CN111961700A - 一种吉他霉素的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种吉他霉素发酵培养基，每1000ml发酵培养基包括：葡萄糖3.0‑10.0g、黄豆饼粉10‑25g、淀粉10.0‑25.0g、氯化铵1.0‑5.0g、磷酸二氢钾0.3‑1.0g、硫酸镁0.5‑5.0g、硫酸锌0.03‑0.1g、碳酸钙1.0‑5.0g和豆油10.0‑40.0g，所述发酵培养基还包括油酸甲酯及表面活性剂。本发明发酵培养基中采用油酸甲酯，其更容易被水解代谢，产生短链脂肪酸，加快大环内脂的合成，同时产生较多的乙酰辅酶，增强代谢过程中酰基转移酶的活性，从而相对提高了A5含量，也使得吉他霉素发酵过程中pH更加稳定，从而降低A1含量，弥补了豆油代谢缓慢的短板带来的不足。

Description

一种吉他霉素的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种吉他霉素发酵培养基、吉他霉素及其发酵方法。
背景技术
吉他霉素(Kitasamycin)，又名柱晶白霉素(Leucomycin，LM)，属于十六元环大环内酯类抗生素，1953年由日本秦藤树等人在日本东京都新宿区大久保土壤中分离得到的一株北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis SK)经发酵、提取、分离得到，至今已有近50多年历史。吉他霉素的结构是由十六元糖昔(ageyeone)、碳霉氮基糖(mye-aminose)、碳霉糖(Myeaeose)三个部分组成，由于产生菌遗传特性和发酵条件的不同，可形成含量不同的各组份。
吉他霉素结构式：
Figure BDA0002659349750000011
A1----R1＝H R2＝COCH2CH(CH3)2
A3----R1＝COCH3 R2＝COCH2CH(CH3)2
A4----R1＝COCH3 R2＝COC3H7
A5----R1＝H R2＝COC3H7
A6----R1＝COCH3 R2＝COC2H5
A7----R1＝H R2＝COC2H5
A8----R1＝COCH3 R2＝COCH3
A9----R1＝H R2＝COCH3
吉他霉素抗菌谱与红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素相似，对革兰氏阳性细菌和阴性球菌、立克次体、螺旋体和大型病毒有较强的抑制作用。临床上，吉他霉素主要用于治疗链球菌，尤其是溶血性链球菌、肺炎球菌所致感染，轻、中度金黄色葡萄球菌感染，以及对青霉素过敏的患者；对链球菌和肺炎球菌等所致的支气管炎、猩红热、化脓性扁桃体炎及败血症等疾患的有效率可达90％，并可用于治疗革兰氏阳性球菌所致的皮肤、软组织、呼吸道感染、其它继发性感染，以及骨髓炎、白喉和梅毒。
近年来，由于吉他霉素在生物体内的残留量低，在兽药及饲料添加剂方面应用广泛，因此，吉他霉素作为一种高效、安全、稳定的药物饲料添加剂，主要用于预防和治疗畜禽呼吸道和消化道疾病，低剂量使用对于畜禽具有显著的促生长作用，属于农业部发布的饲料药物添加剂使用规范中允许在饲料中长时间使用的唯一大环内脂类抗生素。
豆油是从大豆提取出来的油脂，是吉他霉素发酵生产关键原材料之一。豆油经过北里链霉菌分解代谢，生产短链脂肪酸，短链脂肪酸是合成吉他霉素的重要前体。现代分子生物学研究表明，吉他霉素大环内脂的合成是由5个乙酸单位1个丙酸单位1个丁酸单位1个羟基乙酸单位通过与脂肪酸合成相似的聚酮体(polyketide)途径缩合而成，即低级脂肪酸在酶的作用下“头尾”相连形成一条脂肪链，再在环合酶和修饰酶的作用下形成酯环。这表明其重要前体是短链脂肪酸。在实际生产过程中，由于豆油不溶于水且比重较小，往往不能充分被微生物代谢，残余的豆油即影响了发酵条件和发酵水平，同时对发酵下游提取工作带来很大负担。
油酸甲酯是一种不饱和高级脂肪酸酯，由油酸和甲醇反应得到，而油酸以甘油酯的形式在豆油中含量高达20-36％。吐温80和司盘85均为非离子型表面活性剂，可以降低液体界面张力，使互不溶的液体形成乳化，吐温和司盘常作为水包油型乳化剂使用，可以乳化、带溶和增溶。
2015版药典中，吉他霉素A5应为35％～70％，A4应为5％～25％，A1、A13均应为3％～15％；吉他霉素主组分A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3、A13之和不得少于85％。目前现有吉他霉素生产中，部分A1组分高于15％和A5组分低于35％，导致最终产品质量无法达到药典标准。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吉他霉素发酵培养基，其能够使得吉他霉素发酵过程中pH更加稳定，可提高A5含量，降低A1含量，弥补了豆油代谢缓慢的短板带来的不足。
为实现上述目的，本发明提供了一种吉他霉素发酵培养基，每1000ml的所述发酵培养基包括：葡萄糖3.0-10.0g、黄豆饼粉10-25g、淀粉10.0-25.0g、氯化铵1.0-5.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸锌0.03-0.1g、碳酸钙1.0-5.0g和豆油10.0-40.0g，所述发酵培养基还包括油酸甲酯及表面活性剂。
上述培养基中采用油酸甲酯，其较豆油更容易进入代谢利用，且分解后转化为较多的乙酰辅酶，弥补原发酵配比豆油代谢产生的乙酰辅酶量，从而提高A5组分的含量。
在吉他霉素发酵过程中，由于油酸甲酯分子量较小，更容易被水解代谢，产生短链脂肪酸，加快大环内脂的合成，同时产生较多的乙酰辅酶，增强代谢过程中酰基转移酶的活性，从而相对提高A5含量，而因加入油酸甲酯，吉他霉素发酵过程中pH更加稳定，从而降低A1含量。
在一优选的实施方式中，上述油酸甲酯的含量为2.5-10.0ml。
在一优选的实施方式中，上述表面活性剂含量为0.5-2.5ml。
在一优选的实施方式中，上述表面活性剂由吐温80和司盘85组成。
在一优选的实施方式中，上述吐温80和司盘85的体积比例为1:1。
在吉他霉素发酵培养基中使用表面活性剂吐温80和司盘85，主要利用的是其带溶和增溶作用，有利于短链脂肪酸的溶解传递。
在一优选的实施方式中，上述表面活性剂与油酸甲酯混合均匀后，再与其他组分进行混合。
本发明的另一目的在于提供一种吉他霉素的发酵方法，包括：将种子培养液接入上述任意一种吉他霉素发酵培养基内进行发酵生产吉他霉素的步骤。
在一优选的实施方式中，上述种子培养液的配制方法包括：采用500ml三角瓶，每瓶培养基装量50ml，共计10-15瓶，所述种子培养基成分包括(按照1000ml计)：葡萄糖5.0-15.0g、黄豆饼粉10-20g、淀粉15.0-25.0g、蛋白胨2.0-5.0g、酵母粉2.0-5.0g、氯化钠3.0-8.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸铵2.0-5.0g、碳酸钙1.0-5.0g；八层纱布包扎瓶口，灭菌；成熟斜面孢子无菌条件接入摇瓶进行培养；培养结束后取挂壁均匀的10瓶在无菌室合并至2000ml无菌接种瓶内，待用；
优选的，所述灭菌温度为121-123℃，灭菌时间为30分钟；
优选的，所述摇瓶进行培养时摇床转速为220rpm，温度28.0±1.0℃，湿度30-60％，培养时间12-20h。
在一优选的实施方式中，上述发酵培养基配制方法包括：将除表面活性剂、油酸甲酯、豆油和碳酸钙外的其他原料分别投入到配料容器中，加入适量水充分混合，使用氨水调节pH至6.8-7.5，再加入豆油混匀，加入碳酸钙混匀定容，得到除表面活性剂与油酸甲酯之外的发酵培养基，然后将所述表面活性剂与油酸甲酯混合均匀，混入配制好的所述发酵培养基中，最后在发酵罐定容，得到发酵液；
优选的，将配制好的发酵培养基进行灭菌，灭菌温度是121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；
优选的，所述发酵的时间是68-72h；
优选的，所述发酵液用草酸调节pH＝3.0-4.5，过滤；滤液使用氨水调节pH＝8.5-10.5，然后升温30-45℃；再加入醋酸丁酯萃取，萃取液使用磷酸二氢钾缓冲液进行反萃取；所得反萃液使用氨水调节pH＝7.5-10.0，升温至50-65℃结晶30分钟；离心分离，烘干，得到吉他霉素产品。
本发明的另一目的在于提供由上述任意一种发酵方法得到的吉他霉素。。
与现有技术相比，根据本发明具有如下有益效果：
(1)本发明发酵培养基中采用油酸甲酯，在吉他霉素发酵过程中，由于油酸甲酯分子量较小，更容易被水解代谢，产生短链脂肪酸，加快大环内脂的合成，同时产生较多的乙酰辅酶，增强代谢过程中酰基转移酶的活性，从而相对提高了A5含量，而因加入油酸甲酯，吉他霉素发酵过程中pH更加稳定，从而降低A1含量，特别是A1组分，最大降低了5.6％，完全满足2015版药典对吉他霉素的要求，弥补了豆油代谢缓慢的短板带来的不足。
(2)本发明发酵培养基中采用油酸甲酯表面活性剂吐温80和司盘85，具有带溶和增溶作用，有利于短链脂肪酸的溶解传递。
(3)本发明发酵培养基中不采用丝素粉，因为丝素粉为复合蛋白水解产物，其物料来源会造成丝素粉的氨基酸成分偏差，对吉他霉素发酵过程造成不稳定的影响。
具体实施方式
