CN113174419A - 提高奥利万星中间体a82846b发酵产量的补料方法 - Google Patents
提高奥利万星中间体a82846b发酵产量的补料方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，属于微生物发酵技术领域，奥利万星中间体A82846B的发酵方式为补料分批发酵；补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为20‑50％的甘油和40‑60％的葡萄糖；流加甘油的时间为补料分批发酵的对数生长期的中后期至发酵末期；流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的稳定产抗期至发酵终止。该补料方法能够显著提升发酵水平，并稳定在≥2500mg/L，且该补料方法的原料安全、易得，补料方法简单，易于在工业化生产中大规模推广使用，能够显著增加企业生产的效益。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法。
背景技术
奥利万星(Oritavancin)是在第一代糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁的基础上开发的第二代新型半合成抗生素，主要通过微生物来源的次级代谢产物A82846B经化学半合成得到。奥利万星是一种可采用单剂量治疗方案的抗生素，也是第一个经过美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准在临床上用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)的抗生素药物。其抑菌机制与万古霉素类似，均是通过阻断肽聚糖生物合成时转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成，对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)杀灭效果显著。
A82846B是由荒漠拟孢囊菌属(Kibdelosporangiumaridum)微生物发酵产生，发酵液中共有两种结构类似物，分别是A82846A和A82846C，结构式见图1所示，图1中A82846A的R1＝H，R2＝Cl，R3＝H；A82846B的R1＝Cl，R2＝Cl，R3＝H；A82846C的R1＝H，R2＝H，R3＝H。A82846B由两个基本结构组成，即肽基部分和糖基部分；肽基部分为中心七肽核，由D-甲基亮氨酸(第1位)、β-羟酪氨酸(第2、6位)、L-天冬酰胺(第3位)、4-羟基苯甘氨酸(第4、5位)和3,5-二羟基苯甘氨酸(第7位)组成，其中2-4和4-6氨基酸通过芳基醚键交联成2个相连的环，5-7氨基酸通过芳基-芳基键交联成1个环，共同构成A82846B的刚性骨架；糖基部分由结合与第4位氨基酸侧链的双糖L-4-表-万古糖胺和第6位氨基酸残基上的L-4-表-万古糖胺单元构成。
近年来，国内科研院所和医药企业对生产A82846B的菌种和发酵工艺进行了不同程度的探索，申请号为201510214406.4的中国发明专利，公开了一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法，发酵水平为2315mg/L。根据目前的发酵工艺很难再进一步突破提高发酵产量，但发酵产量的提升，对于工业化生产降低生产成本、提高效益具有重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够提高奥利万星中间体A82846B发酵产量至发酵水平稳定维持在2500mg/L及以上的补料方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，奥利万星中间体A82846B的发酵方式为补料分批发酵；
所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为20-50％的甘油和40-60％的葡萄糖；
流加甘油的时间为补料分批发酵的对数生长期的中后期至发酵末期；流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的稳定产抗期至发酵终止。
本发明的有益效果在于：本发明通过改变奥利万星中间体A82846B发酵时对发酵液补料的方法，提供了一种提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，能够显著提升发酵水平，并稳定在≥2500mg/L，且该补料方法的原料为甘油和葡萄糖，原料安全且易得，补料方法简单易操作，易于在工业化生产中大规模推广使用，能够显著增加企业生产的效益。
附图说明
图1所示为A82846的结构式。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，奥利万星中间体A82846B的发酵方式为补料分批发酵；
所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为20-50％(体积百分比)的甘油和40-60％(体积百分比)的葡萄糖；
流加甘油的时间为补料分批发酵的对数生长期的中后期至发酵末期；流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的稳定产抗期至发酵终止。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明通过改变奥利万星中间体A82846B发酵时对发酵液补料的方法，提供了一种提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，该补料方法避免了补充碳源过多引起的反馈抑制效应，为发酵过程提供了适度的速效碳源，避免了速效碳源较低影响菌丝的生长，同时也避免了速效碳源补充较高影响导致发酵过程中pH波动影响代谢；本发明提供的补料的方法，使得应用该补料方法进行发酵后能够突破奥利万星中间体A82846B现有的发酵水平，提升发酵至2500mg/L，且该补料方法的原料为甘油和葡萄糖，原料价格低、安全且易得，补料方法简单，经测试可在60T的大型发酵罐实现稳定发酵，并保持发酵水平稳定在2500mg/L及以上，该补料方法适于在工业化生产中大规模推广使用，能够显著增加企业生产的效益。
进一步的，流加甘油的时间为补料分批发酵的第40±5h-120±5h。
进一步的，补料分批发酵的第40±5h-70±5h，流加甘油的速率为0.05g/(h·L)；补料分批发酵的第70±5h-120±5h，流加甘油的速率为0.10g/(h·L)。
从上述描述可知，通过控制不同发酵阶段甘油流加的速率，能够有效对速效碳源的补充量进行控制，避免过高或过低对代谢或菌丝生长造成的影响。
进一步的，流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的第70±5h-168±5h。
进一步的，流加葡萄糖过程中发酵液中的还原糖浓度为15-20g/L。
进一步的，补料分批发酵过程中发酵液的pH为6.5-7.5。
实施例1：
提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：
发酵培养的第40-69h(对数生长中后期)，流加体积百分比为30％的甘油，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第70-120h(发酵末期)，流加体积百分比为30％的甘油，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第70-168h(稳定产抗期至发酵终止)，流加体积百分比为50％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
实施例2：
提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：发酵培养的第35-68h，流加体积百分比为50％的甘油，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第69-115h，流加体积百分比为50％的甘油，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第69-170h，流加体积百分比为40％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
实施例3：
提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：发酵培养的第45-74h，流加体积百分比为20％的甘油，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第75-122h，流加体积百分比为20％的甘油，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第75-173h，流加体积百分比为60％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
实施例4：
提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，具体包括以下步骤：发酵培养的第36-64h流加体积百分比为40％的甘油，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第65-125h，流加体积百分比为40％的甘油，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第65-163h，流加体积百分比为60％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
对比例1：
奥利万星中间体A82846B的补料方法，具体包括以下步骤：
发酵培养的第40-69h，流加体积百分比为30％的乙酸盐(乙酸钠)，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第70-120h，流加体积百分比为30％的乙酸盐(乙酸钠)，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第70-168h，流加体积百分比为50％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
对比例2：
奥利万星中间体A82846B的补料方法，具体包括以下步骤：
发酵培养的第40-69h，流加体积百分比为30％的酪氨酸，流加的速率为0.05g/(h·L)；
发酵培养的第70-120h，流加体积百分比为30％的酪氨酸，流加的速率为0.10g/(h·L)；
发酵培养的第70-168h，流加体积百分比为50％葡萄糖，流加过程中发酵液中的还原糖浓度维持在15-20g/L；
流加补料的全程，发酵液pH均稳定在6.5-7.5。
实施例5：
发酵制备奥利万星中间体A82846B的方法，包括以下方法：
步骤1、将东方拟无枝酸菌NRRL 18099接种到第一种子培养基中进行摇瓶种子培养；其中，培养周期为72±6h，培养温度为29±1℃，摇床转速240-260rpm，接种量为1-1.5％，得到种子液；
第一种子培养基的配方：2.0wt％的可溶性淀粉、1.0wt％的葡萄糖、1.5wt％黄豆饼粉、0.5wt％的酵母提取物、0.1wt％的碳酸钙，pH7.0±0.2；
步骤2、将种子液按接种量0.13-0.20％接种于第二种子培养基中进行种子罐培养；其中，培养周期为72±6h，培养温度为30±1℃，空气流量：1:0.8-1:1.5vvm，培养转速30-40HZ，培养罐压0.03±0.01MPa，得到种子罐液；
第二种子培养基的配方：2.0wt％的可溶性淀粉、1.0wt％的葡萄糖、1.5wt％黄豆饼粉、0.5wt％的酵母提取物、0.1wt％的碳酸钙、0.05wt％的泡敌；
步骤3、将种子罐液接种量10±1％接种于发酵培养基中进行发酵培养为；其中，培养周期为7±1d，培养温度为32±1℃，空气流量：1:0.6-1:0.8vvm，培养转速35-50HZ，培养罐压0.03±0.01MPa，培养溶氧≥30％；
发酵培养基的配方：3.0wt％的麦芽糊精、1.0wt％的葡萄糖、3.0wt％的的蔗糖、2.5wt％的黄豆粉、0.5wt％的酵母粉、0.5wt％的玉米蛋白粉、0.15wt％的的氯化铵、0.2wt％的的碳酸钙、0.8wt％的无水氯化钙10g/L、0.05wt％的泡敌；
其中，分别采用实施例1-4(实验组1-4)和对比例1-2(实验组5-6)的补料方法在发酵培养过程中进行补料；
步骤4、采用HPLC测定所得发酵液中A82846B的含量。
实施例6：
实施例6与实施例5的区别在于，实施例6的步骤3中不进行补料(实验组7)。
实施例5和实施例6中采用、不采用或采用不同补料方式制备得到A82846B的产量见表1所示。
表1
综上所述，本发明提供的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，能够显著提升发酵水平，并稳定在≥2500mg/L，且该补料方法的原料为甘油和葡萄糖，原料易得，补料方法简单，无需配合复杂的生产设备即可使用，易于在工业化生产中大规模推广使用，能够显著增加企业生产的效益。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，奥利万星中间体A82846B的发酵方式为补料分批发酵；
所述补料分批发酵的补料方式为流加补料，流加物质为20-50％的甘油和40-60％的葡萄糖；
流加甘油的时间为补料分批发酵的对数生长期的中后期至发酵末期；流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的稳定产抗期至发酵终止。
2.根据权利要求1所述的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，流加甘油的时间为补料分批发酵的第40±5h-120±5h。
3.根据权利要求2所述的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，补料分批发酵的第40±5h-70±5h，流加甘油的速率为0.05g/(h·L)；补料分批发酵的第70±5h-120±5h，流加甘油的速率为0.10g/(h·L)。
4.根据权利要求1所述的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，流加葡萄糖的时间为补料分批发酵的第70±5h-168±5h。
5.根据权利要求1所述的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，流加葡萄糖过程中发酵液中的还原糖浓度为15-20g/L。
6.根据权利要求1所述的提高奥利万星中间体A82846B发酵产量的补料方法，其特征在于，补料分批发酵过程中发酵液的pH为6.5-7.5。
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