCC1CCCCC1 NOTFZGFABLVTIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 5
- 239000005955 Ferric phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 229940032958 ferric phosphate Drugs 0.000 claims description 4
- WBJZTOZJJYAKHQ-UHFFFAOYSA-K iron(3+) phosphate Chemical compound [Fe+3].[O-]P([O-])([O-])=O WBJZTOZJJYAKHQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229910000399 iron(III) phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 6
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 5
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- NTWLPZMPTFQYQI-UHFFFAOYSA-N (3alpha)-olean-12-ene-3,23-diol Natural products C1CC(O)C(C)(CO)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C)CCC(C)(C)CC5C4=CCC3C21C NTWLPZMPTFQYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- YXZUDXLWSOZHFN-UHFFFAOYSA-N 2,3-diethylpyridine Chemical group CCC1=CC=CN=C1CC YXZUDXLWSOZHFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000709675 Coxsackievirus B3 Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 241000269335 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 244000258271 Galium odoratum Species 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- 241001397616 Influenza A virus (H1N1) Species 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 206010025598 Malignant hydatidiform mole Diseases 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000044183 Streptomyces sp. MS449 Species 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N aminyl Chemical compound [NH2] MDFFNEOEWAXZRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088547 cosmegen Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000000686 lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012029 structural testing Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001052 yellow pigment Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及化合物制备领域，具体涉及一种使用超临界流体色谱制备放线菌素D和X2方法，包括如下步骤：将含放线菌素D和/或X2的粗提物进行超临界流体色谱法分离,得到放线菌素D和/或X2；所述超临界流体色谱法分离的流动相由流动相A和B组成，流动相A为超临界CO2，流动相B为甲醇、乙醇或含体积百分含量为0.1％三氟乙酸的乙醇；等度洗脱时，所述流动相A与流动相B的体积比例为80:20或75:25；梯度洗脱时，0～40min流动相由超临界CO2：乙醇的体积比由98:2变为60:40。本发明提供一种基于超临界色谱分离技术的放线菌素D和/或X2的制备方法，对放线菌素D和X2实现了高效绿色的分离。
Description
技术领域
本发明涉及化合物制备领域，具体涉及一种使用超临界流体色谱制备放线菌素D和X2方法。
背景技术
放线菌素是一类众所周知的色原肽抗生素，其结构主要是由一个相同吩噁嗪发色团，通过肽键连上两个五肽内酯环组成。自从瓦克斯曼和他的同事伍德拉夫于1940年首次报道发现了这类结构。截至目前，已经有超过 42个天然来源的放线菌素被分离并鉴定出来。研究发现，此类结构是通过其吩噁嗪母核与DNA中鸟嘌呤碱基特异性结合，抑制以DNA为模板的RNA 多聚酶，从而抑制RNA的合成和相应蛋白质的合成来发挥作用。其中，放线菌素D作为其庞大家族中最经典的一员，也是被研究最早最成熟一例。在1964年就已经由默克公司申请，被美国FDA批准以商品名Cosmegen销售至今。放线菌素D作为临床上的一线抗肿瘤药物，主要用于治疗一些恶性实体瘤，包括肾母细胞瘤(Wilms′tumor)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、神经母细胞瘤、绒毛膜上皮细胞癌、睾丸癌、恶性葡萄胎等。入选《世界卫生组织基本药物标准清单》和中国《国家基本医疗保险目录》在列药物，在中国乃至世界范围内都有着巨大的需求。
近年来对放线菌素类物质深入研究发现，放线菌素X2也具有广谱的抗肿瘤活性，甚至活性更强。谢卫东等人发现，放线菌素X2对乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231和BT-474的细胞毒活性明显强于放线菌素D，对 MDA-MB-231细胞的选择性IC50能够达到0.83nM纳摩尔级别[Lu D-D,Ren J-W,Du Q-Q,Song Y-J,Xie W-D.p-Terphenyls and actinomycinsfrom a Streptomyces sp.associated with the larva of mud dauber wasp. NaturalProduct Research 2019(4695):1-5]。另外，施珊珊等人发现放线菌素X2不仅对肝癌细胞HepG2有活性，而且对柯萨奇病毒(CVB3)、甲型流感病毒(H1N1)具有抗病毒活性。其抗病毒活性机制研究表明，放线菌素X2是在病毒吸附前就发挥作用，可能是通过抑制了NF-κB活化，下调了CVB3诱导的ECV304细胞ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表达[施珊珊.放线菌素X2的抗肿瘤和抗病毒研究[D].广州:暨南大学,2009.]。从这点上出发，放线菌素X2未来更有望成为抗肿瘤和抗病毒的候选药物。
目前对放线菌素D和X2的制备方式主要有化学合成法、微生物发酵法、生物合成法。由于目前生物合成法仅仅停留在实验室阶段，而化学合成法产品工艺复杂，合成步骤长，产率不高，原料价格成本高、毒性大、安全性差，所用的有机试剂环境污染严重，废弃物难处理[Lifferth A,Bahner I,Lackner H,Martina S,Naturforsch Z.Synthesis andStructure of Proline Ring Modified Actinomycins of the X-Type.ChemistryScience 1999,54:681-691.Tanaka T,Nakajima K,Okawa K.Studies on 2-aziridinecarboxylic acid.IV.Total synthesis of actinomycin D(C1) via ring-opening reaction of aziridine.Bulletin of the Chemical Society of Japan 1980,53(5):1352-1355]。工业上放线菌素D和X2的制备主要采用微生物发酵法，其具有培养周期短、生产条件温和、代谢过程可调控、生产成本低、产量高的优点。尽管已经很多高产菌株被发现和应用，但是微生物发酵法后处理过程中，从发酵物到分离出放线菌D和X2纯品都需要用到高效液相色谱(HPLC)，这一步生产成本高、有机试剂污染环境，不利于规模化制备。例如从链霉菌Streptomyces sp.MS449发酵物中分离放线菌素D和X2，粗提物首先通过HP-20大孔吸附树脂富集，再通过HPLC纯化分别得到放线菌素D和X2(CN102391967A)。从链霉菌Streptomyces sp.S011发酵物中分离放线菌素D，粗提物通过葡聚糖凝胶柱色谱富集后，最终也是采用HPLC制备目标成分放线菌素D (CN109385380A)。
超临界流体色谱近些年在突破了检测器灵敏度和设备稳定性的技术瓶颈后，由于其流动相超临界CO2流体的高扩散性和低粘度优点，因此成为继HPLC之后强大的分离手段，结合夹带剂和添加剂对保留行为的改变，拥有反相色谱的易用性和正相色谱分离能力，特别是目前的结构类似物分离和规模化制备过程中具有无可比拟的优势。如N.K.Jagota等人用超临界色谱分析了紫杉醇及其类似物，成功从紫杉醇杂质和降解产物中分离出了目标物紫杉醇[Jagota NK,Nair JB,Frazer R,Klee M,Wang MZ. Supercritical fluidchromatography of paclitaxel.Journal of Chromatography A 1996,721(2):315-322]。张大兵等人采用超临界色谱得到了高纯度的紫杉醇(CN107176935A)。
发明内容
鉴于放线菌素D在临床抗癌药物重要性和放线菌素X2作为候选药物巨大的潜力，提供一种基于超临界色谱分离技术的放线菌素D和/或X2的制备方法，对放线菌素D和X2实现了高效绿色的分离，旨在提供一种用于放线菌素D和X2工业上规模化制备的新方法。
一种放线菌素D和/或X2的制备方法，包括如下步骤：
将含放线菌素D和/或X2的粗提物进行超临界流体色谱法分离,得到放线菌素D和/或X2；
所述超临界流体色谱法分离的流动相由流动相A和B组成，流动相A 为超临界CO2，流动相B为甲醇、乙醇或含体积百分含量为0.1％三氟乙酸的乙醇；等度洗脱时，所述流动相A与流动相B的体积比例为80:20或75:25；梯度洗脱时，0～40min流动相由超临界CO2：乙醇的体积比由98:2变为 60:40；
所述放线菌素D和X2的结构式如下所示：下式中R为O时，为放线菌素X2；R为H2时，为放线菌素D；
进一步地，所述超临界色谱分离法分离的色谱柱为苯基键合硅胶柱；流速为2mL/min，柱温为40℃，背压为1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。
进一步地，所述苯基键合硅胶柱为Hedera Phenyl色谱柱，规格为5μm， 4.6mm×250mm。
进一步地，含放线菌素D和X2的粗提物的制备包括如下步骤：
制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物；
将所得的发酵产物进行放线菌素D和/或X2的提取和分离，得到第一粗提物；
将所得的第一粗提物经过富集和除杂。
进一步地，在所述富集和除杂步骤中，所得的第一粗提物经正相硅胶柱富集并除杂，洗脱条件为，依次以体积比9:1和体积比1:1的环己烷-乙酸乙酯洗脱，收集以体积比为1:1的环己烷-乙酸乙酯洗脱的流份。
进一步地，在所述提取和分离步骤中，提取溶剂为乙酸乙酯，提取方式采用浸提法。
进一步地，制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物步骤中，链霉菌作为发酵菌种，在发酵培养基中进行发酵，得到含有放线菌素D和/或X2的发酵产物。
进一步地，制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物的步骤为：将链霉菌DQS-5接种到液体培养基中，培养获得种子培养液；将种子培养液加入发酵培养基中，28℃～32℃，静置发酵30-50天；所述获得种子培养液的培养条件为：温度28～32℃，转速180～250r/min，振荡培养3～10天。
