CN111821287A - 化合物及其组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于植物萃取物领域，特别是关于一种化合物及其组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途。其中该化合物是选自由反式‑对香豆醇、反式‑对乙酰氧基肉桂醇、及胡椒酚‑β‑D‑葡萄糖苷所组成的群组。本发明亦提供一种组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中该组合物包含任一前述化合物或其组合，及一药学上可接受的载体。前述化合物能提升神经细胞线粒体活性，并且抑制活性氧物质生成，因此具有保护神经细胞及预防神经性退化疾病的潜力。

Description

化合物及其组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物 的用途
技术领域
本发明是关于植物萃取物领域，特别是关于一种化合物及其组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途。
背景技术
随着全球人口老化，神经退化性疾病患者的数量持续增加，导致越来越多年长者的认知、记忆、及运动能力受损。据报导，世界卫生组织预测影响运动功能的神经退化性疾病将成为未来二十年内流行病死因的第二名。因此，开发对此类疾病的治疗方法成为近代生物医学重点研究项目之一。由于多数神经退化性疾病的致病机制尚未明确，目前缺少有效治疗这类疾病的方法，可用的治疗仅限于症状管理及阻止疾病进展。
线粒体(mitochondria)是多数真核细胞中进行氧化反应以产生能量的胞器(organelles)，其正常运作对维持细胞的活力至为重要。研究指出具有正常功能的线粒体是神经细胞(neuron)完成代谢、神经纤维延伸、神经传导物质的合成与转运所必需，因此，神经细胞对线粒体功能障碍特别敏感。目前已有学者发现在阿兹海默症(Alzheimer’sdisease，AD)病理样本或动物模型中存在线粒体形态异常与功能障碍，显示失能线粒体可能是造成阿兹海默症的原因之一。此外，相关研究人员认为其他神经退化性疾病，包括帕金森氏症(Parkinson’s disease，PD)、亨丁顿氏症(Huntington’s disease，HD)、肌萎缩脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等，也可能与线粒体功能障碍相关。因此，提升线粒体功能被视为是保护神经远离退化疾病的一种可行策略。
有鉴于此，开发一种能有效提升线粒体功能或活性而且便于大众使用的神经保护组合物，以预防前述多种神经性退化疾病的发生，实有其必要。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种化合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中该化合物是选自由反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所组成的群组。
在本发明的一实施例中，该提升神经细胞线粒体活性的药物含有浓度为至少10μg/mL的前述化合物。
本发明的另一目的在提供一种组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中该组合物包含一药学上可接受的载体，及一选自由反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、胡椒酚-β-D-葡萄糖苷、及其任意组合所组成群组的化合物。
在本发明的一实施例中，前述化合物是以水对一高良月桃(Alpinia galanga)根茎部(rhizome)进行萃取而得。在一较佳实施例中，该水与该高良月桃根茎部的重量比范围为10：1至5：1。
在本发明的另一实施例中，前述化合物是先以水而后以乙酸乙酯对一高良月桃根茎部进行萃取而得。
本发明揭露反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、或胡椒酚-β-D-葡萄糖苷的施用能显著提升神经细胞线粒体活性，并且抑制活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)生成，因此具有保护神经细胞及预防神经性退化疾病的潜力。据此，该些化合物或包含该些化合物的组合物可用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物。该药物可具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型，并且可藉由口服方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1显示对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以一高良月桃根茎部水萃取物或其水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、或正丁醇层萃取物后，该细胞中JC-1聚集体的相对量(％)；
图2显示对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以一高良月桃根茎部水萃取物或其水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、或正丁醇层萃取物，再予以过氧化氢刺激后，该细胞内活性氧物质相对含量；
图3显示对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以化合物1、2、3或4后，该细胞中JC-1聚集体的相对量(％)；
