CN111999362B - 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器 - Google Patents

一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器 Download PDF

Info

Publication number
CN111999362B
CN111999362B CN202010772682.3A CN202010772682A CN111999362B CN 111999362 B CN111999362 B CN 111999362B CN 202010772682 A CN202010772682 A CN 202010772682A CN 111999362 B CN111999362 B CN 111999362B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mos
rgo
cell
cells
metal ion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010772682.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111999362A (zh
Inventor
王立峰
蒋栋磊
蒋卉
桂国跃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Finance and Economics
Original Assignee
Nanjing University of Finance and Economics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Finance and Economics filed Critical Nanjing University of Finance and Economics
Priority to CN202010772682.3A priority Critical patent/CN111999362B/zh
Publication of CN111999362A publication Critical patent/CN111999362A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111999362B publication Critical patent/CN111999362B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
    • G—PHYSICS
    • G08—SIGNALLING
    • G08C—TRANSMISSION SYSTEMS FOR MEASURED VALUES, CONTROL OR SIMILAR SIGNALS
    • G08C17/00—Arrangements for transmitting signals characterised by the use of a wireless electrical link
    • G08C17/02—Arrangements for transmitting signals characterised by the use of a wireless electrical link using a radio link

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器，属于食品质量分析检测领域。本发明的细胞电化学传感器是由智能手机、便携式电化学工作站、丝网印刷电极组成。本发明采用水热合成的还原型氧化石墨烯/二硫化钼纳米材料增加传感器的灵敏度以及对细胞的吸附力，利用叶酸在癌细胞中大量表达的原理在电极表面加入叶酸来捕获细胞，构建的细胞电化学传感器对重金属离子对人肝癌细胞造成的影响反应快速、灵敏，设备便捷，再结合电化学差分脉冲伏安法结果根据细胞活性抑制率转换公式能快速的判断重金属离子对细胞的作用程度。本发明的电化学传感器可应用于食品中重金属离子的毒性分析。

Description

一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器
技术领域
本发明涉及一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器，属于食品质量分析检测领域。
背景技术
重金属是指比重大于5的金属(一般来讲密度大于4.5克每立方厘米的金属)，包括金、银、铜、铁、汞、铅、镉等，重金属在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒。食品由于环境污染，加工、储运过程不当等原因往往会导致食品中有害重金属含量超标。长期食用含有微量的重金属食品会引起蓄积性中毒。导致人体干扰免疫系统功能。镉及其化合物对动物和人有一定的致癌、致畸和致突变的作用。侵害人体的神经系统。目前检测重金属方法包括原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体法等。这些方法由于灵敏度较高、选择性好、干扰较少等优点被广泛运用，但由于这些方法需要繁琐的样品预处理，耗时较多且花费较大不能用于现场检测。
