CN105254712A - 一种高纯度放线菌素d的提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱。

Description

一种高纯度放线菌素D的提纯方法
技术领域
本发明具体涉及一种高纯度放线菌素D的提纯方法。
背景技术
放线菌素D(ActinomycinD，AMD，别名更生霉素)最早就是从放线菌S.melanochromogenesNo.1779或者S.Parvullus中分离得到的，属于放线菌素家族的一员，这类化合物由多种链霉菌属的微生物产生。该类化合物结构中往往都含有一个能使之显红色或者黄色的杂三环发色团Actinocin：2－氨基－4，6－二甲基吩嗯嗪－(3)－氧－1，9－二羧酸，差别在于其上连接的环状五肽结构因放线菌素的种类不同而不同。
AMD己广泛用于恶性肿瘤的临床治疗，是较为理想的抗肿瘤药物，也是国家基本医疗保险药物品种之一。结合手术治疗和放射治疗，AMD对肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、霍奇金病及绒毛膜癌的治疗有效，对睾丸肿瘤也有一定疗效，尤其是对儿童肾母细胞瘤(Wilm’stumor)有很好的治疗效果，总体治疗率可以达到70～80％，对于没有明显肿瘤转移的病患治愈率可以上升到80～90％。此外，还常与其他药物联合用于肿瘤的治疗与研究。放线菌素D与氨甲喋呤联合用药治疗妊娠期绒膜癌，治愈率可达到70～90％，并对已转移的肿瘤也有很好的抑制效果。放线菌素D与氨甲喋呤、长春新碱以及苯基丁酸氮芥联合用药可以有效治疗睾丸肿瘤，放线菌素D与博来霉素等药物联合治疗卵巢癌可使五年生存率达到87.5％。
目前AMD研究主要集中在其作用机理和化学结构的改造。作用机理研究主要为AMD与核酸的作用，认为其发挥抗菌、抗肿瘤、抗病毒的主要机理是干扰核酸的合成。此外，研究发现AMD还能通过诱导细胞分化、诱导细胞凋亡，抑制一些蛋白酶活性及影响细胞周期等而发挥其抗肿瘤活性。对AMD的化学改造可以分为两类，一类是在吩嗯嗪酮环上的改造，另一类则是环五肽的结构改造。研究发现AMD的抗瘤谱比较有限，并且具有较大毒性从而严重影响了其使用剂量和使用范围。因此，为了满足临床的需要，迫切需要生产高纯度的AMD。
AMD的分离提纯方法描述见于CN200610019395、CN201110366034等。CN200610019395记载的更新霉素(即放线菌素D和放线菌素S3混合物)通过结晶进一步提纯方法；CN201110366034描述方法HPLC方法只能生产实验室用低数量的AMD，以及纯AMD的回收率低。其它主要采用正相层析如硅胶或氧化铝柱层析法同样存在分离周期长、回收率低、分离效果差等问题。因此，在技术上需要有生产AMD以及分离和纯化AMD的改进方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种高纯度放线菌素D的提纯方法。
本发明是这样实现的：一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％(V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；所述反相柱填料为纳米微球材料。
优选地，所述纳米微球材料为以聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的PS40-300；或以聚二乙烯基苯/丙烯酸酯聚合物为基质的PSN40-300。
优选地，所述反相柱填料的粒径为40um，孔径为
优选地，所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积。
优选地，所述强极性溶剂为甲醇、乙醇。
优选地，所述解析液的浓度为40％-80％(V/V)。
优选地，所述梯度洗脱的梯度为体积比40:60，60:40，80:20的强极性溶剂-水的溶剂系统
优选地，所述恒定浓度为65％(V/V)。
本发明的优点在于：对AMD粗提物的分离度高，获得的目标产物纯度高，分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大，适合自动化生产，具有很高的经济效益。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中链霉菌发酵产生的AMD粗提物的HPLC图谱。
图2是本发明中实施例1制得的AMD的中压制备图谱。
图3是本发明中实施例1制得的高纯度AMD的HPLC图谱。
具体实施方式
一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％(V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱。所述强极性溶剂为甲醇、乙醇；所述解析液的浓度为40％-80％(V/V)；所述梯度洗脱的梯度为体积比强极性溶剂：水＝40:60，60:40，80:20的强极性溶剂-水的溶剂系统；所述恒定浓度为65％(V/V)(体积分数)。
所述反相柱填料为纳米微球材料；所述纳米微球材料为以聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的PS40-300；或以聚二乙烯基苯/丙烯酸酯聚合物为基质的PSN40-300。所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积；所述纳米微球材料的粒径为40um，孔径为严格控制填料粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使填料具有高分辨率、高载量、高回收率、低反压，集中洗脱等特点。高的机械强度保证了高耐压性能，全pH范围(pH1-14)耐受性，提供了更多的选择可能性，更高的化学稳定性，具有更彻底的清洗能力，同时克服了硅胶色谱填料的pH适用范围窄、使用寿命短等缺点。
放线菌素D粗提物的获取：链霉菌发酵结束后，发酵液通过大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，收集乙醇浓缩至无醇味后，加入乙酸丁酯与水(1：1)配制的溶液，萃取3次，收集乙酸丁酯相，浓缩得到粗提物。
以下结合实施例对本发明作进一步地说明。
实施例一
将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装有纳米微粒PS40-300(粒径40um，孔径)5L，层析柱预先用20％乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65％甲醇的水溶液洗脱，用HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集液，收率70.2％。
实施例二
将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装有纳米微粒PSN40-300(粒径40um，孔径)5L，层析柱预先用20％乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用40％乙醇的水溶液3倍柱体积解析，最后用体积比40:60，60:40，80:20的乙醇－水溶液梯度洗脱，HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集液，收率57.5％。
实施例三
将放线菌素D粗提物100g，用乙醇500ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装有纳米微粒PS40-300(粒径40um，孔径)10L，层析柱预先用20％乙醇的水溶液3倍柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65％乙醇的水溶液解析，用HPLC方法测定收集液，合并纯度大于95％的AMD收集液，收率61.4％。
请参阅图1-3所示，上述实施例洗脱获得的洗脱物采用HPLC和中压液相色谱仪检测，HPLC检测条件为：C18色谱柱；体积比7:3的甲醇/水为流动相，检测波长254nm；中压液相色谱仪：EZPurifyIII，上海利穗有限公司。
本发明的反相填料严格控制粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使其具有高分辨率，高载量，高回收率，低反压，集中洗脱等特点，高的机械强度保证了高耐压性能，全pH范围(pH1-14)耐受性，提供了更多的选择可能性，更高的化学稳定性，具有更彻底的清洗能力，同时克服了硅胶色谱填料pH适用范围窄、使用寿命短等缺点。本发明分离纯化过程条件温和、分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度高，同时本发明适合自动化生产，具有很高的经济效益。

Claims (8)

1.一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：其操作方法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％(V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；所述反相柱填料为纳米微球材料。
2.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述纳米微球材料为以聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的PS40-300；或以聚二乙烯基苯/丙烯酸酯聚合物为基质的PSN40-300。
3.如权利要求2所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述反相柱填料的粒径为40um，孔径为
4.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积。
5.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述强极性溶剂为甲醇、乙醇。
6.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述解析液的浓度为40％-80％(V/V)。
7.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述梯度洗脱的梯度为体积比40:60，60:40，80:20的强极性溶剂-水的溶剂系统。
8.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述恒定浓度为65％(V/V)。
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