下面对具体实施方式进行详细描述，以便更好地理解本发明。但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例中采用的实验条件和实验方法如下：
种子培养条件和培养过程：取500ml三角瓶，每瓶培养基装量50ml，共计10-15瓶；八层纱布包扎瓶口，灭菌温度121-123℃，灭菌时间是30分钟；成熟斜面孢子无菌条件接入摇瓶进行培养，摇床转速220rpm，温度28.0±1.0℃，湿度30-60％，培养时间12-20h；培养结束取挂壁均匀的10瓶在无菌室合并至2000ml无菌接种瓶内，待用；其中，种子培养基成分(按照1000ml计)：葡萄糖5.0-15.0g、黄豆饼粉10-20g、淀粉15.0-25.0g、蛋白胨2.0-5.0g、酵母粉2.0-5.0g、氯化钠3.0-8.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸铵2.0-5.0g、碳酸钙1.0-5.0g。
发酵培养条件和培养过程：使用15000ml发酵罐(上海傲中生物工程设备有限公司)，发酵培养基计料体积9000ml，溶解氧控制30％以上，并根据溶解氧调整搅拌转速0-800rpm，温度28±1.0℃，进风量9L/分钟，培养时间60-80h；其中，发酵培养基除油酸甲酯和表面活性剂之外的成分(按照1000ml计)：葡萄糖3.0-10.0g、黄豆饼粉10-25g、淀粉10.0-25.0g、氯化铵1.0-5.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸锌0.03-0.1g、碳酸钙1.0-5.0g和豆油10.0-40.0g；发酵培养基的配制方法：将除豆油和碳酸钙外的其他原料分别投入配料容器内加适量水充分混合，使用氨水调节pH至6.8-7.5，然后加入豆油混匀，最后加入碳酸钙混匀定容。
发酵液提取条件和提取过程：发酵液用草酸调节pH＝3.0-4.5，过滤；滤液使用氨水调节pH＝8.5-10.5升温30-45℃，加入醋酸丁酯萃取；萃取液使用磷酸二氢钾缓冲液反萃取；反萃液使用氨水调节pH＝7.5-10.0，升温至50-65℃结晶30分钟；结晶液离心分离得吉他霉素产品，烘干后进行检测。
吉他霉素组分和含量检测方法，按照高效液相检测法，见《中国药典》2015版。
以下实施实例均在采用相同的种子培养条件、发酵培养条件和发酵液提取条件。
实施例1
取吐温80和司盘85各3.0ml加入60ml油酸甲酯中混合均匀，混入配制好的上述发酵培养基中，灌入15000ml发酵罐内加饮用水定容9000ml；使用蒸汽实罐灭菌，灭菌温度121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；将上述配制好的种子培养液火焰保护接入发酵培养基内，发酵70h。提取后进行高效液相检测，结果如下表1：
表1
组分 A5％ A4％ A1％ A13％ 主组分之和％
百分含量 50.8 10.0 11.4 8.6 91.5
实施例2
取吐温80和司盘85各4.5ml加入45ml油酸甲酯中混合均匀，混入配制好的上述发酵培养基中，灌入15000ml发酵罐内加饮用水定容9000ml；使用蒸汽实罐灭菌，灭菌温度121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；将上述配制好的种子培养液火焰保护接入发酵培养基内，发酵72h。提取后进行高效液相检测，结果如下表2：
表2
组分 A5％ A4％ A1％ A13％ 主组分之和％
百分含量 48.5 11.2 10.2 9.0 90.7
实施例3
取吐温80和司盘85各6.0ml加入60ml油酸甲酯中混合均匀，混入配制好的上述发酵培养基中，灌入15000ml发酵罐内加饮用水定容9000ml；使用蒸汽实罐灭菌，灭菌温度121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；将上述配制好的种子培养液火焰保护接入发酵培养基内，发酵68h。提取后进行高效液相检测，结果如下表3：
表3
组分 A5％ A4％ A1％ A13％ 主组分之和％
百分含量 49.3 11.4 9.5 9.6 91.2
实施例4
取吐温80和司盘85各5.0ml加入45ml油酸甲酯中混合均匀，混入配制好的上述发酵培养基中，灌入15000ml发酵罐内加饮用水定容9000ml；使用蒸汽实罐灭菌，灭菌温度121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；将上述配制好的种子培养液火焰保护接入发酵培养基内进行发酵72h。提取后进行高效液相检测，结果如下表4：
表4
组分 A5％ A4％ A1％ A13％ 主组分之和％
百分含量 51.0 10.6 8.9 9.5 90.8
对比例(发酵培养基中不含有油酸甲酯)
取吐温80和司盘85各6.0ml混合均匀，混入配制好的上述发酵培养基中，灌入15000ml发酵罐内加饮用水定容9000ml；使用蒸汽实罐灭菌，灭菌温度121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；将上述配制好的种子培养液火焰保护接入发酵培养基内，发酵72h。提取后进行高效液相检测，结果如下表5：
表5
组分 A5％ A4％ A1％ A13％ 主组分之和％
百分含量 44.5 11.0 14.5 8.9 90.5
将表5中的数据与表1-表4中相应的数据进行对比分析，可知：表1-表4中A5％分别为50.8％、48.5％、49.3％、51.0％，而表5中A5％为44.5％，低于表1-表4中A5的百分含量，也就是说发酵培养基中不含有油酸甲酯时，吉他霉素产品中A5的含量降低了；表1-表4中A1％分别为11.4％、10.2％、9.5％、8.9％，而表5中A1％为14.5％，高于表1-表4中A1的百分含量，也就是说发酵培养基中不含有油酸甲酯时，吉他霉素产品中A1的含量升高了。
而实施例1-实施例4中，由于发酵培养基中加入了油酸甲酯，与对比例中培养基不加油酸甲酯的情况进行对比，发现，发酵所得吉他霉素产品中的A5组分含量提高了，A1组分含量降低了，特别是A1组分，最大降低了5.6％，完全满足2015版药典对吉他霉素的要求。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (5)

1.一种吉他霉素的发酵方法，其特征在于，其包括：将种子培养液接入吉他霉素发酵培养基内进行发酵生产吉他霉素的步骤；
所述吉他霉素发酵培养基，每1000ml的所述发酵培养基包括：葡萄糖3.0-10.0g、黄豆饼粉10-25g、淀粉10.0-25.0g、氯化铵1.0-5.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸锌0.03-0.1g、碳酸钙1.0-5.0g和豆油10.0-40.0g，其特征在于，所述发酵培养基还包括油酸甲酯及表面活性剂；所述油酸甲酯的含量为2.5-10.0ml，所述表面活性剂含量为0.5-2.5ml；
所述表面活性剂由吐温80和司盘85组成。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述种子培养液的配制方法包括：采用500ml三角瓶，每瓶培养基装量50ml，共计10-15瓶，所述种子培养基成分包括(按照1000ml计)：葡萄糖5.0-15.0g、黄豆饼粉10-20g、淀粉15.0-25.0g、蛋白胨2.0-5.0g、酵母粉2.0-5.0g、氯化钠3.0-8.0g、磷酸二氢钾0.3-1.0g、硫酸镁0.5-5.0g、硫酸铵2.0-5.0g、碳酸钙1.0-5.0g；八层纱布包扎瓶口，灭菌；成熟斜面孢子无菌条件接入摇瓶进行培养；培养结束后取挂壁均匀的10瓶在无菌室合并至2000ml无菌接种瓶内，待用；
所述灭菌温度为121-123℃，灭菌时间为30分钟；
所述摇瓶进行培养时摇床转速为220rpm，温度28.0±1.0℃，湿度30-60％，培养时间12-20h。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基配制方法包括：将除表面活性剂、油酸甲酯、豆油和碳酸钙外的其他原料分别投入到配料容器中，加入适量水充分混合，使用氨水调节pH至6.8-7.5，再加入豆油混匀，加入碳酸钙混匀定容，得到除表面活性剂与油酸甲酯之外的发酵培养基，然后将所述表面活性剂与油酸甲酯混合均匀，混入配制好的所述发酵培养基中，最后在发酵罐定容，得到发酵液；
将配制好的发酵培养基进行灭菌，灭菌温度是121-123℃，保温30分钟，冷却至28.0℃；
所述发酵的时间是68-72h；
所述发酵液用草酸调节pH＝3.0-4.5，过滤；滤液使用氨水调节pH＝8.5-10.5，然后升温30-45℃；再加入醋酸丁酯萃取，萃取液使用磷酸二氢钾缓冲液进行反萃取；所得反萃液使用氨水调节pH＝7.5-10.0，升温至50-65℃结晶30分钟；离心分离，烘干，得到吉他霉素产品。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述吐温80和司盘85的体积比例为1:1。
5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述表面活性剂与油酸甲酯混合均匀后，再与其他组分进行混合。
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