因此，需要研制出一种能够便捷检测的方法代替以上较为复杂的方法。电化学传感器是通过电现象变化和化学变化来精确确定，可以对多种元素样品进行分析，另外由于其测量范围宽，仪器设备较简单，故应用起来相对快速便捷。
发明内容
为了解决上述至少一个问题，本发明建立了一种基于智能手机的便携式细胞电化学传感器，并成功地用于了重金属的毒性分析研究。近年来，随着科技的快速发展，智能手机逐渐普及、功能不断增强，基于智能手机的光电传感器检测技术也被人们广泛重视。
本发明将丝网印刷电极与便携式工作站相连接，通过无线网络或者蓝牙设备将便携式工作站与智能手机相连接，成功的构建便携式细胞传感器。本发明采用水热合成的还原型氧化石墨烯/二硫化钼纳米材料增加传感器的灵敏度以及对细胞的吸附力，利用叶酸在癌细胞中大量表达的原理在电极表面加入叶酸来捕获细胞，构建的细胞电化学传感器对重金属离子对人肝癌细胞造成的影响反应快速、灵敏，设备便捷。使用传感器通过差分脉冲伏安法检测峰值电流，通过峰值电流的大小判断细胞活性情况，从而确定重金属的细胞毒性。用电流法的优势在于更灵敏检测时间更短，由于阻抗法主要通过细胞粘附在电极表面，通过毒性物质作用后使细胞形变来达到影响电信号的，而本发明是利用细胞凋亡释放胞内物质的特点，通过细胞释放的介质快速抵达电极表面影响电极表面的氧化还原反应，改变电流的响应值，获得可计量的电信号，因此相比阻抗法，检测速度明显加快，时间大幅缩短。
本发明的第一个目的是提供一种制备便携式细胞电化学传感器的方法，包括如下步骤：
(1)采用还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液修饰丝网印刷电极，得到RGO/MoS2/丝网印刷电极；
(2)将叶酸FA溶液与RGO/MoS2复合材料分散液混合，滴加到RGO/MoS2/丝网印刷电极表面，烘干后形成RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极；
(3)在RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极表面接种Hep G2细胞，得到RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极；
(4)将RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极与便携式工作站相连接，通过无线网络或者蓝牙设备将便携式工作站与智能手机相连接，即得到所述的便携式细胞电化学传感器。
在本发明的一种实施方式中，所述的RGO/MoS2/FA复合材料分散液的浓度为0.6-0.8mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的叶酸溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的人肝癌细胞Hep G2的密度是2×105-2×107/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)的RGO/MoS2复合材料分散液和步骤(2)的RGO/MoS2复合材料分散液是一样的，两者的体积比为0.1-1：0.1-1，优选为1：1。
在本发明的一种实施方式中，所述的RGO/MoS2/FA复合材料分散液的浓度为0.7mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的叶酸溶液的浓度为1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的人肝癌细胞Hep G2的密度是2×106/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的步骤(1)和(2)中RGO/MoS2/FA复合材料分散液的总和、叶酸溶液和孵育人肝癌细胞Hep G2的培养液体积比为4：1：2。
在本发明的一种实施方式中，所述的丝网印刷电极的参数为：工作电极直径2.5mm，工作区域直径5.3mm，电极尺寸6mm×31mm。
在本发明的一种实施方式中，RGO/MoS2复合材料是采用水热法制备得到的，具体制备方法为：将60mg氧化石墨烯粉末分散于去10mL离子水中，超声处理后得到氧化石墨烯分散液6mg/mL；并将水合钼酸铵(70.5mg)、硫代乙酰胺(60mg)和氧化石墨烯分散液(6mg/mL)用去离子水稀释混合均匀至25mL，加入到容积50mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，在190℃下加热24h；收集水凝胶状物，室温下干燥后即为RGO/MoS2复合材料。
在一种实施方式中，所述的制备便携式细胞电化学传感器的方法，包括如下步骤：
(1)还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料的制备：将一定量氧化石墨烯粉末分散于去离子水中，超声处理后得到一定浓度的氧化石墨烯分散液；并将水合钼酸铵、硫代乙酰胺和氧化石墨烯分散液用去离子水稀释混合均匀，加入到容积50mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，在190℃下加热24h；收集水凝胶状物，即为RGO/MoS2复合材料；
