CN111926095A - 一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物，包括上游外引物SEQ ID No.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游内引物SEQ ID No.3和下游内引物SEQ ID No.4，分别命名为BF、BB、BFP和BBP。本发明还公开一种利用暖贴和LAMP引物进行现场LAMP检测的方法，包括以下操作步骤：(1)提取待测样本的基因组作为扩增模板；(2)预热：扩增反应进行前，将暖贴的外包装打开后，将暖贴卷紧进行预热；(3)配制LAMP扩增试剂；(4)将配制好的试剂置于预热好的暖贴中进行LAMP扩增；(5)结果判定。本发明方法基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物和暖贴加热方法，实现对布鲁氏菌的无设备快速检测，便于现场布鲁氏菌病的诊断，更好地进行布鲁氏菌病的防控和净化。

Description

一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法
技术领域
本发明属于布鲁氏菌检测技术领域，具体涉及一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜兽共患传染病，广泛分布于世界各地，不仅影响畜牧业的健康发展，而且危害人类健康。布鲁氏菌感染动物机体后，可进入细胞内生存繁殖。在这个过程中，感知调节蛋白BvrR/BvrS双组分系统通过调节外膜蛋白的表达和碳氮代谢改变细菌毒力和外膜的通透性，对布鲁氏菌在细胞内生存和致病力方面具有重要的作用。现有的研究发现，BvrR/BvrS变异株中约一半的外膜蛋白表达下降，另一半则上调，同时多种胞质蛋白也上调，表明布鲁氏菌的毒力与调节细胞外膜和代谢的网络有关。BvrR变异株中碳代谢和反硝化的基因表达上调，而VjbR,ExoR和OmpR等转录调节子表达下调，表明其控制着菌体的碳氮代谢，可改变细菌的生理特性，有利于其从细胞外到细胞内寄生的转换。进一步的研究表明：BvrR/BvrS双组分调节系统还对布鲁氏菌细胞内寄生的另一重要因素—Ⅳ分泌系统VirB(T4SS VirB)具有调节作用，间接调节细菌的毒力和胞内生存能力。BvrR/BvrS双组分系统对布鲁氏菌是如此的重要，以至于在所有致病菌种中都存在。现已有多种检测布鲁氏菌的检测方法，但这些方法普遍存在着操作复杂、费时、费用高的问题，不便于快速检验以指导临床。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothennal amplification,LAMP)通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件下几十分钟就可扩增出109靶序列拷贝。该方法克服了PCR技术需要昂贵的仪器设备的缺点，产物可以不需任何仪器即时观察，极其适合在临床及基层进行现场检测(Point-Of-Care Testing，POCT)，因此其产生后已经被用来研究开发了多种检测产品。目前开发了诺如病毒的LAMP检测试剂盒和禽流感、SARS、西尼罗河病毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP检测产品试剂盒，目前没有一种基于布鲁氏菌BvrR序列采用LAMP手段检测布鲁氏菌的方法。另一方面，环介导等温扩增技术在实际使用过程中，其扩增过程需要恒温装置，此要求影响了其在无设备现场检测中的应用，因而成为其广泛应用的一大障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法，拓展了其在简陋的生产现场进行检测的能力，有利于布鲁氏菌病的快速检测和诊断。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物，包括上游外引物SEQ ID No.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游内引物SEQ ID No.3和下游内引物SEQ ID No.4，分别命名为BF、BB、BFP和BBP，
上游外引物BF序列为：5'-AAGGAAGCTTCGGCAACG-3'；
下游外引物BB序列为：5'-GAAGATGACCGGCAGATCG-3'；
上游内引物BFP序列为：
5'-GCGATAACCTTCCGACTCCAGCGCTGGTTGATGATGACCGC-3'
下游内引物BBP序列为：
5'-GGATGGGTTGATGGCGCGTCCAGAAGCTCCATACCGTCCA-3'。
本发明还提供一种LAMP引物的使用方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)采用DNA提取试剂盒提取待测固体样本的基因组作为扩增模板；或者将待测液体样本加入等量蒸馏水后煮沸10分钟吸取上清作为扩增模板；
(2)预热：扩增反应进行前，将暖贴的外包装打开后，将暖贴卷紧进行预热；
(3)试剂配制：在200μl PCR反应管中依次加入NEB WarmStart LAMP变色预混液8-12μL，上游外引物BF、下游外引物BB、上游内引物BFP、下游内引物BBP各1-2μL，扩增模板1-2μL，双蒸馏水4-6μL后制得的LAMP扩增试剂；
(4)扩增：预热完成后，打开卷紧的暖贴，将装有LAMP扩增试剂的PCR反应管放在暖贴中间重新卷紧，进行LAMP扩增；
(5)结果判定：扩增完成后，打开暖贴取出200μl PCR反应管，如果溶液的颜色变为黄色，为阳性，则待测样品中含有布鲁氏菌；如果溶液的颜色仍为红色，为阴性，则待测样品中不含有布鲁氏菌。
具体地，上述步骤(2)中，当环境温度低于10℃时，预热时间为75-85min，当环境温度大于等于10℃时，预热时间为15-25min。
具体地，上述步骤(3)中，NEB WarmStart LAMP变色预混液由Bst 2.0WarmStartDNA聚合酶、WarmStartRTx反转录酶和LAMP缓冲液。
具体地，所述LAMP缓冲液由1mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液50mL，KCl1.51g，MgSO41.95g，(NH4)2SO42.68g，吐温203mL和甜菜碱188.0g制成。
具体地，上述步骤(4)中，扩增反应的时间为50-70min。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明方法提供的基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物，能够利用环介导等温扩增技术，快速的检测待测样品中是否含有布鲁氏菌，检测效果准确。同时，本发明提供的利用LAMP引物检测布鲁氏菌的方法，操作步骤简单，检测流程短，并且采用的暖贴加热方式，与其它恒温扩增方法例如RPA(重组酶聚合酶扩增技术)相比，具有成本低廉、加热稳定、环保无污染的优点，解决了LAMP扩增时需要恒温仪器的使用限制，在极简陋地区也可以进行布鲁氏菌LAMP检测，便于布鲁氏菌病的预防和控制。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1
基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物，包括上游外引物SEQ ID No.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游内引物SEQ ID No.3和下游内引物SEQ ID No.4，分别命名为BF、BB、BFP和BBP，
上游外引物BF序列为：5'-AAGGAAGCTTCGGCAACG-3'；
下游外引物BB序列为：5'-GAAGATGACCGGCAGATCG-3'；
上游内引物BFP序列为：
5'-GCGATAACCTTCCGACTCCAGCGCTGGTTGATGATGACCGC-3'
下游内引物BBP序列为：
5'-GGATGGGTTGATGGCGCGTCCAGAAGCTCCATACCGTCCA-3'。
实施例2
本实施例详细介绍一种利用LAMP引物检测牛的血液中是否含有布鲁氏菌的方法，包括以下操作步骤：
(1)采集牛的血液，抗凝处理后，按照室温裂解试剂盒(RoomTempTM Sample LysisKit)的使用说明进行血液的室温裂解处理，得到牛的血液中的基因组；
(2)预热：扩增反应进行前，将暖贴的外包装打开后，将暖贴卷紧放置在室温进行预热20min；
(3)试剂配制：在200μLPCR反应管中依次加入NEB WarmStart LAMP变色预混液10μL，上游外引物BF、下游外引物BB、上游内引物BFP、下游内引物BBP各1μL，扩增模板1μL，双蒸馏水5μL后制得的LAMP扩增试剂，其中NEB WarmStart LAMP变色预混液由Bst2.0WarmStart DNA聚合酶、WarmStartRTx反转录酶和LAMP缓冲液，LAMP缓冲液由1mol/LpH8.8 Tris-HCl缓冲液50mL，KCl 1.51g，MgSO41.95g，(NH4)2SO42.68g，吐温203mL和甜菜碱188.0g制成；
(4)扩增：预热完成后，打开卷紧的暖贴，将装有LAMP扩增试剂的PCR反应管放在暖贴中间重新卷紧，进行LAMP扩增，扩增反应的时间为60min；
(5)结果判定：扩增完成后，打开暖贴取出200μLPCR反应管，如果溶液的颜色变为黄色，为阳性，则牛的血液中含有布鲁氏菌；如果溶液的颜色仍为红色，为阴性，则牛的血液中不含有布鲁氏菌。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种基于布鲁氏菌BvrR序列的LAMP引物，其特征在于，包括上游外引物SEQ IDNo.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游内引物SEQ ID No.3和下游内引物SEQ ID No.4，分别命名为BF、BB、BFP和BBP，
上游外引物BF序列为：5'-AAGGAAGCTTCGGCAACG-3'；
下游外引物BB序列为：5'-GAAGATGACCGGCAGATCG-3'；
上游内引物BFP序列为：
5'-GCGATAACCTTCCGACTCCAGCGCTGGTTGATGATGACCGC-3'
下游内引物BBP序列为：
5'-GGATGGGTTGATGGCGCGTCCAGAAGCTCCATACCGTCCA-3'。
2.一种如权利要求1所述的LAMP引物的使用方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)采用DNA提取试剂盒提取待测固体样本的基因组作为扩增模板；或者将待测液体样本加入等量蒸馏水后煮沸10分钟后吸取上清作为扩增模板；
(2)预热：扩增反应进行前，将暖贴的外包装打开后，将暖贴卷紧进行预热；
(3)试剂配制：在200μl PCR反应管中依次加入NEB WarmStart LAMP变色预混液8-12μL，上游外引物BF、下游外引物BB、上游内引物BFP、下游内引物BBP各1-2μL，扩增模板1-2μL，双蒸馏水4-6μL后制得的LAMP扩增试剂；
(4)扩增：预热完成后，打开卷紧的暖贴，将装有LAMP扩增试剂的PCR反应管放在暖贴中间重新卷紧，进行LAMP扩增；
(5)结果判定：扩增完成后，打开暖贴取出200μlPCR反应管，如果溶液的颜色变为黄色，为阳性，则待测样品中含有布鲁氏菌；如果溶液的颜色仍为红色，为阴性，则待测样品中不含有布鲁氏菌。
3.根据权利要求2所述一种LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步骤(2)中，当环境温度低于10℃时，预热时间为75-85min，当环境温度大于等于10℃时，预热时间为15-25min。
4.根据权利要求2所述一种LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步骤(3)中，NEBWarmStart LAMP变色预混液由Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、WarmStartRTx反转录酶和LAMP缓冲液。
5.根据权利要求4所述一种LAMP引物的使用方法，其特征在于，所述LAMP缓冲液由1mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液50mL，KCl 1.51g，MgSO41.95g，(NH4)2SO42.68g，吐温20 3mL和甜菜碱188.0g制成。
6.根据权利要求2所述一种LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步骤(4)中，扩增反应的时间为50-70min。
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