CN111849797A - 可降解头孢菌素c的芽孢杆菌、细胞级分、组合物及其制备方法 - Google Patents

可降解头孢菌素c的芽孢杆菌、细胞级分、组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，该芽孢杆菌以保藏编号CGMCC No.15258保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌菌株，可以利用头孢菌素C为唯一碳源生长，该菌株对含量为0.5g/L头孢菌素C的降解能力在72小时以内可达到100％。可将该菌株用于头孢菌素C工业生产中发酵菌渣的无害化处理和相关生产废水处理，处理方法高效，绿色环保，节约资源，处理成本低，彻底消除了头孢菌素C废菌丝对环境的不利影响。

Description

可降解头孢菌素C的芽孢杆菌、细胞级分、组合物及其制备 方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌、细胞级分、组合物及其制备方法。
背景技术
头孢菌素C，其钠盐二水物为单斜晶体。溶于水，不溶于乙醇、乙醚。当水溶液pH：2.5-8时稳定。对金葡菌、伤寒杆菌、大肠杆菌有活性。但由于抗菌活力低，临床未广泛应用。但通过改造可获得高效衍生物，目前主要作为制备头孢类抗生素的中间体7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的原料。
目前工业上头孢菌素C的生产主要是用玉米浆、淀粉、糊精、蛋氨酸、葡萄糖等为培养基，经顶头孢霉菌产生的次级代谢产物、萃取、纯化而成。该发酵液经预处理进行固液分离后形成的副产物菌丝部分即为生产废渣，该生产废渣中含有头孢菌素C残留以及粗蛋白、纤维素和粗脂肪等。由于废渣中残留头孢菌素C的理化性质稳定，具有长期的残留性、生物蓄积性，其进入生物链后容易引起生物耐药性等各种安全隐患。根据目前国际及国内法律法规规定，菌渣只能按照危险废物标准进行焚烧。这种破坏性地处理菌丝的方法，在造成粮食资源的浪费的同时，还会因焚烧产生大量的碳氧化物、氮氧化物以及硫氧化物，对大气环境造成相当程度的污染，同时会造成生产成本的提高。国内每年产生的头孢菌素C菌渣能达到10万吨以上，而废渣(菌丝体)中头孢菌素C残留含量仅约3.3g/kg。
而现有技术中没有对菌渣中残留的头孢菌素C进行无害化处理的方法，因此，如何利用绿色环保的手段对菌渣中残留头孢菌素C进行适当无害化处理并进行有效利用，成为相关产业发展的难题和瓶颈。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种可降解头孢菌素C 的芽孢杆菌，该芽孢杆菌以保藏编号CGMCC No.15258保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
其中，所述芽孢杆菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形、浅黄色、表面湿润、不透明、边缘不整齐；
菌体特征为：革兰氏阳性、菌体呈杆状、大小介于0.6μm-0.8μm× 2.0-4.4μm、单个或成对排列、芽孢柱形、中生、胞囊稍膨大。
其中，所述芽孢杆菌的亮氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶、麦芽三糖、 D-海藻糖发酵阳性；肌醇、糖原、磷酰胆碱、古老糖阴性；D-核糖、D- 葡萄糖、丙酮酸盐发酵阳性。
其中，所述芽孢杆菌能够以头孢菌素C为唯一碳源生长。
其中，所述的芽孢杆菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING 所示。
本发明另外提供了一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，由上述芽孢杆菌通过诱变或遗传转化得到。
其中，所述的芽孢杆菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING 所示。
本发明另外提供了一种可降解头孢菌素C的细胞级分，由上述任一项所述的芽孢杆菌获得。
本发明另外提供了一种可降解头孢菌素C的组合物，包括上述芽孢杆菌，以及上述细胞级分。
本发明另外提供了一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：将污泥接种到含有预订量头孢菌素C的无机盐培养基中，摇床震荡培养；
步骤S2：每七天以1∶10体积比的接种量转接到含较高浓度的头孢菌素C的富集培养基中，以得到不同浓度的含有芽孢杆菌菌体的富集培养液；
步骤S3：取预订量步骤S2中的富集培养液涂布到含有相应药浓度的选择平板上，培养预定时间后，得到一株生长速度最快且菌落周围出现透明圈的菌株，即为芽孢杆菌菌株。
本发明的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌菌株，其可以利用头孢菌素C 为唯一碳源生长，该菌株对0.5g/L头孢菌素C的降解能力在72小时以内可达到100％。该菌株可用于头孢菌素C工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法绿色环保、节约资源、处理成本低，彻底消除了头孢菌素C废菌丝对环境的不利影响。
附图说明
图1为本发明的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌的菌体形态图。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合附图详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种可有效降解抗生素头孢菌素C的芽孢杆菌D-2(Bacillus sp.)，该菌株编号为D-2，该菌株于 2018年01月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCC No.15258。
本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株，具有降解头孢菌素C的能力，能够对发酵工业产生的菌丝体中的头孢菌素C进行有效降解，以消除头孢菌素C废菌丝中抗生素残留，可用于头孢菌素C工业生产中发酵菌渣的无害化处理，为菌丝的无害化处理提供了有效的途径。
其中，芽孢杆菌菌株还可通过诱变或遗传转化筛选得到的降解头孢菌素C突变菌株，该突变菌株至少保留了降解头孢菌素C的特性，具体的诱变或遗传转化方法包括通过芽孢杆菌菌株的插入突变、整合突变等得到突变体。
其次，本发明还提供通过芽孢杆菌菌株或者诱变、遗传转化的得到的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌菌株的突变菌株得到的细胞级分。该细胞级分包括从上述菌株的培养物中得到的DNA制备物或者细菌壁制备物、从上述菌株的得到的培养液，这些培养液的上清液以及该上清液的级分。该细胞级分同样具有降解头孢菌素C的作用。
最后，本发明还提供一种可降解头孢菌素C的组合物，其包括芽孢杆菌菌株或可降解头孢菌素C的芽孢杆菌菌株的突变菌株以及它们的细胞分级的培养液。
下面通过具体实施例，进一步说明本发明实现的详细过程。
实施例1芽孢杆菌菌株的筛选
步骤一：从某抗生素企业周边采集污泥10g，接种到含有30mg头孢菌素C的100mL无机盐培养基中，于30℃、160rpm下摇床震荡培养。培养开始后每7天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量转接到较高浓度的含头孢菌素C的培养基中，头孢菌素C的含药浓度依次为10mg/L、 30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L依次类推，至600mg/L，得到不同浓度的含有菌体的富集培养液。
其中，本发明中的无机盐培养基包括如下配比(g/L)的组成成分： K2HPO4 1.6g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H2O 0.025g、FeCl3·6H2O 0.0023、NH4NO3 0.5g、琼脂20.0g，无机盐培养基以上述组成成分配制好后，用1mol/L HCL或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min制得。
本发明中的富集培养基包括如下配比(g/L)的组成成分：K2HPO4 1.6g、 KH2PO40.4g、MgSO4·7H2O 0.2g、CaCl2·2H2O 0.025g、FeCl3·6H2O 0.0023、 NH4NO3 0.5g、酵母浸膏0.5g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、琼脂20.0g，富集培养基以上述组成成分配制好后，用1mol/LHCL或NaOH调节pH值至7.0， 121℃高压灭菌30min。
步骤二：取0.1mL步骤一中含有细菌的富集培养液涂布到相应含药浓度的选择平板上，30℃培养48小时。得到一株生长速度最快且菌落周围出现明显透明圈的菌株，将该菌株接种到含有30mg/L头孢菌素C的无机盐培养基上，菌落周围可出现清晰的透明圈，将该菌株编号为D-2。
图1为本发明的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌的菌体形态图，如图所示，该编号为D-2菌株的主要生物学特性为：圆形、浅黄色、表面湿润、不透明、边缘不整齐。
该菌株的菌体特征为：革兰氏阳性、菌体呈杆状、大小约为 0.6μm-0.8μm×2.0-4.4μm、单个或成对排列、芽孢柱形、中生、胞囊稍膨大。
经过试验测定，该编号为D-2菌株的亮氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶、麦芽三糖、D-海藻糖发酵阳性；肌醇、糖原、磷酰胆碱、古老糖阴性；D-核糖、D-葡萄糖、丙酮酸盐发酵阳性。
步骤三：通过液相色谱法测定在无菌自来水中，该菌株对头孢菌素C 的降解能力。培养液中菌体的含量为每毫升培养液中108个，头孢菌素C 的浓度为30mg/L，于30℃、160rpm下摇床震荡培养72h，经测定，头孢菌素C的降解率为100％。同时，该菌株与发酵菌渣共培养一天，采用液相色谱法测定，该菌株对头孢菌素C的降解率可达到100％。实验证明，降解溶液体系为自来水、D-2；菌株在pH 7.0-8.0、温度30至40℃环境下生长良好，能以头孢菌素C为唯一碳源生长，是一株很有潜力的降解菌。
测定该菌株的16S rDNA的序列，将所测定的16S rDNA序列与 Genebank登录号为AB190217的16S rDNA的基因序列进行同源性分析。首先，采用DNA小量提取方法提取D-2菌株的总DNA。采用16S rRNA通用引物27F-1492R扩增其16S rRNA基因序列，将扩增得到的PCR产物直接进行测序(测序结果见序列表中SEQUENCE LISTING)，将获得的16S rRNA 基因序列输入GeneBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。本发明的菌株的D-2的16S rRNA基因序列与芽孢杆菌属的已有模式菌株具有较高的相似性。其中与Bacillus anthracis ATCC 14578T的序列相似性为99.93％。该菌株属于Bacillus sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Bacillus sp.，即芽孢杆菌菌株。
实施例2：本发明的芽孢杆菌菌株(Bacillus sp.)的筛选及对头孢菌素C的降解作用。
步骤一：取10g污泥盛于灭菌的250mL锥形瓶中，加入100mL浓度为0.3g/L的头孢菌素C溶液中，于30℃、160r/min转速下摇床培养。培养开始后，每7天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量接种到新鲜的头孢菌素C溶液驯化培养基中，并逐步提高头孢菌素C的含量。检测头孢菌素C的降解率，挑选出最好的一组以便分离菌株所用。
步骤二：将1mL中上述菌株的菌悬液(1×108个/mL)接入到100mL 含30mg/L头孢菌素C的自来水中，取三次平行，并以不接种细菌但含相同浓度的头孢菌素C的自来水为对照。30℃、160rpm下摇床培养，分别培养0、12、24、48、72小时，液相色谱法检测头孢菌素C的含量，实验结果见表一。培养72小时时，所选菌株可将头孢菌素C几乎完全降解。将得到的菌株编号为D-2。
步骤三：测定编号为D-2的菌株的16S rDNA的序列，将测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为AB190217的16S rDNA的基因序列进行同源性分析，认为D-2菌株属于Bacillus sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Bacillus sp，即芽孢杆菌。
表1：D-2菌株在自来水中对头孢菌素C的降解率
Figure BSA0000182430310000081
实施例3：芽孢杆菌菌株对菌渣中头孢菌素C的降解作用。
将头孢菌素C废湿菌丝过0.2mm筛子，称取10g过筛的废菌丝，并放入100mL水中，向废湿菌丝溶液中加入培养了48小时的芽孢杆菌菌体 6g(湿重)，设3组平行试验，以加菌丝但不加芽孢杆菌发酵培养液为对照，分别作用0、12、24、48、72小时取样，高效液相法检测头孢菌素C的残留量。结果表明，该菌株在培养72小时后，对头孢菌素C的降解率可达到100％。
表2：D-2菌株对菌渣中头孢菌素C的降解效果
Figure BSA0000182430310000082
Figure BSA0000182430310000091
由上可知，本发明的芽孢杆菌菌株是一株能够高效降解头孢菌素C 的菌株，其可以利用头孢菌素C为唯一碳源生长，该菌株对0.5g/L的头孢菌素C的降解能力在72小时以内可达到100％。本发明的芽孢杆菌菌株可用于头孢菌素C工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法绿色环保、节约资源能源、成本低，本发明的芽孢杆菌菌株消除了头孢菌素C废菌丝对环境的不利影响。同时，本发明的芽孢杆菌菌株与降解相关的基因及关键酶在生物修复和净化及工业和生物医药领域具有广泛的作用。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。
Figure RE-IDA0002088213600000011
Figure RE-IDA0002088213600000021

Claims (10)

1.一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：该芽孢杆菌以保藏编号CGMCCNo.15258保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形、浅黄色、表面湿润、不透明、边缘不整齐；
菌体特征为：革兰氏阳性、菌体呈杆状、大小介于0.6μm-0.8μm×2.0-4.4μm、单个或成对排列、芽孢柱形、中生、胞囊膨大。
3.如权利要求1所述的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌的亮氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶、麦芽三糖、D-海藻糖发酵阳性；肌醇、糖原、磷酰胆碱、古老糖阴性；D-核糖、D-葡萄糖、丙酮酸盐发酵阳性。
4.如权利要求1所述的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌能够以头孢菌素C为唯一碳源生长。
5.如权利要求1-4中任一项所述的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。
6.一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：其通过诱变或遗传转化权利要求1-5中任一项所述的芽孢杆菌得到。
7.如权利要求6所述的可降解头孢菌素C的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌16SrDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。
8.一种可降解头孢菌素C的细胞级分，其特征在于：通过权利要求1-7中任一项所述的芽孢杆菌获得。
9.一种可降解头孢菌素C的组合物，其特征在于：包括权利要求1-7中任一项所述的芽孢杆菌，以及权利要求8所述的细胞级分。
10.一种可降解头孢菌素C的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1：将污泥接种到含有预订量头孢菌素C的无机盐培养基中，摇床震荡培养；
步骤S2：每七天以1∶10体积比的接种量转接到含较高浓度的头孢菌素C的富集培养基中，以得到不同浓度的含有芽孢杆菌菌体的富集培养液；
步骤S3：取预订量步骤S2中的富集培养液涂布到含有相应药浓度的选择平板上，培养预定时间后，得到一株生长速度最快且菌落周围出现透明圈的菌株，即为芽孢杆菌菌株。
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