进一步地，所述链霉菌为链霉菌DQS-5，保藏编号为CCTCC M 2020299。
进一步地，所述液体培养基为2216E液体培养基，配方为：蛋白胨2-10 g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、磷酸高铁0.01-0.05g/L和海盐20-30g/L；
所述发酵培养基为大米培养基，所述大米培养基中含有0.6-1.3g/mL 大米、0.02-0.04g/mL海盐。
进一步地，获得种子培养液的步骤为：将单菌落接种至装有2216E液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养5天，即得种子培养液。
1、本发明首次利用超临界色谱技术实现了对含放线菌素D和/或X2的粗提物中放线菌素D和X2高效绿色的分离，制备效率高、安全绿色、易于规模化工业应用，且流动相采用的二氧化碳具有性质稳定、无毒、不易燃爆和价格低廉的优点。
2、本发明首先对采自中国广东省深圳市南澳岛的海水样品中分离到的一株链霉菌Streptomyces sp.DQS-5进行菌种鉴定，并进行了保藏。然后利用2216E液体培养基配制种子液，采用大米固体培养基进行大批量发酵。发酵物的有机溶剂粗提物先用正相硅胶柱进行富集和除杂，最后采用超临界色谱对富含放线菌D和X2的组分进行精制，得到高纯度放线菌素D和X2，并用核磁共振对其进行表征。最终建立一种基于超临界流体色谱技术的放线菌素D和X2的制备方法，为工业上放线菌素D和X2规模化制备提供可行有效的新方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1链霉菌DQS-5在2216平板上37℃下的正反面照片；
图2为实施例3方法1中超临界流体色谱分离结果；
图3为实施例3方法2中超临界流体色谱分离结果；
图4为实施例3方法3中超临界流体色谱分离结果；
图5为实施例3方法4中超临界流体色谱分离结果；
图6为实施例3方法5中超临界流体色谱分离结果；
图7实施例4中放线菌素X2和放线菌素D的化学结构式；
图8对比例中Hedera Diol色谱柱上的分离结果；
图9对比例中Hedera NH2色谱柱上的分离结果；
图10对比例中Nucifera C18P色谱柱上的分离结果；
图11对比例中Nucifera PyE色谱柱上的分离结果；
图12对比例中Nucifera PyE-h色谱柱上的分离结果；
图13对比例中Nucifera CN色谱柱上的分离结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
2216E平板培养基配方：蛋白胨(上海生工)5g/L，酵母膏(上海生工)1g/L，磷酸高铁(上海生工)0.01g/L，海盐(广东盐业集团)30g/L，琼脂(上海生工)20g/L，121℃高压灭菌锅(ZEALWAY GR850P)灭菌30 分钟。2216E液体培养基配方为去除琼脂的成分，包括蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，磷酸高铁0.01g/L，海盐30g/L，121℃高压灭菌30分钟。大米培养基配方为50g大米，1.5g海盐，50mL去离子水溶解后加入500mL 锥形瓶，经121℃高压灭菌30分钟。
实施例1放线菌DQS-5的获得及鉴定
从中国广东省深圳市南澳岛的海水样品中分离到的一株放线菌株 DQS-5在2216E平板培养基上菌落呈现颗粒状，表面白色至淡黄色，背面随时间生长产生黄色色素，颜色由黄变黑(如图1)。提取菌种基因组，进行16s rDNA片段PCR扩增，扩增产物测序结果如SEQ IDNO：1所示。分析结果显示共有1438个碱基，通过NCBI网站上Genebank中BLAST程序比对，与Streptomyces属同源性达100％，最终鉴定菌株DQS-5为链霉属，命名为链霉菌DQS-5或Streptomyces sp.DQS-5，并将该菌株于2020年7月10日提交到中国典型培养物保藏中心进行了保藏，地址：中国，武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2020299，存活。
实施例2链霉菌DQS-5发酵
将低温保藏的放线菌DQS-5接种至2216E平板培养基上划线复苏，培养温度为28℃，时间为2天。将复苏后的菌种挑取单菌落，接种至装有 75mL 2216E液体培养基的250mL锥形瓶中，28℃，180rpm摇床培养5 天，即得种子培养液；然后将种子培养液在超净台(SW-CJ-2FD,苏净安泰)内加入到含有大米培养基的40个500mL锥形瓶中，以每瓶5mL的接种量接种，28℃，静置发酵40天。即得到含有放线菌素D和X2的链霉菌Streptomyces sp.DQS-5的发酵培养物。
实施例3放线菌素D和X2的提取和分离
为了获取放线菌素D和X2，还需要进一步提取分离，具体包括以下步骤：
1、提取
取实施例2得到的40个锥形瓶发酵40天后发酵培养物，切碎阴干，然后装入容积为2000mL锥形瓶中，加入1500mL的乙酸乙酯(分析纯，西陇科学股份有限公司)浸没，超声30分钟，过滤取滤液。按照以上方法重复3次，合并滤液，用旋转蒸发仪(HB10-basic艾卡仪器设备有限公司)40℃减压去除溶剂，即得到含有放线菌素D和X2的粗提物浸膏(10 g)。
2、正相硅胶柱富集并除杂
将上述粗提物浸膏用100ml甲醇溶解，加入规格为100目～200目的硅胶(青岛海洋化工有限公司)15g进行混合拌样,待甲醇挥干后得到拌样硅胶。另外称取100g规格为200目～300目的硅胶(青岛海洋化工有限公司)，用1000ml环己烷(分析纯，西陇科学股份有限公司)作为初始溶剂装柱，静置过夜待硅胶沉降密实后，干法上样，以环己烷与乙酸乙酯的体积比为9:1和1:1进行洗脱。其中流份I为环己烷与乙酸乙酯体积比为9:1洗脱2L所得。流份II为环己烷-乙酸乙酯体积比1:1 洗脱2L所得。流份II薄层色谱斑点日光下呈现红色，254nm下有明显暗斑，蒸干溶剂后为橘红色粉末。
3、超临界色谱分离，分别用如下几种方法进行试验。
方法1