图4显示对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以化合物1、2、3或4，再予以过氧化氢刺激后，该细胞内活性氧物质相对含量。
具体实施方式
本发明提供一种化合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中该化合物是选自由反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所组成的群组。本发明亦提供一种包含前述任一化合物或其任意组合的组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途。以下实施例显示对神经细胞施予任一前述化合物或包含该些化合物的组合物，可以提升线粒体活性及抑制活性氧物质生成。
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
本文中所谓「线粒体活性」是指线粒体运作的效力，包括能量产生与物质代谢的效率。线粒体活性的评估可依据本发明所属技术领域所习知的生化、分子生物及细胞学技术而完成，例如本文所述线粒体膜电位的测定。该「线粒体活性」与「线粒体功能」的用语为可互换。
本文中所谓「药学上可接受的载体」是指药学上可接受的溶剂，或固体或溶液形式的赋形剂或稳定剂。该药学上可接受的载体在所用剂量及浓度下对接受者无毒，并且可包含缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸；胺基酸，例如甘胺酸；多肽，例如明胶；单醣、双醣、多醣、及其他碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、及海藻糖。
材料与方法
材料
自Thermo Fisher Scientific公司购买DMEM培养基(Gibco Dulbecco'smodified Eagle’s medium)、胎牛血清(Gibco fetal bovine serum，FBS)、抗生素(GibcoAntibiotic-Antimycotic)、碳酸氢钠、及磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)。自Sigma购买二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate，DCFH-DA；商品编号SI-D6883)，使用前将其溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)以配制为5mg/mL DCFH-DA溶液。
溶剂是购自中国台湾默克公司，包含正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethylacetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d1(氘化程度99.5％)、甲醇-d6(氘化程度99.5％)、重水(deuterium oxide，氘化程度>99.8％)、及二甲基亚砜-d6(dimethyl sulfoxide-d6，氘化程度>99.9％)。
化学分析仪器
化合物分离是利用管柱层析法(column chromatography)及薄层层析法(thinlayer chromatography，TLC)。中压液相层析(medium pressure liquid chromatography，MPLC)系统为
Figure BDA0002360725620000041
Rf+(Teledyne ISCO)；管柱是选用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)、及Merck
Figure BDA0002360725620000042
RP-18(40-63μm，Art.0250)。高效液相层析(high performance liquid chromatography，HPLC)系统装配Hitachi L-2310系列帮浦、Hitachi L-2420UV-VIS侦测器(侦测波长为200nm至380nm)、及D-2000Elite资料处理软件；管柱是选用自分析级
Figure BDA0002360725620000043
HS C18(250×4.6mm，5μm；SUPELCO)与Mightysil RP-18GP 250(250×4.6mm，5μm；Kanto Chemical)，以及半制备级
Figure BDA0002360725620000044
HS C18(250×10.0mm，5μm；SUPELCO)与制备级
Figure BDA0002360725620000045
HS C18(250×21.0mm，5μm；SUPELCO)。层析系统配备紫外灯UVP UVGL-25(波长为254nm及365nm)。薄层层析片是涂覆硅胶60F254(0.25mm；Merck)或RP-18F254S(0.25mm；Merck)的铝片。
化合物的化学结构是以质谱法(mass spectrometry，MS)及核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR)确定。具体而言，使用二维离子阱串联傅里叶变换质谱(Bruker amaZon SL system)及电喷洒离子化串联质谱(ESI-MS/MS；Thermo Scientific Orbitrap Elite system)；并使用400MHz Varian 400FT-NMR取得一维与二维NMR光谱，以四甲基硅烷(tetramethylsilane，TMS)作为内部标准品。
细胞培养
以下实施例使用购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)的小鼠脑神经瘤细胞株N2a(ATCC CCL-131)。N2a细胞在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于DMEM培养基，该培养基并添加10％FBS、3.7g/L碳酸氢钠、及1％抗生素，以下称细胞培养基。
线粒体活性分析
为评估细胞的线粒体活性，利用流式细胞仪(flow cytometer；Beckman CoulterLife Sciences)及线粒体膜电位检测套组(BDTM MitoScreen)测定线粒体膜电位的变化。简言之，N2a细胞依1×105个细胞/孔接种于6孔盘，各孔含有2mL细胞培养基。在37℃培养细胞24小时后，移除该培养基，并以添加待测样品的1mL细胞培养基处理细胞(实验组)，或者仅用细胞培养基处理细胞(控制组)。各组细胞于37℃培养24小时后依下列步骤进行线粒体活性分析。依据厂商使用说明，以PBS溶液润洗待测细胞，再将细胞收集至1.5mL微量离心管及进行离心(400xg，5分钟)。经移除上清液，以PBS溶液再悬浮细胞并且再次离心(400xg，5分钟)。将100μL JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazo-lylcarbocyanine iodide)操作溶液与沉淀的细胞在暗处均匀混合15分钟以进行荧光标记，再以清洗缓冲液及离心步骤(400xg，5分钟)清洗细胞2次。最终，将细胞再悬浮于含2％FBS的PBS溶液，使用流式细胞仪侦测指示线粒体膜电位的JC-1聚集体的相对量(激发波长为约490nm，侦测波长为约595nm)。JC-1聚集体的量越多表示线粒体内膜的电位差越大，被视为线粒体活性越高。
活性氧物质生成试验
利用荧光探针DCFH-DA配合流式细胞仪(Beckman)测定N2a细胞经指定处理后的活性氧物质含量。简言之，N2a细胞依2×105个细胞/孔接种于6孔培养盘，各孔含有2mL细胞培养基。在37℃培养细胞24小时后，移除该培养基，并以添加待测样品的1mL细胞培养基处理细胞(实验组)，或者仅用细胞培养基处理细胞(控制组)。其后，各孔细胞以5μg/mL DCFH-DA处理15分钟，再以1mM过氧化氢(溶于PBS溶液)在37℃处理1小时，接着以1mL PBS溶液清洗2次。经清洗细胞与200μL胰蛋白酶在暗处反应5分钟后被收集至置于暗处的1.5mL试管，并于400xg离心10分钟以移除上清液。余下沉淀物经PBS溶液清洗一次，再以400xg离心10分钟并移除上清液。最终，以1mL PBS溶液再悬浮细胞，并使用流式细胞仪侦测细胞的荧光强度。进行荧光侦测的激发波长为450至490nm，侦测波长为510至550nm。由于DCFH-DA进入细胞后会先被水解为DCFH(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色荧光的DCF(二氯荧光素)，经DCFH-DA处理的细胞的荧光强度可反映细胞内活性氧物质含量。
统计分析
实验数据在统计上的显著差异是利用Excel软件的学生t检定进行判定。
实施例1
自高良月桃根茎部纯化提升神经细胞线粒体活性的化合物
为取得提升神经细胞线粒体活性的化合物，首先制备一高良月桃(又名大高良姜)根茎部水萃取物。简言之，将高良月桃的根茎部洗净、晾干、切块，再以粉碎机将其碎裂为约1至2公分。其后，以水为溶剂对高良月桃根茎部粉碎物进行萃取即可获得该高良月桃根茎部水萃取物。该溶剂与该粉碎物的重量比范围为10：1至5：1。萃取温度为介于70℃至100℃，较佳为80℃至90℃。本实施例中萃取时间为1至2小时。
为移除残余固体物，经上述萃取步骤所得的高良月桃根茎部水萃取物冷却至室温后，可进一步以2500至3500rpm的转速在15℃至25℃下离心5至10分钟而获得一上清液。该上清液可进一步在45℃至70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。
其后，自该高良月桃根茎部水萃取物中进一步分离出富含神经保护活性成分的二次萃取物，其步骤简述如下。首先，藉由乙酸乙酯与水等比例液相分配的方式萃取高良月桃根茎部水萃取物(5L)三次。将所得乙酸乙酯层萃取液合并，再经减压浓缩干燥可获得一乙酸乙酯层萃取物约2.1g。余下水层萃取液以正丁醇与水等比例液相分配方式萃取三次。所得正丁醇层萃取液及水层萃取液分别合并，再经减压浓缩干燥可得到一正丁醇层萃取物约10g及一水层萃取物约98g。
为评估神经保护作用，对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以含10μg/mL前述高良月桃根茎部水萃取物、水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、或正丁醇层萃取物的细胞培养基，或者仅用细胞培养基处理细胞(控制组)。各组细胞于37℃培养24小时后用于线粒体活性分析，以前述线粒体膜电位检测套组中的荧光染剂JC-1指示线粒体膜电位。图1显示前述各组Na2细胞中JC-1聚集体的相对量(％)，其值越高表示细胞的平均线粒体活性越高；图中*及**分别表示相比控制组为p<0.05及p<0.01。依据图1，相比控制组，施予高良月桃根茎部水萃取物显著提升N2a细胞的线粒体活性约38％，并且在三种二次萃取物中仅有乙酸乙酯层萃取物显著提升线粒体活性约188％。此结果说明高良月桃根茎部水萃取物的乙酸乙酯层萃取物含有可提升线粒体活性的神经保护活性成分。
鉴于线粒体活性提升可能伴随细胞内活性氧物质生成增加，进一步测试对小鼠脑神经瘤细胞株N2a施以含62.5μg/mL前述高良月桃根茎部水萃取物、水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、或正丁醇层萃取物的细胞培养基后，该细胞在1mM过氧化氢刺激下的活性氧物质相对含量(相对于控制组细胞的活性氧物质含量)。依据图2，相比仅用细胞培养基处理的控制组细胞，过氧化氢的处理会诱导N2a细胞产生活性氧物质，但同时施予高良月桃根茎部水萃取物却明显减少N2a细胞中约35.3％的活性氧物质累积，特别是仅有乙酸乙酯层萃取物显著抑制约80.5％的活性氧物质生成。此结果说明高良月桃根茎部水萃取物的乙酸乙酯层萃取物在提升线粒体活性的同时能抑制神经细胞氧化压力增加。
基于线粒体活性分析及活性氧物质生成试验的结果，进一步自前述乙酸乙酯层萃取物中分离出提升神经细胞线粒体活性的潜在化合物。依据生物活性导引分离方法(bioassay guided fractionation)，使用硅胶管柱及正己烷与乙酸乙酯依体积比100：1混合的冲提液，对乙酸乙酯层萃取物进行管柱层析，可得到18个划分层(分别标记为F1至F18)。其后，对F3划分层进行管柱层析，所得流出液再经薄层层析片分离，可得到5个划分层(分别标记为F3-1至F3-5)。F3-2划分层再以甲醇与水依体积比2：8的混合液作为移动相进行高效液相层析(HPLC)，可分离得化合物1(约25.3mg)。
F2划分层进一步以逆相层析管柱RP-18分离得6个划分层(分别标记为F2-1至F2-6)。F2-4划分层再以甲醇与水依体积比2：8的混合液作为移动相进行高效液相层析，可分离得化合物2(约3.0mg)及化合物4(约2.5mg)。
此外，使用Sephadex LH-20管柱及甲醇冲提液，对F7划分层进行管柱层析，可得到5个划分层(分别标记为F7-1至F7-5)。F7-3划分层再以甲醇与水依体积比3：7的混合液作为移动相进行高效液相层析，可分离得到化合物3(约5.3mg)。
藉由质谱仪与核磁共振光谱仪分析确定化合物1、2、3、及4的化学结构，其名称及结构式如下表1所示。
表1
Figure BDA0002360725620000081
实施例2
化合物1-3提升神经细胞线粒体活性
本实施例利用线粒体活性分析检验化合物1、2、3或4(浓度为10μg/mL)提升神经细胞线粒体活性的效果，其结果如图3所示；图中*及**分别表示相比控制组为p<0.05及p<0.01。依据图3，相比仅以细胞培养基处理的控制组N2a细胞，化合物1、2、及3的处理皆显著提升N2a细胞中线粒体活性。具体而言，化合物1、2、或3分别提升线粒体活性约100％、29.9％、及39.9％。然而，未观察到化合物4有此提升效果。
实施例3
化合物1-3抑制神经细胞中的活性氧物质生成
本实施例利用活性氧物质生成试验检验化合物1、2、3、或4(浓度为10μg/mL)对过氧化氢刺激下神经细胞中活性氧物质生成的抑制效果，其结果如图4所示；图中*及**分别表示相比单独施以过氧化氢为p<0.05及p<0.01。依据图4，相比经1mM过氧化氢处理的N2a细胞，同时施予化合物1、2、或3显著减少N2a细胞的活性氧物质累积。具体而言，化合物1、2、3、及4分别使活性氧物质相对含量下降约60.5％、77.8％、34.2％、及28.5％。
综上所述，本发明揭露反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷的施用能显著提升神经细胞线粒体活性，并且抑制活性氧物质生成，因此具有保护神经细胞及预防神经性退化疾病的潜力。据此，该些化合物或包含该些化合物的组合物可用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物。该药物可具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型，并且可藉由口服方式给予一个体。

Claims (10)

1.一种化合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中所述化合物是选自由反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所组成的群组。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物的浓度为至少10μg/mL。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是以口服方式给予。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型。
5.一种组合物用于制备提升神经细胞线粒体活性的药物的用途，其中所述组合物包含一药学上可接受的载体，及一选自由反式-对香豆醇、反式-对乙酰氧基肉桂醇、胡椒酚-β-D-葡萄糖苷、及其任意组合所组成群组的化合物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物是以水对一高良月桃根茎部进行萃取而得。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述水与所述高良月桃根茎部的重量比范围为10：1至5：1。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物是先以水而后以乙酸乙酯对一高良月桃根茎部进行萃取而得。
9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物是以口服方式给予。
10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型。
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