(2)采取循环伏安法在1mM Fe(CN)6 3-/4-电解液中从-0.2V到0.6V重复扫描十次以除去丝网电极表面的杂质，之后再用超纯水和无水乙醇依次进行清洗后氮气吹干备用，得到工作丝网印刷电极；
(3)在工作丝网印刷电极表面滴加20μL0.7mg/mL的RGO/MoS2复合材料分散液，放入恒温箱中烘干电极，烘干后用超纯水清洗氮气吹干，得到RGO/MoS2/丝网印刷电极；
(4)将10μL 1mg/mL FA溶液与20μL 0.7mg/mL RGO/MoS2分散液混合，滴加到RGO/MoS2/丝网印刷电极表面，放入恒温箱中烘干电极，烘干后形成RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极；
(5)在RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极上接种20μL密度为2×106/mL人肝癌细胞HepG2，放入37℃、5％CO2培养箱中培养30min以固定细胞，待细胞固定后用PBS清洗掉未被叶酸捕获固定上的细胞，得到RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极；
(6)将RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极与便携式电化学工作站连接，然后智能手机再通过蓝牙或者无线网络与便携式电化学工作站连接即得到便携式细胞电化学传感器。
本发明的第二个目的是本发明所述方法制备得到的便携式细胞电化学传感器。
本发明的第三个目的是本发明所述的便携式细胞电化学传感器在检测金属离子毒性的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的金属离子为Cd2+、Pb2+、Hg2+中的一种或两种以上。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用具体为：
(1)将已知金属离子浓度的细胞培养液滴加到便携式细胞电化学传感器上，在37℃、5％CO2培养箱中下孵育6小时，采用差分脉冲伏安法检测峰值电流；
(2)在电解液为1mM Fe(CN)6 3-/4-溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)测量相对应的峰值电流，测试条件为
抑制率(％)＝100[(I金属离子-I细胞)/(I修饰-I细胞)]
其中I金属离子为已修饰完的电极在特定浓度金属离子刺激后的峰值电流，I细胞为电极修饰细胞后的峰值电流，I修饰为电极修饰RGO/MoS2/FA后的峰值电流；
Figure BDA0002617236670000041
其中，D金属离子、Dm分别为金属离子浓度、抑制率为50％时对应的金属离子浓度；m为剂量效应曲线的系数；
通过测试得到金属离子浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用具体为：
(1)将已知Cd2+浓度的细胞培养液滴加到便携式细胞电化学传感器上，在37℃、5％CO2培养箱中下孵育6小时，采用差分脉冲伏安法检测峰值电流；
(2)在电解液为1mM Fe(CN)6 3-/4-溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)测量相对应的峰值电流，测试条件为
抑制率(％)＝100×[(ICd 2+-I细胞)/(I修饰-I细胞)]
其中ICd 2+为已修饰完的电极在特定浓度金属离子刺激后的峰值电流，I细胞为电极修饰细胞后的峰值电流，I修饰为电极修饰RGO/MoS2/FA后的峰值电流；
Figure BDA0002617236670000042
其中，DCd 2+、Dm分别为Cd2+浓度、抑制率为50％时对应的Cd2+浓度；m为剂量效应曲线的系数；
通过测试得到Cd2+浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述的差分脉冲伏安法的测试条件为：扫描范围为-0.2～0.6V，扫描速率为150mV/s、振幅为25mV，所有测试均在室温下进行。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过电化学差分脉冲伏安法测定峰值电流作为检测信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，避免了传统MTT方法需要长时间显色反应的缺点，体现出对金属离子(Cd2+)毒性的快速、准确判断。
(2)Cd2+在5-160μM范围内随着浓度的增加，细胞电化学传感器的电流峰值逐渐升高，IC50值为49.8μM。
(3)本发明通过细胞传感器分析方法分析得到的结果与传统MTT检测方法基本一致，且金属离子(Cd2+)在本分析浓度范围内细胞传感器分析方法更加灵敏。
(4)本发明方法是基于智能手机构建的便携式细胞电化学传感器，分析时可以便携灵活使用且可以大大缩短分析时间。
(5)细胞作为生物体基本的结构和功能单位，对研究生物体结构以及生命活动的探究具有显著意义。肝脏作为Cd2+的主要代谢器官及毒素作用的靶器官，所以选用人肝癌细胞作为传感器感受元件对研究真菌毒素Cd2+对机体的毒性具有代表性。当Cd2+刺激细胞后，细胞产生凋亡，且随着浓度升高凋亡变化更为明显，细胞膜表面变得粗糙甚至破损，细胞凋亡释放胞内物质，通过细胞释放的介质快速抵达电极表面影响电极表面的氧化还原反应，改变电流的响应值，因此将细胞传感器作为分析Cd2+毒性的方法可以较大的提高灵敏度以及反应的速度。