将流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10(江苏汉邦科技有限公司)，以乙醇为夹带剂，使用苯基键合硅胶柱(Hedera Phenyl,5 μm，4.6mm×250mm，江苏汉邦科技有限公司)作为超临界色谱分离的色谱柱，使用超临界CO2：乙醇的体积比为80:20流动相进行等度洗脱，流速2mL/min，柱温为40℃，背压1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。结果两个色谱峰按顺序洗脱出来，峰1的保留时间为 30.0～32.0min，峰2的保留时间为35～38min。如图2所示，峰1和峰2实现了有效分离，分离度3.66。其中峰1为放线菌素X2，峰2为放线菌素D。
方法2
将流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10(江苏汉邦科技有限公司)，以乙醇为夹带剂，使用苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱 (Hedera Phenyl,5μm，4.6mm×250mm)，使用超临界CO2：乙醇的体积比为75:25流动相进行等度洗脱，流速2mL/min，柱温为40℃，背压1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。结果两个色谱峰按顺序洗脱出来，峰1的保留时间为15.0～16.8min，峰2的保留时间为17.8～19.2min。如图3所示，峰1和峰2实现了有效分离，分离度3.28。其中峰1为放线菌素X2，峰2为放线菌素D。
方法3
将流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10(江苏汉邦科技有限公司)，以甲醇为夹带剂，使用苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱 (Hedera Phenyl,5μm，4.6mm×250mm)，使用超临界CO2：甲醇的体积比为75:25流动相进行等度洗脱，流速2mL/min，柱温为40℃，背压1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。结果两个色谱峰按顺序洗脱出来，峰1的保留时间为11.8～13.1min，峰2的保留时间为13.9～15.1min。如图4所示，峰1和峰2实现了有效分离，分离度3.49。其中峰1为放线菌素X2，峰2为放线菌素D。
方法4：
将流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10(江苏汉邦科技有限公司)，以乙醇为夹带剂，以0.1％三氟乙酸为添加剂，使用苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱(Hedera Phenyl,5μm，4.6mm×250mm)，使用超临界CO2：含0.1％(体积百分含量)三氟乙酸的乙醇的体积比为 80:20流动相进行等度洗脱，流速2mL/min，柱温为40℃，背压1750psi, 检测波长为254nm，进样体积10μL。结果两个色谱峰按顺序洗脱出来，峰1的保留时间为31.8～33.8min，峰2的保留时间为37.9～40.4min。如图5所示，峰1和峰2实现了有效分离，分离度4.21。其中峰1为放线菌素X2，峰2为放线菌素D。
方法5
将流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10(江苏汉邦科技有限公司)，以乙醇为夹带剂，使用苯基键合硅胶作为固定相的色谱柱 (Hedera Phenyl,5μm，4.6mm×250mm)，使用洗脱方式为线性梯度洗脱：0～40min，流动相超临界CO2：乙醇的体积比由98:2改变为 60:40，流速2mL/min，柱温为40℃，背压1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。结果两个色谱峰按顺序洗脱出来，峰1的保留时间为 31.0～31.9min，峰2的保留时间为32.4～35.3min。如图6所示，峰1 和峰2实现了有效分离，分离度3.28。其中峰1为放线菌素X2，峰2 为放线菌素D。
实施例4放线菌素D和X2的结构鉴定
对实施例3所得的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质的数据：
峰1：橘红色粉末，易溶于甲醇、丙酮、二氯甲烷等有机溶剂中。分子式为C62H86N12O17，ESI-MS：m/z 1269.6[M+H]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3) 和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见下表1所示。
峰2：橘红色粉末，易溶于甲醇、丙酮、二氯甲烷等有机溶剂中。分子式为C62H86N12O16，ESI-MS：m/z 1255.6[M+H]+。1H-NMR(600MHz,CDCl3) 和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见下表1所示。
表1峰1和峰2的核磁数据
注：Sara:N-methyl Gly；Mevb:N-methyl Val；Opro c:4-oxo-Pro
根据以上数据，再结合文献(Matsui T,Tanaka J,Namihira T,Shinzato N.Antibiotics production by an actinomycete isolated from the termite gut.Journal of Basic Microbiology 2012,52:731-735)，最终鉴定峰1为放线菌素X2，峰2为放线菌素D。其结构如图7所示。
对比例
目标峰未能分开(Rs<1.5)超临界色谱条件如下：
将实施例3步骤2得到的流份II中的橘红色粉末用乙醇溶解，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，选用分析型超临界流体色谱仪Hanbon SFC LAB-10 (江苏汉邦科技有限公司)，以乙醇为夹带剂，筛选固定相色谱柱的种类包括两个系列Hedera(Phenyl，Diol，NH2)和Nucifera(C18P，PyE， PyE-h，CN)(4.6mm×250mm,5μm)，使用线性梯度方式洗脱为：0～40min，流动相超临界CO2：乙醇体积比由98:2改变为60:40，流速2 mL/min，柱温为40℃，背压1750psi,检测波长为254nm，进样体积 10μL。结果中不能将目标峰分开的色谱柱是HederaDiol(普通二醇基键合硅胶填料)，Hedera NH2(普通氨基键合硅胶填料)和Nucifera C18P(高碳载量C18键合硅胶填料)，Nucifera PyE(二乙基吡啶键合硅胶且封尾)，NuciferaPyE-h(二乙基吡啶键合硅胶填料)，Nucifera CN(普通腈基键合硅胶填料)。如图8-13所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素D和X2方法
<130> ZHA202000553
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgaa atcacttcgg tggtggatta 60
gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttc actctgggac aagccctgga 120
aacggggtct aataccggat aacactctgt cccgcatggg acggggttga aagctccggc 180
ggtgaaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga 240
cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg 360
ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcgaaag 420
tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480
gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc ttgtcacgtc 540
ggatgtgaaa gcccggggct taaccccggg tctgcattcg atacgggcta gctagagtgt 600
ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac 660
cggtggcgaa ggcggatctc tgggccatta ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 720
gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgt tgggaactag gtgttggcga 780
cattccacgt cgtcggtgcc gcagctaacg cattaagttc cccgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag catgtggctt 900
aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat ataccggaaa gcatcagaga 960
tggtgccccc cttgtggtcg gtatacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt ctgtgttgcc agcatgccct 1080
tcggggtgat ggggactcac aggagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga 1140
cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg gctgcacacg tgctacaatg gccggtacaa 1200
tgagctgcga tgccgcgagg cggagcgaat ctcaaaaagc cggtctcagt tcggattggg 1260
gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt tgctagtaat cgcagatcag cattgctgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcacgaaagt cggtaacacc 1380
cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag ggagctgtcg aaggtgggac tggcgatg 1438
Claims (10)
1.一种放线菌素D和/或X2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将含放线菌素D和/或X2的粗提物进行超临界流体色谱法分离,得到放线菌素D和/或X2；
所述超临界流体色谱法分离的流动相由流动相A和B组成，流动相A为超临界CO2，流动相B为甲醇、乙醇或含体积百分含量为0.1％三氟乙酸的乙醇；等度洗脱时，所述流动相A与流动相B的体积比例为80:20或75:25；梯度洗脱时，0～40min流动相由超临界CO2：乙醇的体积比由98:2变为60:40；
所述放线菌素D和X2的结构式如下所示：下式中R为O时，为放线菌素X2；R为H2时，为放线菌素D；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超临界色谱分离法分离的色谱柱为苯基键合硅胶柱；流速为2mL/min，柱温为40℃，背压为1750psi,检测波长为254nm，进样体积10μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述苯基键合硅胶柱为Hedera Phenyl色谱柱，规格为5μm，4.6mm×250mm。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，含放线菌素D和X2的粗提物的制备包括如下步骤：
制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物；
将所得的发酵产物进行放线菌素D和/或X2的提取和分离，得到第一粗提物；
将所得的第一粗提物经过富集和除杂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述富集和除杂步骤中，所得的第一粗提物经正相硅胶柱富集并除杂，洗脱条件为，依次以体积比9:1和体积比1:1的环己烷-乙酸乙酯洗脱，收集以体积比1:1的环己烷-乙酸乙酯洗脱的流份。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在所述提取和分离步骤中，提取溶剂为乙酸乙酯，提取方式采用浸提法。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物步骤中，链霉菌作为发酵菌种，在发酵培养基中进行发酵，得到含有放线菌素D和/或X2的发酵产物。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
制备含有放线菌素D和/或X2的发酵产物的步骤为：将链霉菌接种到液体培养基中，培养获得种子培养液；将种子培养液加入发酵培养基中，28℃～32℃，静置发酵30-50天；所述获得种子培养液的培养条件为：温度28～32℃，转速180～250r/min，振荡培养3～10天。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
所述链霉菌为链霉菌DQS-5，保藏编号为CCTCC M 2020299。
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为2216E液体培养基，配方为：蛋白胨2-10g/L、酵母膏0.5-1.5g/L、磷酸高铁0.01-0.05g/L和海盐20-30g/L；
所述发酵培养基为大米培养基，所述大米培养基中含有0.6-1.3g/mL大米、0.02-0.04g/mL海盐。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010889790.9A CN112010942B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010889790.9A CN112010942B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112010942A true CN112010942A (zh) | 2020-12-01 |
| CN112010942B CN112010942B (zh) | 2022-05-17 |
Family
ID=73502870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010889790.9A Active CN112010942B (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112010942B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114814020A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-29 | 安康市农产品质量安全检验监测中心 | 一种农产品中残留有机磷农药的分析方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120016105A1 (en) * | 2004-01-08 | 2012-01-19 | Novo Nordisk A/S | Purification of peptide conjugates by hydrophobic interaction chromatography |
| CN102391967A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-03-28 | 中国科学院微生物研究所 | 一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用 |
| CN105254712A (zh) * | 2015-09-23 | 2016-01-20 | 福建省微生物研究所 | 一种高纯度放线菌素d的提纯方法 |
| CN107176935A (zh) * | 2016-03-10 | 2017-09-19 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种使用超临界流体色谱纯化紫杉醇的方法 |
| CN109081863A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-25 | 西北民族大学 | 抗癌活性物质放线菌素fgr的分离鉴定方法 |
| CN110669103A (zh) * | 2019-09-24 | 2020-01-10 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一类双脱甲基放线菌素衍生物及其在制备抗耐药菌感染药物中的应用 |
-
2020
- 2020-08-28 CN CN202010889790.9A patent/CN112010942B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120016105A1 (en) * | 2004-01-08 | 2012-01-19 | Novo Nordisk A/S | Purification of peptide conjugates by hydrophobic interaction chromatography |
| CN102391967A (zh) * | 2011-11-17 | 2012-03-28 | 中国科学院微生物研究所 | 一株链霉菌及其在生产放线菌素中的应用 |
| CN105254712A (zh) * | 2015-09-23 | 2016-01-20 | 福建省微生物研究所 | 一种高纯度放线菌素d的提纯方法 |
| CN107176935A (zh) * | 2016-03-10 | 2017-09-19 | 江苏汉邦科技有限公司 | 一种使用超临界流体色谱纯化紫杉醇的方法 |
| CN109081863A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-25 | 西北民族大学 | 抗癌活性物质放线菌素fgr的分离鉴定方法 |
| CN110669103A (zh) * | 2019-09-24 | 2020-01-10 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一类双脱甲基放线菌素衍生物及其在制备抗耐药菌感染药物中的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CAIXIA CHEN ET AL.: ""A marine-derivedStreptomycessp. MS449 produces high yield of actinomycin X2and actinomycin D with potent anti-tuberculosis activity"", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 * |
| LARRY MILLER: ""Preparative enantioseparations using supercritical fluid chromatography"", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| XIAO-JIE LU ET AL.: ""Efficient, green, and rapid strategy for separating actinomycin D and X2 using supercritical fluid chromatography"", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS》 * |
| 张晶 等: ""超临界流体色谱与高效液相色谱分离手性化合物的比较"", 《色谱》 * |
| 徐平 等: ""放线菌素X2高产菌株的抗药性致死突变标志的诱变筛选研究"", 《江西农业大学学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114814020A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-07-29 | 安康市农产品质量安全检验监测中心 | 一种农产品中残留有机磷农药的分析方法 |
| CN114814020B (zh) * | 2022-04-20 | 2023-08-29 | 安康市农产品质量安全检验监测中心 | 一种农产品中残留有机磷农药的分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112010942B (zh) | 2022-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ni et al. | Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium | |
| CN113105428B (zh) | 一种氧杂蒽酮类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN112010942B (zh) | 一种使用超临界流体色谱制备放线菌素d和x2方法 | |
| CN111235036B (zh) | 一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法 | |
| CN102807955B (zh) | 一种制备抗肿瘤化合物Rasfonin的方法及其专用菌株 | |
| CN112142819B (zh) | 白桦脂酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN111646993A (zh) | 海洋抗胶质瘤活性物质异壁咔啉碱c及制备和用途 | |
| CN116790386A (zh) | 一株青霉属真菌Penicillium sp. YMS6及其应用 | |
| CN107686817B (zh) | 一株阔苞菊内生真菌CYSK-4及其生产的Ascomylactam类化合物的应用 | |
| CN114149445B (zh) | 一种氧杂蒽酮类化合物的制备方法及其在抗耐药细菌方面的应用 | |
| CN114276966B (zh) | 一株产异黄酮类成分的黄芪内生细菌及其应用 | |
| CN105274152B (zh) | 姜黄素的生物转化方法、产物及应用 | |
| CN115109023A (zh) | 大环内酯类化合物fwyz52-a、其发酵菌株、发酵方法及应用 | |
| CN108949610B (zh) | 一种链霉菌和以链霉菌产生的angucycline类化合物及其制备与应用 | |
| CN109467579B (zh) | 一种具有免疫抑制活性的pks i型聚酮类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN112079897A (zh) | 两种甾体类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN108586435B (zh) | Echinulin的制备方法 | |
| CN107354182B (zh) | 一种灰毛豆内生真菌发酵制备(r)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法 | |
| CN112213400A (zh) | 一种β-榄香烯及其有关物质的检测方法 | |
| CN111411136B (zh) | 一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118生产胸腺嘧啶的制备方法 | |
| CN114940693B (zh) | 硫代苯甲酸酯糖苷类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN109971652B (zh) | 一株藏波罗花内生真菌Onygenales X117及其发酵产物的制备方法和应用 | |
| CN111995560B (zh) | 一种单萜吲哚类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN110343639B (zh) | 一株产15(s)-o-乙基雷帕霉素的链霉菌 | |
| CN107935819B (zh) | 多氧取代环己烯类衍生物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Foshan Yitong Intelligent Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2022980024278 Denomination of invention: A Method for the Preparation of Actinomycin D and X 2 by Supercritical Fluid Chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20221201 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Huahong Testing Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2022980025985 Denomination of invention: A Method for the Preparation of Actinomycin D and X2 by Supercritical Fluid Chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20221211 Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Dongfang Renshou Life Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2022980025926 Denomination of invention: A Method for the Preparation of Actinomycin D and X2 by Supercritical Fluid Chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20221211 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Pengcheng Future Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980036139 Denomination of invention: A method for the preparation of Dactinomycin D and X by supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20230531 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen kangruihua Medical Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980045648 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231103 Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Ruikanghua Medical Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980045608 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231103 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: SHENZHEN TIANDEYI ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980047164 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231115 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Guangdong Whale Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980048812 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231129 Application publication date: 20201201 Assignee: Guangdong Bonn Life Sciences Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980048412 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231127 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Tiantian Biological Group Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980049903 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X2 using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231205 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Shenzhen Zhongke Tuoda Technology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN University Contract record no.: X2023980050488 Denomination of invention: A method for preparing actinomycin D and X using supercritical fluid chromatography Granted publication date: 20220517 License type: Common License Record date: 20231208 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |