CN111929370A

CN111929370A - 一种检测普瑞巴林口服溶液中有关物质的方法

Info

Publication number: CN111929370A
Application number: CN202010126713.8A
Authority: CN
Inventors: 郑爱萍; 李静如; 王增明; 高静; 张慧; 李蒙
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111929370B

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种检测普瑞巴林口服溶液中有关物质的方法。具体地，本发明涉及一种检测普瑞巴林口服溶液中的有关物质的方法，其为HPLC方法，其中，HPLC的条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温20℃‑40℃；流动相A为20‑30mmol/L的磷酸二氢钾溶液，pH为6.2‑7.0；流动相B为甲醇；流速0.5‑1.5mL/min；进样量10‑30μL；检测波长210nm。本发明的方法灵敏度高、重复性好、准确度高，可用于普瑞巴林口服溶液有关物质的质量控制，并且显著优于美国药典和欧洲药典中的检测方法。

Description

一种检测普瑞巴林口服溶液中有关物质的方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种检测普瑞巴林口服溶液中有关物质的方法。

背景技术

普瑞巴林(pregabalin)是一种γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂,临床常用于治疗带状疱疹神经痛、纤维肌痛综合征等神经病理性疼痛,以及成年患者局部不全性癫痫发作,广泛性焦虑症等疾病。Lyrica(普瑞巴林)是全球最畅销的镇痛药之一，FDA批准用于治疗与糖尿病周围神经病变神经痛、带状疱疹后神经痛、脊髓损伤相关神经痛、纤维肌痛相关神经痛以及特定成人癫痫患者部分性发作。普瑞巴林化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，结构式如下面的式I所示：

目前《中国药典》尚无普瑞巴林的有关物质控制方法，而《美国药典》(USP41-NF36)、《欧洲药典》(EP9.0)仅收载了普瑞巴林原料药的有关物质方法，二者均存在样品辅料峰保留时间太长，分离度小，理论塔板数低、溶剂峰干扰有关物质测定等问题，并且也不适用于普瑞巴林口服溶液的质量控制。

目前尚无其他文献报道普瑞巴林口服溶液有关物质的检测方法，因此，开发可以针对普瑞巴林口服溶液的有关物质检测方法，对其质量控制具有重要意义。

发明内容

本申请的发明人开发了一种普瑞巴林口服溶液有关物质的检测方法，该方法专属性好，能将可能的工艺杂质、降解杂质与主成分有效分开，该方法灵敏度高、重复性好、准确度高，可用于普瑞巴林口服溶液有关物质的质量控制，并且显著优于美国药典和欧洲药典中的检测方法。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种检测普瑞巴林口服溶液中的有关物质的方法，其为HPLC方法，

其中，HPLC的条件如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温20℃-40℃；

流动相A为20-30mmol/L的磷酸二氢钾溶液，pH为6.2-7.0；

流动相B为甲醇(色谱级纯甲醇)；

流速0.5-1.5mL/min；

进样量10-30μL；

检测波长210nm；

其中，所述有关物质包括选自如下的任意1种、任意2种、任意3种或4种：

杂质A：(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；

杂质B：3-异丁基戊二酸；

杂质D：(S)-4-异丁基-2-吡咯烷酮(又称为内酰胺)；和

杂质E：3-[[[2-(羧甲基)-4-甲基戊基]氨甲酰氨基]甲基]-5-甲基己酸二钠盐。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述有关物质包括(S)-4-异丁基-2-吡咯烷酮，以及选自(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸、3-异丁基戊二酸和3-[[[2-(羧甲基)-4-甲基戊基]氨甲酰氨基]甲基]-5-甲基己酸二钠盐中的任意1种、任意2种或任意3种。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述有关物质包括上述4种。

在本发明的一个或多个实施方式中，普瑞巴林口服溶液中的普瑞巴林、羟苯甲酯、羟苯丙酯以及各有关物质的分离度均大于2.0。

在本发明的一个或多个实施方式中，普瑞巴林的保留时间为小于或等于20分钟，羟苯甲酯、羟苯丙酯和有关物质的保留时间均小于或等于45分钟。

在本发明的一个或多个实施方式中，普瑞巴林的保留时间为小于或等于15分钟，羟苯甲酯、羟苯丙酯和有关物质的保留时间均小于或等于30分钟。

在本发明的一个或多个实施方式中，普瑞巴林的保留时间为小于或等于10分钟(优选小于或等于8分钟，或者小于或等于6分钟)，羟苯甲酯、羟苯丙酯和有关物质的保留时间均小于或等于25分钟。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述普瑞巴林口服溶液中含有有效量的普瑞巴林，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述辅料包括羟苯酯类抑菌剂例如羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。优选地，所述辅料还包括pH调节剂例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠。更优选地，所述辅料还包括甜味剂例如三氯蔗糖，和/或香精例如草莓香精。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述普瑞巴林口服溶液包括如下组分：

有效量的普瑞巴林、适量的羟苯甲酯、适量的羟苯丙酯、适量的pH调节剂例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠、适量的甜味剂例如三氯蔗糖以及适量的香精例如草莓香精；

优选地，所述普瑞巴林口服溶液包括如下组分：

普瑞巴林15-25mg/mL、羟苯甲酯1-1.5mg/mL、羟苯丙酯0.1-0.2mg/mL、适量的pH调节剂例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠、适量的甜味剂例如三氯蔗糖以及适量的香精例如草莓香精；

更优选地，所述普瑞巴林口服溶液包括如下组分：

普瑞巴林20mg/mL、羟苯甲酯1.3mg/mL、羟苯丙酯0.163mg/mL、适量的pH调节剂例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠、适量的甜味剂例如三氯蔗糖以及适量的香精例如草莓香精。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述普瑞巴林口服溶液通过包括如下步骤的制备方法制得：

将纯化水加热至60℃以上，加入羟苯酯类抑菌剂(例如羟苯甲酯和/或羟苯丙酯)并溶解，制得抑菌剂水溶液；冷却后加入普瑞巴林、pH调节剂(例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠；优选pH为5.5-6.5)、甜味剂例如三氯蔗糖、香精例如草莓香精等辅料搅拌均匀，即得。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述色谱柱为CPACELL PAK MGII，优选为CPACELL PAK C18 MGII；优选地，色谱柱的参数为4.6mm x 250mm,5.0μm；或者为4.6mm x250mm,10.0μm。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述柱温为25℃-35℃、26℃-34℃、28℃-32℃或30℃。

在本发明的一个或多个实施方式中，流动相A为22-28mmol/L、24-26mmol/L或者25mmol/L的磷酸二氢钾溶液；

和/或

流动相A的pH为6.5-6.9或6.7；优选地，所述pH通过氨水调节得到。

在本发明的一个或多个实施方式中，流速为0.8-1.2mL/min或1.0mL/min。

在本发明的一个或多个实施方式中，进样量为18-25μL、18-22μL或20μL。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的检测方法，

其中，HPLC的条件如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温25℃-35℃；

流动相为25mmol/L的磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH为6.7；

流速0.8-1.2mL/min；

进样量18-22μL；

检测波长210nm；

优选地，HPLC的条件如下：

色谱柱为CPACELL PAK C18 MGII；

柱温28℃-32℃；

流动相为25mmol/L的磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH为6.7；

流速1.0mL/min；

进样量20μL；

检测波长210nm。

在本发明的一个或多个实施方式中，所述的检测方法，其中，洗脱程序如下：

在本发明的一个或多个实施方式中，有关物质检测方法样品配制：量取普瑞巴林口服溶液适量，用稀释剂(流动相A)稀释制成每1ml约含普瑞巴林4mg的溶液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用稀释剂稀释制成每1ml约含普瑞巴林4ug的溶液作为对照溶液；

在本发明的一个或多个实施方式中，其中，在计算总杂质含量时，杂质D按外标法计算，其它杂质按照主成分自身对照法计算。

本发明中，如果没有特别说明，术语“检测”为定性检测或定量检测。

本发明中，如果没有特别说明，术语“主成分”或“API”或“主药”是指普瑞巴林。

本发明中，如果没有特别说明，术语“有关物质”与术语“杂质”具有相同的含义，涉及的杂质编号及其对应的化合物如下面的表1所示。

表1：杂质化合物结构和名称

本发明中，如果没有特别说明，术语“羟苯酯类抑菌剂”是指羟苯甲酯和/或羟苯丙酯，优选为羟苯甲酯和羟苯丙酯。

本发明中，如果没有特别说明，术语“分离度”是指分离度是指前后化合物的分离情况，一般大于1.5才可认为分离情况良好，测定方法准确可用。

本发明中，如果没有特别说明，术语“保留时间”是指对应化合物的出峰时间。

本发明中，如果没有特别说明，术语“v％”是指体积百分比。

发明的有益效果

本发明取得了如下的技术效果中的任意一项或者几项：

(1)普瑞巴林口服溶液中的普瑞巴林与各辅料(羟苯甲酯、羟苯丙酯等)、有关物质以及各有关物质之间均能达到良好分离，分离度均大于2.0；

(2)专属性好，在经酸、碱、氧化、高温、光照降解后的样品图谱中，主峰的峰纯度因子均大于阈值，符合标准要求；

(3)灵敏度高，能够有效检测的杂质浓度均低于报告限度；

(4)普瑞巴林和主要降解杂质内酰胺(杂质D)在一定浓度范围内，呈现良好线性关系；

(5)准确度高。

附图说明

图1：普瑞巴林口服溶液有关物质检查空白溶液液相图谱。

图2：普瑞巴林口服溶液有关物质检查系统适用性溶液液相图谱。

图3：无降解处理普瑞巴林口服溶液供试品溶液液相图谱。

图4：0.1M HCl降解处理普瑞巴林口服溶液液相图谱。

图5：0.1M NaOH降解处理普瑞巴林口服溶液液相图谱。

图6：氧化降解处理普瑞巴林口服溶液液相图谱。

图7：强光降解处理普瑞巴林口服溶液液相图谱。

图8：高温降解处理普瑞巴林口服溶液液相图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：检测方法示例

1.实验样品

样品贮备溶液：取普瑞巴林、杂质A、B、D、E适量，精密称定，稀释剂(稀释剂为甲醇-水，体积比1:1)分别稀释成每1ml中约含普瑞巴林、各杂质100μg的溶液，摇匀，分别作为对照品贮备溶液。

系统适用性试验溶液：取上述杂质贮备液各1ml及普瑞巴林口服溶液2ml，置10ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

空白溶液：流动相A。

普瑞巴林(印度太阳药业有限公司，批号：PRVNF18053)，

杂质A(TLC，批号：1538-050A1，纯度99.6％)，杂质B(TLC，批号：2729-013A1，纯度99.0％)，杂质D(TLC，批号：1721-068A3，纯度100.0％)，杂质E(AOCS，批号：YMP-309-21，纯度95.63％)。

2.实验方法

仪器：waters高效液相色谱仪。

色谱柱：CPACELL PAK C18 MGII(250mm×4.6mm 5μm)。

流动相A:25mmol磷酸二氢钾溶液(氨水调节pH至6.70)；流动相B:甲醇；检测波长210nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：30℃。

洗脱程序：如下面的表2所示。

表2：洗脱程序

时间(min)	流动相A(v％)	流动相B(v％)
			0	70	30
5	70	30
			8	45	55
16	45	55
			19	35	65
24	35	65
			24.1	70	30
35	70	30

按照上述色谱条件进样空白溶液、系统适用性溶液，记录色谱图。

3.实验结果

如图1、图2以及表3所示。

表3：系统适用性结果

备注：杂质B为色谱图中首个色谱峰，故系统未进行计算，如图2所示，杂质B与其它色谱峰不存在分离度问题。

结果显示，普瑞巴林与各杂质及辅料峰(羟苯甲酯、羟苯丙酯等)的分离度符合系统适用性要求，且峰形较好，而空白溶液中也无干扰峰，理论塔板数较高，方法具有较高的系统适用性。

实施例2：专属性验证

对普瑞巴林口服溶液样品进行酸、碱、氧、光照破坏，考察普瑞巴林口服溶液的降解途径、验证本发明检测方法的专属性。其中，普瑞巴林口服溶液样品中的主要成分和含量以及制备方法如下：

普瑞巴林(20mg/mL)、羟苯甲酯(1.3mg/mL)、羟苯丙酯(0.163mg/mL)，以及适量的磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、三氯蔗糖和草莓香精。

制备方法：将纯化水加热至60℃以上，加入羟苯酯类抑菌剂并溶解，制得抑菌剂水溶液；冷却后加入普瑞巴林，以及适量的磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、三氯蔗糖和草莓香精等辅料，搅拌均匀，即得。

(1)强酸破坏：量取普瑞巴林口服溶液5ml(相当于普瑞巴林100mg)置25mL量瓶中，加1mol·L^-1盐酸溶液1ml，60℃放置8h；取出，加入1mol·L^-1氢氧化钠溶液1ml中和，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。空白溶剂、原料药溶液、辅料溶液的强酸破坏同法操作。

(2)强碱破坏：量取普瑞巴林口服溶液5ml(相当于普瑞巴林100mg)置25mL量瓶中，加1mol·L^-1氢氧化钠溶液1ml，60℃放置8h；取出，加入1mol·L^-1盐酸溶液1ml中和，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。空白溶剂、原料药溶液、辅料溶液的强碱破坏同法操作。

(3)氧化破坏：量取普瑞巴林口服溶液5ml(相当于普瑞巴林100mg)置25mL量瓶中，加3％双氧水溶液1ml，60℃放置8h；取出，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。空白溶剂、原料药溶液、辅料溶液的氧化破坏同法操作。

(4)光照破坏：精密量取普瑞巴林口服溶液5ml(相当于普瑞巴林100mg)置25ml量瓶中，在光照条件下(5000lx)放置30天，取出，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。空白溶剂、原料药溶液、辅料溶液的光照破坏同法操作。

精密量取上述溶液样品各20μL，按实施例1的色谱条件进样，记录色谱图。图谱见图3-图8。

表4：专属性实验结果

a注：物料守恒＝(降解样品总峰面积/降解样品浓度)/(未降解样品总峰面积/未降解样品浓度)；守恒范围为95％-105％。

b注：主峰与其前后杂质的分离度

c注：主峰的纯度角小于纯度阈值表示该色谱峰为单一色谱峰

根据表4和图3-图8，空白溶剂、辅料对普瑞巴林口服溶液有关物质检测无干扰；各强降解条件下产生的杂质主要为杂质D，在碱破坏条件下杂质D降解程度最大，与主峰相邻的杂质能够与主峰完全分离，且主峰峰纯度合格；通过计算破坏后的物料平衡，结果显示各个破坏条件下的物料均守恒，表明该色谱条件的专属性良好。

实施例3：定量限和检测限的检测

精密量前述对照品贮备液，并进行逐级稀释，按实施例1的色谱条件进样，以信噪比约为10时，普瑞巴林、杂质A、杂质B、杂质D(内酰胺)、杂质E的浓度作为定量限；以信噪比约为3时，普瑞巴林、杂质A、杂质B、杂质D(内酰胺)、杂质E的浓度作为检测限，结果见表5。

表5：定量限和检测限结果

注：相当于供试品的百分比为有关物质的检测浓度或定量限浓度比上供试品的浓度。

结果显示，普瑞巴林及各有关物质的定量限浓度均小于供试品浓度的0.2％，能够准确控制各有关物质的含量。

实施例4：线性试验

分别精密量取前述普瑞巴林对照品贮备液10ml、5ml、4ml、2ml、1ml、0.5ml置25ml量瓶中，分别加入内酰胺贮备液10ml、5ml、4ml、2ml、1ml、0.5ml，分别用流动相A稀释至刻度，摇匀，得系列线性浓度溶液。将各线性浓度溶液及定量限溶液，按实施例1的色谱条件进样，记录色谱图。

以普瑞巴林、内酰胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表6。

普瑞巴林、内酰胺线性测定结果

样品名称	回归方程	r	线性范围(μg/mL)
				普瑞巴林	y＝574.27x-68.641	0.9999	2.001-40.010
内酰胺	y＝12557x-1378.5	0.9999	0.200-40.080

结果显示，普瑞巴林和降解杂质内酰胺在一定浓度范围内，均呈现良好线性关系。

实施例5：准确度试验

取内酰胺对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成每1ml中约含杂质D 200μg的溶液，摇匀，作为内酰胺贮备液；精密量取普瑞巴林口服溶5mL置25mL容量瓶中，加内酰胺贮备液2.0、2.5、3mL各3份，用流动相A稀释至刻度，摇匀，分别进样，结果见表7。仪器与色谱条件同实施例1。

表7：内酰胺(杂质D)回收率实验结果

实施例6：精密度与重复性试验

分别精密量取前述普瑞巴林对照品贮备液2ml置25ml容量瓶中，加入前述内酰胺对照品贮备液2ml，流动相稀释至刻度，摇匀，按实施例1色谱条件连续进样6次。结果显示，普瑞巴林、内酰胺峰面积的RSD为1.08％，0.78％，保留时间的RSD为0.072％，0.054％，表明方法精密度好。

取同一样品平行配制6份供试品溶液，分别进样。结果检出内酰胺平均含量值为0.162％，RSD为0.55％，表明方法重复性好。

实施例7：稳定性试验

取普瑞巴林口服溶液样品(与实施例2相同)适量，用流动相A定量稀释每1ml含普瑞巴林4mg的溶液作为供试品溶液。

取前述内酰胺对照品溶液以及供试品溶液，室温下分别于0h、6h、12h、18h、24h按实施例1的色谱条件进样。结果内酰胺峰对照品峰面积RSD为0.27％，供试品中普瑞巴林及内酰胺的含量无明显变化，表明对照品及供试品溶液在24h内稳定性良好。

实施例8：耐用性试验

更换不同批号的色谱柱、不同型号的高效液相色谱仪(岛津LC-20AT、Waters ARC-2998PDA)，柱温变化±5℃、流动相pH变化±0.2等，按照实施例1的色谱条件下检测系统适用性溶液，结果各物质分离情况及峰面积无明显差别，说明方法耐用性好。

比较例：药典方法的考察与比较

1.实验样品

系统适用性溶液：见实施例1。

2.实验方法

按照《美国药典》(USP43-NF38[S].2019:3674)，《欧洲药典》(EP10.0[S].2017:3633)中有关物质的检测方法进行了实验考察。

3.实验结果实验结果见表8。

表8：药典方法检测结果

结果显示，《美国药典》存在溶剂峰干扰问题，《欧洲药典》存在分离度不合要求，辅料保留时间长效率低等问题，均不适合于普瑞巴林口服溶液有关物质检测。可见，美国药典和欧洲的药典检测方法均不适用于普瑞巴林口服溶液有关物质检测。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种检测普瑞巴林口服溶液中的有关物质的方法，其为HPLC方法，

其中，HPLC的条件如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温20℃-40℃；

流动相A为20-30mmol/L的磷酸二氢钾溶液，pH为6.2-7.0；

流动相B为甲醇；

流速0.5-1.5mL/min；

进样量10-30μL；

检测波长210nm；

(S)-4-异丁基-2-吡咯烷酮、(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸、3-异丁基戊二酸和3-[[[2-(羧甲基)-4-甲基戊基]氨甲酰氨基]甲基]-5-甲基己酸二钠盐；

优选地，所述有关物质包括(S)-4-异丁基-2-吡咯烷酮，以及选自(R)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸、3-异丁基戊二酸和3-[[[2-(羧甲基)-4-甲基戊基]氨甲酰氨基]甲基]-5-甲基己酸二钠盐中的任意1种、任意2种或任意3种。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述色谱柱为CPACELL PAK MGII，优选为CPACELL PAK C18 MGII；优选地，色谱柱的参数为4.6mm x 250mm,5.0μm；或者为4.6mm x250mm,10.0μm。

3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的检测方法，其中，柱温为25℃-35℃、26℃-34℃、28℃-32℃或30℃。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的检测方法，其中，流动相A为22-28mmol/L、24-26mmol/L或者25mmol/L的磷酸二氢钾溶液；

和/或

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的检测方法，其中，流速为0.8-1.2mL/min或1.0mL/min。

6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的检测方法，其中，进样量为18-25μL、18-22μL或20μL。

7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述普瑞巴林口服溶液中所述普瑞巴林口服溶液中含有有效量的普瑞巴林，以及一种或多种药学上可接受的辅料；

优选地，所述辅料包括羟苯酯类抑菌剂例如羟苯甲酯和/或羟苯丙酯；

更优选地，所述辅料还包括pH调节剂例如磷酸二氢钠和/或无水磷酸氢二钠；

进一步优选地，所述辅料还包括甜味剂例如三氯蔗糖，和/或香精例如草莓香精。

8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的检测方法，其中，所述普瑞巴林口服溶液包括：

优选地，所述普瑞巴林口服溶液包括如下组分：

更优选地，所述普瑞巴林口服溶液包括如下组分：

9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的检测方法，

其中，HPLC的条件如下：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温25℃-35℃；

流动相为25mmol/L的磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH为6.7；

流速0.8-1.2mL/min；

进样量18-22μL；

检测波长210nm；

优选地，HPLC的条件如下：

色谱柱为CPACELL PAK C18 MGII；

柱温28℃-32℃；

流动相为25mmol/L的磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH为6.7；

流速1.0mL/min；

进样量20μL；

检测波长210nm。

10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的检测方法，其中，洗脱程序如下：