(6)本发明构建的细胞电化学传感器通过Cd2+对人肝癌细胞造成的损伤能够进行快速、灵敏的反应，设备便捷且能灵活运用。
(7)本发明构建基于智能手机的便携式细胞电化学传感器，成功应用于Cd2+的毒性分析，并在分析重金属毒性方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为细胞电化学传感器构建的流程图。
图2为RGO/MoS2复合材料XRD图谱。
图3为细胞传感器修饰过程电化学表征图；A循环伏安法(CV)表征；B差分脉冲伏安法(DPV)；其中a：细胞/FA/RGO/MoS2/SPCE；b：RGO/MoS2/SPCE；c：FA/RGO/MoS2/SPCE；d：裸SPCE；C优化吸附细胞的密度，a-g：2×102-2×108；D电流与细胞密度曲线。
图4为DPV曲线，其中A：不同浓度CdCl2刺激肝癌细胞对应的DPV曲线；a-j为5、10、20、40、60、80、100、120、140、160μM；B：不同Cd2+浓度刺激肝癌细胞对应的DPV峰值电流。
图5为不同浓度CdCl2刺激肝癌细胞6h后分别利用DPV和MTT进行毒性分析；其中，Cd2+的浓度为5、10、20、40、60、80、100、120、140、160μM。
图6为重金属离子对细胞形态的影响；其中，A：阴性对照；B：Cd2+的浓度为50μM、刺激6h。
图7为实施例1的便携式细胞电化学传感器用于Hg2+检测的结果；其中A：不同浓度Hg2+刺激肝癌细胞对应的DPV曲线，a-j为5、10、20、40、60、80、100、120、140、160μM；B：不同浓度Hg2+刺激肝癌细胞对应的DPV峰值电流；C：电化学传感器测得的抑制率和常规MTT方法的对比。
图8为实施例1的便携式细胞电化学传感器用于Pb2+检测的结果；其中A：不同浓度Pb2+刺激肝癌细胞对应的DPV曲线，a-j为10、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000μM；B：不同浓度PbCl2刺激肝癌细胞对应的DPV峰值电流；C：电化学传感器测得的抑制率和常规MTT方法的对比。
图9为细胞电化学传感器的重现稳定性测试。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1
一种便携式细胞电化学传感器的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料的制备：将60mg氧化石墨烯粉末分散于去10mL离子水中，超声处理后得到氧化石墨烯分散液6mg/mL；并将水合钼酸铵(70.5mg)、硫代乙酰胺(60mg)和氧化石墨烯分散液(6mg/mL)用去离子水稀释混合均匀至25mL，加入到容积50mL的内衬为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，在190℃下加热24h；收集水凝胶状物，室温下干燥后即为RGO/MoS2复合材料(XRD图见图2，a是氧化石墨烯，b是还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合物)；
(2)采取循环伏安法在1mM Fe(CN)6 3-/4-电解液中从-0.2V到0.6V重复扫描十次以除去丝网电极表面的杂质，之后再用超纯水和无水乙醇依次进行清洗后氮气吹干备用，得到工作丝网印刷电极；
(3)在工作丝网印刷电极表面滴加20μL0.7mg/mL的RGO/MoS2复合材料分散液，放入恒温箱中烘干电极，烘干后用超纯水清洗氮气吹干，得到RGO/MoS2/丝网印刷电极；
(4)将10μL 1mg/mL FA与20μL 0.7mg/mL RGO/MoS2分散液混合，滴加到丝网印刷电极表面，放入恒温箱中烘干电极，烘干后形成RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极；
(5)在RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极上接种20μL密度为2×106/mL人肝癌细胞HepG2，放入37℃、5％CO2培养箱中培养20min以固定细胞，待细胞固定后用PBS清洗掉未被叶酸捕获固定上的细胞，得到RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极；
(6)将RGO/MoS2/FA/Hep G2细胞/丝网印刷电极与便携式电化学工作站连接，然后智能手机再通过蓝牙或者无线网络与便携式电化学工作站连接即得到便携式细胞电化学传感器。
对制备好的细胞电化学传感器进行循环伏安法、差分脉冲伏安法表征。
伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6V。在细胞电化学传感器的构建过程中，对人肝癌细胞Hep G2的密度进行了优化以获得稳定的细胞电化学传感器，结果发现：当细胞密度达到2×106/mL时，细胞电化学传感器测得的峰值电流逐渐稳定，说明此时细胞电化学传感器表面已达到吸附饱和，人肝癌细胞Hep G2的最佳吸附密度为2×106/mL。
如图3所示，还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料修饰电极后的电信号比未修饰的裸电极明显增强，说明了还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料具有良好的导电性，人肝癌细胞Hep G2吸附到修饰电极后，由于细胞膜的绝缘性，电信号明显降低，表明人肝癌细胞Hep G2吸附到了修饰电极表面，证明细胞传感器成功制备。
对照例1
在实施例1中不接种人肝癌细胞Hep G2，其他条件、参数和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
对照例2
在实施例1中不加叶酸，其他条件、参数和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
对照例3
调整实施例1中RGO/MoS2复合材料的浓度调整为0.1mg/mL、0.4mg/mL和1mg/mL，其他条件、参数和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
表1实施例1和对照例1-3得到的细胞电化学传感器的性能测试
Figure BDA0002617236670000071
从表1可以看出：对照例2缺少了叶酸FA的细胞电化学传感器由于不能识别和固定细胞导致细胞并不能很好的结合在电极表面，所以峰值电流相对于实施例1中高出许多；对比例3是采用0.1mg/mL、0.4mg/mL和1mg/mL RGO/MoS2复合材料修饰电极，结果与0.7mg/mL相比导致峰值电流下降，说明RGO/MoS2复合材料用量过少和过多都会导致传感器灵敏度的下降所以峰值电流会相应有所下降，从而使得电化学传感器根本无法精确的检测金属离子的毒性。
对照例4
将实施例1中的还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料替换为镍纳米材料，其他和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
对便携式细胞电化学传感器进行性能测试，发现：正常细胞组与低浓度Cd2+组(5-20μM)检测结果差距并不显著，这可能是由于镍纳米材料可作为一种抗癌药物对癌细胞活性产生影响，可对Cd2+浓度(毒性)的检测产生巨大偏差。可见，虽然镍纳米材料也是采用的导电材料，但可能并不适用于作为细胞传感器的修饰材料。
将实施例1中的还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料替换为二硫化钼单独修饰，其它和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
对便携式细胞电化学传感器进行性能测试，发现：由于二硫化钼单独修饰时导电性能较差，导致细胞传感器在检测细胞经重金属离子刺激后的反应电信号灵敏度大大降低甚至检测不出明显的峰值电流。所以二硫化钼不适合单独用于细胞传感器对于重金属离子刺激产生细胞毒性的检测，通常与其它导电材料复合修饰来达到增强导电性能，提高传感器灵敏度的功效。
实施例2
调整实施例1中还原型氧化石墨烯/二硫化钼复合材料的制备方法(超声法)为：
将60mg氧化石墨烯与60mg二硫化钼粉末混合加入25mL去离子水中，放入超声清洗器中超声2h，得到的黑色分散液即为通过超声制备出的氧化石墨烯/二硫化钼复合材料；其他和实施例1保持一致，得到便携式细胞电化学传感器。
对便携式细胞电化学传感器进行性能测试，发现：超声法制备的复合材料修饰电极后由于MoS2仅通过简单的物理吸附作用吸附在氧化石墨烯表面，能增加的比电容以及褶皱团簇结构较少，导致传感器导电性能、灵敏度以及对细胞的粘附相比于水热合成的复合材料差。
实施例3细胞电化学传感器的应用
1、重金属离子刺激细胞电化学传感器
取5、10、20、40、60、80、100、120、140、160μM浓度范围内CdCl2的溶液滴加到便携式细胞电化学传感器上，在37℃、5％CO2培养箱中下孵育6小时(刺激固定在细胞电化学传感器上的人肝癌细胞Hep G2 6h)，采用差分脉冲伏安法检测峰值电流；测试结果如图4所示。
从图4可以看出：随着Cd2+浓度逐渐增加，对应的DPV峰值电流逐渐升高，这是由于Cd2+浓度的增加导致传感器表面的细胞凋亡率升高，凋亡细胞由于失去了正常细胞形态导致与传感器表面的吸附能力变差。
2、分析条件与方法
差分脉冲伏安法的测试条件：扫描范围为-0.2～0.6V，扫描速率为150mV/s、振幅为25mV。
在电解液为1mM Fe(CN)6 3-/4-溶液中采用差分脉冲伏安法(DPV)测量相对应的峰值电流，测试条件为
抑制率(％)＝100×[(ICd 2+-I细胞)/(I修饰-I细胞)]
其中ICd 2+为已修饰完的电极在特定浓度Cd2+刺激后的峰值电流，I细胞为电极修饰细胞后的峰值电流，I修饰为电极修饰RGO/MoS2/FA后的峰值电流。
3、结果分析
测试结果如图5所示，Cd2+在5-160μM浓度范围内随着浓度的升高检测出的峰值电流也逐渐升高，通过实施例1的细胞电化学传感器测定IC50值为49.8μM，与MTT方法比可以看出：结果大致相同。而且实施例1的细胞电化学传感器采用差分脉冲伏安法测定峰值电流作为检测信号，克服了传统检测方法耗时长的缺点，不仅可以缩短检测时间而且同时也能提高检测灵敏度，实现了对Cd2+毒性的便捷、快速、准确的检测。
根据公式
Figure BDA0002617236670000091
其中D Cd 2+、Dm分别为Cd2+浓度、抑制率为50％时对应的Cd2+浓度；m为剂量效应曲线的系数(采用Graphpad Prism软件分析图5的数据得出，为1.42)，ICd 2+为已修饰完的电极在特定浓度Cd2+刺激后的峰值电流，I细胞为电极修饰细胞后的峰值电流，I修饰为电极修饰RGO/MoS2/FA后的峰值电流。
根据上述公式可以得到Cd2+的浓度。
图6为重金属离子对细胞形态的影响；其中，A：阴性对照；B：Cd2+的浓度为50μM；刺激6h。从图中可以看出：正常培养状态下的肝癌细胞表面比较光滑而且具有完整的细胞形态，能够紧密连接在界面上，但经过Cd2+的IC50浓度刺激细胞后，细胞形态发生了明显的变化，细胞表面变得粗糙甚至产生破裂并导致细胞膜起泡，细胞与界面之间的连接产生松动甚至出现裂痕。
实施例4细胞电化学传感器的应用
将实施例1的便携式细胞电化学传感器用于Hg2+和Pb2+检测，具体检测过程为：
取5、10、20、40、60、80、100、120、140、160μM浓度范围内HgCl2和10、50、100、200、500、1000、1500、2000、2500、3000μM PbCl2的溶液滴加到便携式细胞电化学传感器上，在37℃、5％CO2培养箱中下孵育6小时(刺激固定在细胞电化学传感器上的人肝癌细胞Hep G26h)，采用差分脉冲伏安法检测峰值电流。
测试结果如图7和图8所示。从图7和图8可以看出：随着重金属离子浓度逐渐增加，对应的DPV峰值电流逐渐升高，这是由于重金属离子Hg2+和Pb2+浓度的增加同样导致传感器表面的细胞凋亡率升高，凋亡细胞由于失去了正常细胞形态导致与传感器表面的吸附能力变差。
实施例5细胞电化学传感器的应用联合作用
将两种或两种以上重金属离子联合刺激细胞传感器，然后利用电化学DPV方法结合联合指数(CI)方法分析重金属离子的联合作用的作用类型，联合作用公式如下式(1)：
Figure BDA0002617236670000101
其中D、Dm、fa、fu分别为重金属离子浓度、抑制率为50％时对应的重金属离子浓度、对细胞损伤效应率(即抑制率)、对细胞未损伤效应率(即1-fa)；m为剂量效应曲线的系数(剂量效应曲线的系数(采用Graphpad Prism软件分析图7C、图8C的数据得出，m(Hg2+)＝1.24，m(Pb2+)＝0.79)。
联合指数的公式如下式(2)：
Figure BDA0002617236670000102
其中n(CI)x：n种真菌毒素产生x％抑制率时的联合指数；(D)j：n种毒素联合作用产生x％抑制时的浓度；(Dx)j：n种毒素单独作用产生x％抑制时的浓度；CI＝0.9～1.1表示加和作用，CI<0.9表示协同作用，CI>1.1表示拮抗作用，结果如下表2所示：
表2细胞传感器分析重金属离子联合作用的CI指数值及作用类型
Figure BDA0002617236670000111
实施例6重现稳定性测试
为了验证电极稳定性，选取了八个丝网印刷电极进行修饰后以2×106个/mL的细胞密度固定细胞，经15μM的Cd2+刺激细胞后进行八次重复独立检测，测试结果如图9所示，峰值电流值相差不大，RSD为3.34％，表明丝网印刷电极在检测时具有良好的重现稳定性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的技术和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备便携式细胞电化学传感器的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液修饰丝网印刷电极，得到RGO/MoS2/丝网印刷电极；
(2)将叶酸FA溶液与还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液混合，滴加到RGO/MoS2/丝网印刷电极表面，烘干后形成RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极；
(3)在RGO/MoS2/FA/丝网印刷电极表面接种人肝癌细胞Hep G2，得到RGO/MoS2/FA/人肝癌细胞Hep G2/丝网印刷电极；
(4)将RGO/MoS2/FA/人肝癌细胞Hep G2/丝网印刷电极与便携式工作站相连接，通过无线网络或者蓝牙设备将便携式工作站与智能手机相连接，即得到所述的便携式细胞电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述的还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液的浓度为0.6-0.8mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的叶酸FA溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的人肝癌细胞Hep G2的密度是2×105-2×107个/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液和步骤(2)的还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液的体积比为0.1-1：0.1-1；所述的步骤(1)和(2)中还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料分散液的总和、叶酸FA溶液和孵育人肝癌细胞Hep G2的培养液体积比为4：1：2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的还原型氧化石墨烯RGO/二硫化钼MoS2复合材料是采用水热法制备得到。
7.权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的便携式细胞电化学传感器。
8.权利要求7所述的便携式细胞电化学传感器在检测金属离子毒性的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的金属离子为Cd2+、Pb2+、Hg2+中的一种或两种以上。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的应用具体为：
(1)将已知金属离子浓度的细胞培养液滴加到便携式细胞电化学传感器上，在37℃、5％CO2培养箱中下孵育6小时，采用差分脉冲伏安法检测峰值电流；
(2)在电解液为1mM Fe(CN)6 3-/4-溶液中采用差分脉冲伏安法DPV测量相对应的峰值电流，测试条件为
抑制率％＝100[(I金属离子-I细胞)/(I修饰-I细胞)]
其中I金属离子为已修饰完的电极在特定浓度金属离子刺激后的峰值电流，I细胞为电极修饰细胞后的峰值电流，I修饰为电极修饰RGO/MoS2/FA后的峰值电流；
Figure FDA0003728287970000021
其中，D金属离子、Dm分别为金属离子浓度、抑制率为50％时对应的金属离子浓度；m为剂量效应曲线的系数；
通过测试得到金属离子浓度。
CN202010772682.3A 2020-08-04 2020-08-04 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器 Active CN111999362B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010772682.3A CN111999362B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010772682.3A CN111999362B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111999362A CN111999362A (zh) 2020-11-27
CN111999362B true CN111999362B (zh) 2022-08-23

Family

ID=73463487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010772682.3A Active CN111999362B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111999362B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113720887A (zh) * 2021-08-23 2021-11-30 西安交通大学医学院第一附属医院 一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器及其制备方法和应用
CN114518399A (zh) * 2022-01-14 2022-05-20 江苏大学 一种检测汞蒸气的高灵敏便携式智能传感系统的构建方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106806898A (zh) * 2015-12-01 2017-06-09 河北工程大学 一种叶酸靶向磁功能化二硫化钼药物载体及其制备方法
CN107219274B (zh) * 2017-05-27 2019-05-17 江南大学 一种分析真菌毒素联合毒性的细胞电化学传感器
CN107643333B (zh) * 2017-08-28 2020-06-26 江苏大学 一种检测水体毒性的双信号生物电化学方法
CN110836918A (zh) * 2019-11-28 2020-02-25 段烁 一种电极合成材料及其制配方法
CN111208182A (zh) * 2020-03-11 2020-05-29 山东理工大学 一种同时检测土壤中铅镉重金属的电化学传感器的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A novel smartphone-based electrochemical cell sensor for evaluating the toxicity of heavy metal ions Cd2+, Hg2+, and Pb2+ in rice;Jiang, DL 等;《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY 》;20210531;第413卷(第16期);第4277-4287页 *
Functionalized MoS2-nanosheets for targeted drug delivery and chemo-photothermal therapy;Xueyi Zhang 等;《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20180921;第173卷;第101-108页 *
Sensitive and anti-interference stripping voltammetry analysis of Pb(II) in water using flower-like MoS2/rGO composite with ultra-thin nanosheets;Yu-Feng Sun 等;《Analytica Chimica Acta》;20190309;第1063卷;第64-74页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111999362A (zh) 2020-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hu et al. Simultaneous determination of lead (II) and cadmium (II) at a diacetyldioxime modified carbon paste electrode by differential pulse stripping voltammetry
Chen et al. Bismuth-based porous screen-printed carbon electrode with enhanced sensitivity for trace heavy metal detection by stripping voltammetry
Jia et al. High‐Sensitivity Determination of Lead (II) and Cadmium (II) Based on the CNTs‐PSS/Bi Composite Film Electrode
Yüce et al. A voltammetric Rhodotorula mucilaginosa modified microbial biosensor for Cu (II) determination
CN111999362B (zh) 一种智能手机分析重金属离子毒性的电化学细胞传感器
CN108318568A (zh) 一种用于灵敏检测重金属镉离子的电化学传感器及制备方法
CN108732216B (zh) 一种电化学还原氧化石墨烯修饰电极及其检测水中重金属六价铬离子的应用
CN112730552B (zh) 一种改性丝网印刷电极及其应用
Li et al. 3-aminopropyltriethoxysilanes modified porous silicon as a voltammetric sensor for determination of silver ion
CN111060566A (zh) 利用n掺杂纳米碳球同时检测食品中酪氨酸和色氨酸的方法
CN109254053B (zh) 一种环境雌激素电化学分析传感器的制备方法及应用
CN111157597A (zh) 一种复合修饰电极的制备及同时测定痕量镉离子和铅离子的方法
CN113030210B (zh) 一种碳点/铋膜修饰玻碳电极的制备及检测镉和铅离子的方法
CN113295746B (zh) 一种硫掺杂多孔管束状氮化碳/石墨烯复合材料的制备方法及其应用
Wang et al. Simple and rapid determination of tartrazine using poly (l-arginine)/electrochemically reduced graphene oxide modified glassy carbon electrode
CN109828010B (zh) 检测氯离子的电化学传感器的制备方法及其检测方法
CN109613087A (zh) 冬瓜和牛奶制备用于铅离子检测的电化学传感器的方法
CN114216944B (zh) 一种快速同时检测铅和镉离子的电化学传感器电极及其制备方法和应用
CN113295749B (zh) 氮掺杂石墨烯/离子液体复合材料修饰玻碳电极、其制备方法及肾上腺素定量检测方法
CN113049655A (zh) 罐头食品中镉、铅含量的检测方法
Yang et al. An ion imprinted electrochemical sensor based on flower‐like gold nanoparticles for the detection of trace arsenic (III) ions in water and food samples
Ong et al. Morphology and atomic configuration control of heavy metal attraction modified layer on screen-printed electrode to enhance electrochemical sensing performance
CN113203787B (zh) 一种应用于大浓度范围铜离子检测的电化学传感器
CN115819825B (zh) 一种导电多孔聚合物水凝胶的制备方法、电极、电化学传感器及应用
CN114113249B (zh) 用于婴幼儿奶粉中的重金属提取检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant