CN111929434B - 一种高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;试剂R1包括:缓冲液、电解质、表面活性剂、反应促进剂、稳定剂、防腐剂;试剂R2包括:缓冲液、抗体包被的胶乳颗粒、表面活性剂、水杨酸钠、甘油、稳定剂、防腐剂。试剂R2的pH值为7.8‑8.3。本发明通过在试剂R2中添加水杨酸钠和甘油,水杨酸钠解离胶乳颗粒上的低聚物,甘油维持胶乳颗粒的悬浮状态,并进一步限定试剂R2的pH值为7.8‑8.3,有利于高浓度甘油的分散,有利于维持试剂的电荷平衡,并促进低聚物的快速分离,加快试剂趋于稳定状态;从而提高试剂R2的稳定性,最终提高试剂盒检测灵敏性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于免疫测定技术领域,涉及一种高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒。
背景技术
胶乳增强免疫比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。其检验原理是在高分子纳米微球表面包被特定的抗体,当样品中的抗原与包被有特定抗体的纳米微球混合后,能够在短时间内迅速聚集在一起,形成抗原-抗体-纳米微球复合物,从而引起吸光度的变化。且反应液吸光度的变化值与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反应样品中被测抗原的含量。用胶乳增强免疫比浊法检测样品中抗原的含量具有如下优点:(1)免疫复合物能在短时间内迅速聚集,大大提高了检测试剂的灵敏度;(2)可直接应用于普通生化分析仪,操作简单,容易实现自动化,可在各级基层医疗机构普及应用;(3)检测结果不受人为操作和外界因素的干扰,结果具有良好的重复性。
现有的胶乳增强免疫比浊测定试剂盒一般包括试剂R1、试剂R2、校准试剂、质控试剂等,试剂R2中的主要成分是包被有抗体的纳米微球。在这个抗体-胶乳系统中,纳米微球与纳米微球、纳米微球与抗体、抗体与抗体之间存在着物理化学等多种相互作用力,这些力的相互平衡是维持抗体-胶乳系统稳定,保证产品始终具有较好免疫反应性的重要前提。然而,在实际储存过程中,受多方面因素的影响,试剂R2体系往往不稳定,其反应灵敏度会随着储存时间的延长而逐渐下降。
发明内容
本发明针对已有胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒中存在的不足,通过在试剂R2中添加水杨酸钠和甘油成分,提高试剂R2体系的储藏稳定性,从而提高试剂盒的灵敏性和准确性。
本发明的以上目的通过以下技术方案实现:一种高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2;
试剂R1包括:缓冲液、电解质、表面活性剂、反应促进剂、稳定剂、防腐剂;
试剂R2包括:缓冲液、抗体包被的胶乳颗粒、表面活性剂、水杨酸钠、甘油、稳定剂、防腐剂。
包被有抗体的胶乳颗粒在长期存储过程中会因为自身的重力作用而逐渐聚集于缓冲液底部,形成沉淀,从而破坏试剂R2的稳定性,本发明在试剂R2中添加的甘油有助于抗体-胶乳颗粒克服重力作用,使其均匀的悬浮于缓冲溶液中并保持一个稳定的状态。胶乳颗粒在制备时往往会残留部分低聚物,这些低聚物会随着时间的延长逐渐从水溶液中解离出来,使试剂的免疫反应性逐渐下降,造成试剂的不稳定,本发明添加的水杨酸钠有助于残留的低聚物从微球中快速解离,使试剂R2的免疫反应性始终维持在一个稳定的状态。
本发明通过在胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒的试剂R2中添加甘油和水杨酸钠,有效提高试剂R2的稳定性。
作为优选,试剂R2中,所述水杨酸钠的浓度为25-100mmol/L。
作为优选,试剂R2中,所述甘油的质量分数为5-15%。
在试剂R2中,水杨酸钠和甘油的含量对其稳定性至关重要:甘油的添加量与其助悬作用成正比,但是甘油的过多添加,会导致试剂变得粘稠,试剂R2中各成分分布不均匀,影响加样均匀性;而如果添加过多的水杨酸钠,试剂R2的电荷平衡会受到较大的破坏,影响胶乳颗粒稳定性。
作为优选,所述试剂R2的pH值为7.8-8.3。
甘油添加量大于10%时,试剂R2的抗体-胶乳颗粒能较好地克服重力作用,保持长时间稳定,但是试剂中存在较高含量的甘油会使溶液粘稠,导致应用过程中加样不均,影响反应值,造成测定结果不稳定;本发明将试剂R2的pH值优选为7.8-8.3,在碱性条件可以改善甘油的分散性,使其在储存过程中始终均匀的溶解在反应缓冲液中,提高试剂R2各成分的均匀性,使测定结果始终保持稳定。此外,本发明加入的水杨酸钠虽然有助于解离低聚物,但是它的加入也会改变试剂的电荷平衡,使微球间的静电斥力遭到破坏,本发明将试剂R2缓冲液体系调成碱性,有助于增加溶液中的负电荷,维持胶乳颗粒的稳定,为水杨酸钠可以发挥解离作用创造安全稳定的环境。水杨酸钠解离胶乳颗粒表面的低聚物需要一定时间,在中性条件下,低聚物被水杨酸钠解离完全所需时间为1-2个月,通过调节试剂R2的pH值为7.8-8.3可以加速低聚物的解离,通常在5-10d就能解离完全,加快试剂趋于稳定状态。
作为优选,试剂R1和试剂R2中,缓冲液的浓度分别为10-100mmol/L,所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或多种。
作为优选,试剂R1中,所述电解质的浓度为20-200mmol/L,所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸钠中的一种或多种。
作为优选,试剂R1中,所述反应促进剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇35000、溴化己二甲氨、聚凝胺中的一种或多种。
作为优选,试剂R1和试剂R2中,表面活性剂的质量分数分别为0.01-0.5%,所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、茶皂素、曲拉通X-100、吐温20、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、Emulgen B-66、Emulgen A-90中的一种或多种。
作为优选,试剂R1和试剂R2中,稳定剂的质量分数分别为0.1-1%,所述稳定剂为BSA、酪蛋白、明胶、小牛血清中的一种或多种。
作为优选,试剂R1和试剂R2中,防腐剂的质量分数分别为0.05-0.1%,所述防腐剂为PC-150、PC-300、叠氮化钠、PC-500、山梨酸盐类、庆大霉素中的一种或多种。
作为优选,所述试剂R1的pH为7.0-8.0。
试剂R2中抗体包被的胶乳颗粒的成分和浓度不作限制,视实际检测项目而定。
所述高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒中还包括校准品和质控品,校准品和质控品主要由特定抗原、缓冲液、防腐剂组成。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
(1)本发明通过在试剂R2中添加水杨酸钠和甘油,水杨酸钠解离胶乳颗粒上的低聚物,甘油维持胶乳颗粒的悬浮状态,共同提高试剂R2的稳定性,从而提高试剂盒检测灵敏性和准确性;
(2)本发明进一步限定试剂R2的pH值为7.8-8.3,使试剂R2的pH值处于碱性条件下,有利于高浓度甘油的分散,有利于维持试剂的电荷平衡,防止胶乳颗粒的聚集,并促进低聚物的快速分离,加快试剂趋于稳定状态;
(3)本发明通过在试剂R2中添加水杨酸钠和甘油,并调节pH值为7.8-8.3来提高试剂盒的稳定性,具有通用型,可应用于所有采用胶乳增强免疫比浊法原理的试剂盒中。
具体实施方式
在下文中,将通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步描述说明。然而,这些实施方式是示例性的,本发明公开内容不限于此。如果无特殊说明,本发明以下具体实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料,实施例中所采用的方法,均为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品。
其中,试剂R1为:20mmol/L磷酸缓冲液、150mmol/L NaCl、0.1wt%吐温20、0.6wt%聚乙二醇6000、0.3wt%BSA、0.1wt%叠氮钠,pH 7.0。
试剂R2为:20mmol/L磷酸缓冲液、0.1wt%基质金属蛋白酶-3抗体包被的胶乳颗粒、0.05wt%吐温20、50mmol/L水杨酸钠、12wt%甘油、0.1wt%BSA、0.1wt%叠氮钠组成,pH8.0。
校准品包括:6个浓度水平的基质金属蛋白酶-3抗原,6个浓度水平分别为1600ng/ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、0ng/ml。
质控品包括:100ng/ml、200ng/ml基质金属蛋白酶-3抗原、0.2wt%叠氮钠。
对比例1
对比例1的试剂盒与实施例1的区别在于,对比例1试剂R2中没有包括甘油,其它与实施例1相同。
对比例2
对比例2的试剂盒与实施例1的区别在于,对比例2试剂R2中没有包括水杨酸钠,其它与实施例1相同。
对比例3
对比例3的试剂盒与实施例1的区别在于,对比例3试剂R2的pH为7.3,其它与实施例1相同。
对比例4
对比例4的试剂盒与实施例1的区别在于,对比例4试剂R2的pH为8.7,其它与实施例1相同。
将实施例1、对比例1-4的试剂R1和试剂R2组合测定1600ng/ml的校准品,检测步骤如下表1所示,吸光度值变化结果如表2所示,表2中A值为主波长下第二个测光点的吸光度值。
表1
表2
从表2中可知,对比例1的试剂R2中因缺少甘油,基质金属蛋白酶-3抗体包被的胶乳颗粒在长期存储过程中因自身的重力作用而逐渐聚集于缓冲液底部,形成沉淀,导致A吸光度值增加,吸光度变化值ΔA明显下降;而对比例2的试剂R2中缺少水杨酸钠,胶乳颗粒上的低聚物解离较慢,在储藏30d内试剂能保持较好的稳定性,但是随着胶乳颗粒上的低聚物逐渐释放,稳定性显著下降;对比例3的试剂R2中虽然含有水杨酸钠,但是试剂R2的pH值为7.3,在该pH下,胶乳颗粒上的低聚物解离速度显著低于实施例1的,储藏60d后,胶乳颗粒上的低聚物才解离完全,但因水杨酸钠的加入改变了试剂R2的电荷平衡,胶乳颗粒在长期存储过程中会产生聚集,导致储藏后期的稳定性低于实施例1的;对比例4试剂R2的pH为8.7,试剂R2的pH过高,不利于胶乳颗粒稳定性。
实施例2
本实施例的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品。
其中,试剂R1为:50mmol/L Tris缓冲液、150mmol/L NaCl、0.1wt%曲拉通X-100、0.1wt%PEG-35000、0.3wt%酪蛋白、0.1wt%叠氮钠,pH 8.0。
试剂R2为:100mmol/L甘氨酸缓冲液、0.2wt%Ⅳ型胶原蛋白抗体包被的胶乳颗粒、0.05wt%曲拉通X-100、50mmol/L水杨酸钠、11wt%甘油、0.1wt%酪蛋白、0.1wt%叠氮钠,pH 8.2。
校准品包括:6个浓度水平的Ⅳ型胶原蛋白抗原,6个浓度水平分别为600ng/ml、300ng/ml、150ng/ml、75ng/ml、0ng/ml。
质控品包括:95ng/ml、230ng/mlⅣ型胶原蛋白、0.2wt%叠氮钠。
对比例5
对比例5的试剂盒与实施例2的区别在于,对比例5试剂R2中没有包括甘油,其它与实施例2相同。
对比例6
对比例6的试剂盒与实施例2的区别在于,对比例6试剂R2中没有包括水杨酸钠,其它与实施例2相同。
对比例7
对比例7的试剂盒与实施例2的区别在于,对比例7试剂R2的pH为7.2,其它与实施例2相同。
对比例8
对比例8的试剂盒与实施例2的区别在于,对比例8试剂R2的pH为8.6,其它与实施例2相同。
将实施例2、对比例5-8的试剂R1和试剂R2组合测定600ng/ml的校准品,检测步骤如下表3所示,吸光度值变化结果如表4所示,表4中A值为主波长下第二个测光点的吸光度值。
表3
表4
从表4中可知,对比例5的试剂R2中因缺少甘油,Ⅳ型胶原蛋白抗体包被的胶乳颗粒在长期存储过程中因自身的重力作用而逐渐聚集于缓冲液底部,形成沉淀,导致A吸光度值增加,吸光度变化值ΔA明显下降;而对比例6的试剂R2中缺少水杨酸钠,胶乳颗粒上的低聚物解离较慢,在储藏30d内试剂能保持较好的稳定性,但是随着胶乳颗粒上的低聚物逐渐释放,稳定性显著下降;对比例7的试剂R2中虽然含有水杨酸钠,但是试剂R2的pH值为7.2,在该pH下,胶乳颗粒上的低聚物解离速度显著低于实施例2的,储藏30-60d后,胶乳颗粒上的低聚物才解离完全,但因水杨酸钠的加入改变了试剂R2的电荷平衡,胶乳颗粒在长期存储过程中会产生聚集,导致储藏后期的稳定性低于实施例2的;对比例8试剂R2的pH为8.6,试剂R2的pH过高,不利于胶乳颗粒稳定性。
实施例3
本实施例的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品。
其中,试剂R1为:100mmol/L MES缓冲液、150mmol/L NaCl、0.1wt%Emulgen A-90、0.6wt%PEG-6000、0.3wt%明胶、0.1wt%叠氮钠,pH 7.5。
试剂R2为:50mmol/L Hepes缓冲液、0.3wt%免疫球蛋白E抗体包被的胶乳颗粒、0.05wt%Emulgen A-90、25mmol/L水杨酸钠、13wt%甘油、0.1wt%明胶、0.1%wt叠氮钠,pH7.8。
校准品包括:6个浓度水平的免疫球蛋白E抗原,6个浓度水平分别为1000IU/ml、500IU/ml、200IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、0IU/ml。
质控品包括:85.3IU/ml、406.3IU/ml免疫球蛋白E抗原、0.1wt%叠氮钠。
对比例9
对比例9的试剂盒与实施例3的区别在于,对比例9试剂R2中没有包括甘油,其它与实施例3相同。
对比例10
对比例10的试剂盒与实施例3的区别在于,对比例10试剂R2中没有包括水杨酸钠,其它与实施例3相同。
对比例11
对比例11的试剂盒与实施例3的区别在于,对比例11试剂R2的pH为7.0,其它与实施例3相同。
对比例12
对比例12的试剂盒与实施例3的区别在于,对比例12试剂R2的pH为8.5,其它与实施例3相同。
将实施例3、对比例9-12的试剂R1和试剂R2组合测定1000IU/ml的校准品,检测步骤如下表5所示,吸光度值变化结果如表6所示,表6中A值为主波长下第二个测光点的吸光度值。
表5
表6
从表6中可知,对比例9的试剂R2中因缺少甘油,免疫球蛋白E抗体包被的胶乳颗粒在长期存储过程中因自身的重力作用而逐渐聚集于缓冲液底部,形成沉淀,导致A吸光度值增加,吸光度变化值ΔA明显下降;而对比例10的试剂R2中缺少水杨酸钠,胶乳颗粒上的低聚物解离较慢,在储藏30d内试剂能保持较好的稳定性,但是随着胶乳颗粒上的低聚物逐渐释放,稳定性显著下降;对比例11的试剂R2中虽然含有水杨酸钠,但是试剂R2的pH值为7.0,在该pH下,胶乳颗粒上的低聚物解离速度显著低于实施例3的,储藏60d后,胶乳颗粒上的低聚物才解离完全,但因水杨酸钠的加入改变了试剂R2的电荷平衡,胶乳颗粒在长期存储过程中会产生聚集,导致储藏后期的稳定性低于实施例3的;对比例12试剂R2的pH为8.5,试剂R2的pH过高,不利于胶乳颗粒稳定性。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (7)
1.一种高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2;
试剂R1包括:缓冲液、电解质、表面活性剂、反应促进剂、稳定剂、防腐剂;
试剂R2包括:缓冲液、抗体包被的胶乳颗粒、表面活性剂、水杨酸钠、甘油、稳定剂、防腐剂;
所述水杨酸钠的浓度为25-100mmol/L;
试剂R2中,所述甘油的质量分数为5-15%;
所述试剂R2的pH值为7.8-8.3。
2.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和试剂R2中,缓冲液的浓度分别为10-100mmol/L,所述缓冲液为Tris缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1中,所述电解质的浓度为20-200mmol/L,所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1中,所述反应促进剂为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇35000、溴化己二甲氨、聚凝胺中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和试剂R2中,表面活性剂的质量分数分别为0.01-0.5%,所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、茶皂素、曲拉通X-100、吐温20、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、Emulgen B-66、Emulgen A-90中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和试剂R2中,稳定剂的质量分数分别为0.1-1%,所述稳定剂为BSA、酪蛋白、明胶、小牛血清中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的高稳定性的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和试剂R2中,防腐剂的质量分数分别为0.05-0.1%,所述防腐剂为PC-150、PC-300、叠氮化钠、PC-500、山梨酸盐类、庆大霉素中的一种或多种。
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