TWI699215B - 用於神經保護之生物活性物質及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種生物活性物質用於製備提升神經細胞粒線體活性之藥物之用途，其中該生物活性物質包含一選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所組成之群組之化合物。本發明亦提供一種高良月桃萃取物用於製備提升神經細胞粒線體活性之組合物之用途。前述生物活性物質能提升神經細胞粒線體活性，並且抑制活性氧物質生成，因此具有保護神經細胞及預防神經性退化疾病的潛力。

Description

用於神經保護之生物活性物質及其應用
本發明係關於一種生物活性物質之保健用途，特別係關於一種生物活性物質及包含該生物活性物質之萃取物用於製備提升神經細胞粒線體活性之組合物之用途。
隨著全球人口老化，神經退化性疾病患者的數量持續增加，導致越來越多年長者的認知、記憶、及運動能力受損。據報導，世界衛生組織預測影響運動功能的神經退化性疾病將成為未來二十年內流行病死因的第二名。因此，開發對此類疾病的治療方法成為近代生物醫學重點研究項目之一。由於多數神經退化性疾病的致病機制尚未明確，目前缺少有效治療這類疾病的方法，可用的治療僅限於症狀管理及阻止疾病進展。
粒線體(mitochondria)是多數真核細胞中進行氧化反應以產生能量的胞器(organelles)，其正常運作對維持細胞的活力至為重要。研究指出具有正常功能的粒線體是神經細胞(neuron)完成代謝、神經纖維延伸、神經傳導物質的合成與轉運所必需，因此，神經細胞對粒線體功能障礙特別敏感。目前已有學者發現在阿茲海默症(Alzheimer’s disease，AD)病理樣本或動物模型中存在粒線體形態異常與功能障礙，顯示失能粒線體可能是造成阿茲海默症的原因之一。此外，相關研究人員認為其他神經退化性疾病，包括帕金森氏症(Parkinson’s disease，PD)、亨丁頓氏症(Huntington’s disease，HD)、肌萎縮脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等，也可能與粒線體功能障礙相關。因此，提升粒線體功能被視為是保護神經遠離退化疾病的一種可行策略。
有鑑於此，開發一種能有效提升粒線體功能或活性而且便於大眾使用的神經保護組合物，以預防前述多種神經性退化疾病的發生，實有其必要。
緣此，本發明之一目的在提供一種生物活性物質用於製備提升神經細胞粒線體活性之藥物之用途，其中該生物活性物質包含一選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所組成之群組之化合物。
在本發明之一實施例中，該提升神經細胞粒線體活性之藥物含有濃度為至少10μg/mL之前述化合物。
本發明之另一目的在提供一種高良月桃萃取物用於製備提升神經細胞粒線體活性之組合物之用途，其中該組合物包含一選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、胡椒酚-β-D-葡萄糖苷、及其任意組合所組成群組之化合物。
在本發明之一實施例中，前述化合物係以水對一高良月桃(Alpinia galanga)根莖部(rhizome)進行萃取而得。在一較佳實施例中，該水與該高良月桃根莖部之重量比範圍為10：1至5：1。
在本發明之另一實施例中，前述化合物係先以水而後以乙酸乙酯對一高良月桃根莖部進行萃取而得。
本發明揭露反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、或胡椒酚-β-D-葡萄糖苷之施用能顯著提升神經細胞粒線體活性，並且抑制活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)生成，因此具有保護神經細胞及預防神經性退化疾病的潛力。據此，該些化合物或包含該些化合物之組合物可用於製備提升神經細胞粒線體活性之藥物。該藥物可具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型，並且可藉由口服方式給予一個體。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1顯示對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以一高良月桃根莖部水萃取物或其水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、或正丁醇層萃取物後，該細胞中JC-1聚集體的相對量(%)。
圖2顯示對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以一高良月桃根莖部水萃取物或其水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、或正丁醇層萃取物，再予以過氧化氫刺激後，該細胞內活性氧物質相對含量。
圖3顯示對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以化合物1、2、3或4後，該細胞中JC-1聚集體的相對量(%)。
圖4顯示對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以化合物1、2、3或4，再予以過氧化氫刺激後，該細胞內活性氧物質相對含量。
本發明提供一種生物活性物質用於製備提升神經細胞粒線體活性之藥物之用途，其中該生物活性物質包含一選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所組成之群組之化合物。本發明亦提供一種包含前述任一化合物或其任意組合之高良月桃萃取物用於製備提升神經細胞粒線體活性之組合物之用途。以下實施例顯示對神經細胞施予任一前述化合物或包含該些化合物之組合物，可以提升粒線體活性及抑制活性氧物質生成。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文中所謂「粒線體活性」係指粒線體運作的效力，包括能量產生與物質代謝的效率。粒線體活性之評估可依據本發明所屬技術領域所習知之生化、分子生物及細胞學技術而完成，例如本文所述粒線體膜電位之測定。該「粒線體活性」與「粒線體功能」之用語為可互換。
本文中所謂「藥學上可接受的載體」係指藥學上可接受的溶劑，或固體或溶液形式的賦形劑或穩定劑。該藥學上可接受的載體在所用劑量及濃度下對接受者無毒，並且可包含緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸；胺基酸，例如甘胺酸；多肽，例如明膠；單醣、雙醣、多醣、及其他碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、及海藻糖。
本文中所謂「生物活性物質」(biologically active substance)係指能與生物體或細胞作用，並對其產生影響之物質。而本文中能「用於製備保護神經或提升神經細胞能量產生與物質代謝之組合物」的化合物即為一生物活性物質：其能與小鼠腦神經瘤細胞株作用，使其粒線體能量產生與物質代謝增加，並減低細胞之氧化壓力。因此，本發明之用於用於製備保護神經或提升神經細胞能量產生與物質代謝之組合物的「化合物」亦可以「生物活性物質」表示。
材料與方法 材料
自Thermo Fisher Scientific公司購買DMEM培養基(Gibco Dulbecco's modified Eagle’s medium)、胎牛血清(Gibco fetal bovine serum，FBS)、抗生素(Gibco Antibiotic-Antimycotic)、碳酸氫鈉、及磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)。自Sigma購買二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；商品編號SI-D6883)，使用前將其溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)以配製為5mg/mL DCFH-DA溶液。
溶劑係購自台灣默克公司，包含正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d 1 (氘化程度99.5%)、甲醇-d 6 (氘化程度99.5%)、重水(deuterium oxide，氘化程度>99.8%)、及二甲基亞碸-d 6 (dimethyl sulfoxide-d 6 ，氘化程度>99.9%)。
化學分析儀器
化合物分離係利用管柱層析法(column chromatography)及薄層層析法(thin layer chromatography，TLC)。中壓液相層析(medium pressure liquid chromatography，MPLC)系統係為CombiFlash ® Rf+(Teledyne ISCO)；管柱係選用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)、及Merck LiChroprep® RP-18(40-63μm，Art.0250)。高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)系統裝配Hitachi L-2310系列幫浦、Hitachi L-2420 UV-VIS偵測器(偵測波長為200nm至380nm)、及D-2000 Elite資料處理軟體；管柱係選用自分析級Discovery® HS C18(250×4.6mm，5μm；SUPELCO)與Mightysil RP-18 GP 250 (250×4.6mm，5μm；Kanto Chemical)，以及半製備級Discovery® HS C18(250×10.0mm，5μm；SUPELCO)與製備級Discovery® HS C18(250×21.0mm，5μm；SUPELCO)。層析系統配備紫外燈UVP UVGL-25(波長為254nm及365nm)。薄層層析片係塗覆矽膠60 F254(0.25mm；Merck)或RP-18 F254S(0.25mm；Merck)之鋁片。
化合物的化學結構係以質譜法(mass spectrometry，MS)及核磁共振光譜法(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR)確定。具體而言，使用二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜(Bruker amaZon SL system)及電噴灑離子化串聯質譜(ESI-MS/MS；Thermo Scientific Orbitrap Elite system)；並使用400MHz Varian 400 FT-NMR取得一維與二維NMR光譜，以四甲基矽烷(tetramethylsilane，TMS)作為內部標準品。
細胞培養
以下實施例使用購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之小鼠腦神經瘤細胞株N2a(ATCC CCL-131)。N2a細胞在37℃、5%二氧化碳的條件下培養於DMEM培養基，該培養基並添加10% FBS、3.7g/L碳酸氫鈉、及1%抗生素，以下稱細胞培養基。
粒線體活性分析
為評估細胞的粒線體活性，利用流式細胞儀(flow cytometer；Beckman Coulter Life Sciences)及粒線體膜電位檢測套組(BDTM MitoScreen)測定粒線體膜電位之變化。簡言之，N2a細胞依1×105個細胞/孔接種於6孔盤，各孔含有2mL細胞培養基。在37℃培養細胞24小時後，移除該培養基，並以添加待測樣品之1mL細胞培養基處理細胞(實驗組)，或者僅用細胞培養基處理細胞(控制組)。各組細胞於37℃培養24小時後依下列步驟進行粒線體活性分析。依據廠商使用說明，以PBS溶液潤洗待測細胞，再將細胞收集至1.5mL微量離心管及進行離心(400 xg，5分鐘)。經移除上清液，以PBS溶液再懸浮細胞並且再次離心(400 xg，5分鐘)。將100μL JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazo-lylcarbocyanine iodide)操作溶液與沉澱之細胞在暗處均勻混合15分鐘以進行螢光標記，再以清洗緩衝液及離心步驟(400 xg，5分鐘)清洗細胞2次。最終，將細胞再懸浮於含2% FBS之PBS溶液，使用流式細胞儀偵測指示粒線體膜電位的 JC-1聚集體的相對量(激發波長為約490nm，偵測波長為約595nm)。JC-1聚集體的量越多表示粒線體內膜的電位差越大，被視為粒線體活性越高。
活性氧物質生成試驗
利用螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀(Beckman)測定N2a細胞經指定處理後之活性氧物質含量。簡言之，N2a細胞依2×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，各孔含有2mL細胞培養基。在37℃培養細胞24小時後，移除該培養基，並以添加待測樣品之1mL細胞培養基處理細胞(實驗組)，或者僅用細胞培養基處理細胞(控制組)。其後，各孔細胞以5μg/mL DCFH-DA處理15分鐘，再以1mM過氧化氫(溶於PBS溶液)在37℃處理1小時，接著以1mL PBS溶液清洗2次。經清洗細胞與200μL胰蛋白酶在暗處反應5分鐘後被收集至置於暗處之1.5mL試管，並於400 xg離心10分鐘以移除上清液。餘下沉澱物經PBS溶液清洗一次，再以400 xg離心10分鐘並移除上清液。最終，以1mL PBS溶液再懸浮細胞，並使用流式細胞儀偵測細胞的螢光強度。進行螢光偵測之激發波長為450至490nm，偵測波長為510至550nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH(二氯二氫螢光素)，再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF(二氯螢光素)，經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量。
統計分析
實驗數據在統計上的顯著差異係利用Excel軟體之學生t檢定進行判定。
實施例1 自高良月桃根莖部純化提升神經細胞粒線體活性之化合物
為取得提升神經細胞粒線體活性之化合物(生物活性物質)，首先製備一高良月桃(又名大高良薑)根莖部水萃取物。簡言之，將高良月桃的根莖部洗淨、晾乾、切塊，再以粉碎機將其碎裂為約1至2公分。其後，以水為溶劑對高良月桃根莖部粉碎物進行萃取即可獲得該高良月桃根莖部水萃取物。該溶劑與該粉碎物之重量比範圍為10：1至5：1。萃取溫度為介於70℃至100℃，較佳為80℃至90℃。本實施例中萃取時間為1至2小時。
為移除殘餘固體物，經上述萃取步驟所得之高良月桃根莖部水萃取物冷卻至室溫後，可進一步以2500至3500rpm之轉速在15℃至25℃下離心5至 10分鐘而獲得一上清液。該上清液可進一步在45℃至70℃進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物。
其後，自該高良月桃根莖部水萃取物中進一步分離出富含神經保護活性成分之二次萃取物，其步驟簡述如下。首先，藉由乙酸乙酯與水等比例液相分配的方式萃取高良月桃根莖部水萃取物(5L)三次。將所得乙酸乙酯層萃取液合併，再經減壓濃縮乾燥可獲得一乙酸乙酯層萃取物約2.1g。餘下水層萃取液以正丁醇與水等比例液相分配方式萃取三次。所得正丁醇層萃取液及水層萃取液分別合併，再經減壓濃縮乾燥可得到一正丁醇層萃取物約10g及一水層萃取物約98g。
為評估神經保護作用，對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以含10μg/mL前述高良月桃根莖部水萃取物、水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、或正丁醇層萃取物之細胞培養基，或者僅用細胞培養基處理細胞(控制組)。各組細胞於37℃培養24小時後用於粒線體活性分析，以前述粒線體膜電位檢測套組中的螢光染劑JC-1指示粒線體膜電位。圖1顯示前述各組Na2細胞中JC-1聚集體的相對量(%)，其值越高表示細胞的平均粒線體活性越高；圖中*及**分別表示相比控制組為p<0.05及p<0.01。依據圖1，相比控制組，施予高良月桃根莖部水萃取物顯著提升N2a細胞的粒線體活性約38%，並且在三種二次萃取物中僅有乙酸乙酯層萃取物顯著提升粒線體活性約188%。此結果說明高良月桃根莖部水萃取物之乙酸乙酯層萃取物含有可提升粒線體活性之神經保護活性成分。
鑒於粒線體活性提升可能伴隨細胞內活性氧物質生成增加，進一步測試對小鼠腦神經瘤細胞株N2a施以含62.5μg/mL前述高良月桃根莖部水萃取物、水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、或正丁醇層萃取物之細胞培養基後，該細胞在1mM過氧化氫刺激下的活性氧物質相對含量(相對於控制組細胞的活性氧物質含量)。依據圖2，相比僅用細胞培養基處理之控制組細胞，過氧化氫之處理會誘導N2a細胞產生活性氧物質，但同時施予高良月桃根莖部水萃取物卻明顯減少N2a細胞中約35.3%之活性氧物質累積，特別是僅有乙酸乙酯層萃取物顯著抑制約80.5%之活性氧物質生成。此結果說明高良月桃根莖部水萃取物之乙酸乙酯層萃取物在提升粒線體活性的同時能抑制神經細胞氧化壓力增加。
基於粒線體活性分析及活性氧物質生成試驗的結果，進一步自前述乙酸乙酯層萃取物中分離出提升神經細胞粒線體活性之潛在化合物。依據生 物活性導引分離方法(bioassay guided fractionation)，使用矽膠管柱及正己烷與乙酸乙酯依體積比100：1混合之沖提液，對乙酸乙酯層萃取物進行管柱層析，可得到18個劃分層(分別標記為F1至F18)。其後，對F3劃分層進行管柱層析，所得流出液再經薄層層析片分離，可得到5個劃分層(分別標記為F3-1至F3-5)。F3-2劃分層再以甲醇與水依體積比2：8之混合液作為移動相進行高效液相層析(HPLC)，可分離得化合物1(約25.3mg)。
F2劃分層進一步以逆相層析管柱RP-18分離得6個劃分層(分別標記為F2-1至F2-6)。F2-4劃分層再以甲醇與水依體積比2：8之混合液作為移動相進行高效液相層析，可分離得化合物2(約3.0mg)及化合物4(約2.5mg)。
此外，使用Sephadex LH-20管柱及甲醇沖提液，對F7劃分層進行管柱層析，可得到5個劃分層(分別標記為F7-1至F7-5)。F7-3劃分層再以甲醇與水依體積比3：7之混合液作為移動相進行高效液相層析，可分離得到化合物3(約5.3mg)。
藉由質譜儀與核磁共振光譜儀分析確定化合物1、2、3、及4的化學結構，其名稱及結構式如下表1所示。
Figure 108114014-A0305-02-0010-1
Figure 108114014-A0305-02-0011-2
實施例2 化合物1-3提升神經細胞粒線體活性
本實施例利用粒線體活性分析檢驗化合物1、2、3或4(濃度為10μg/mL)提升神經細胞粒線體活性的效果，其結果如圖3所示；圖中*及**分別表示相比控制組為p<0.05及p<0.01。依據圖3，相比僅以細胞培養基處理之控制組N2a細胞，化合物1、2、及3之處理皆顯著提升N2a細胞中粒線體活性。具體而言，化合物1、2、或3分別提升粒線體活性約100%、29.9%、及39.9%。然而，未觀察到化合物4有此提升效果。
實施例3 化合物1-3抑制神經細胞中的活性氧物質生成
本實施例利用活性氧物質生成試驗檢驗化合物1、2、3、或4(濃度為10μg/mL)對過氧化氫刺激下神經細胞中活性氧物質生成的抑制效果，其結果如圖4所示；圖中*及**分別表示相比單獨施以過氧化氫為p<0.05及p<0.01。依據圖4，相比經1mM過氧化氫處理的N2a細胞，同時施予化合物1、2、或3顯著減少N2a細胞的活性氧物質累積。具體而言，化合物1、2、3、及4分別使活性氧物質相對含量下降約60.5%、77.8%、34.2%、及28.5%。
綜上所述，本發明揭露反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷之施用能顯著提升神經細胞粒線體活性，並且抑制活性氧物質生成，因此該些化合物即為生物活性物質，且具有保護神經細胞及預防 神經性退化疾病的潛力。據此，該些化合物或包含該些化合物之高良月桃萃取物可用於製備提升神經細胞粒線體活性之組合物。

Claims (8)

  1. 一種高良月桃萃取物用於製備提升神經細胞能量產生與物質代謝之組合物之用途，其中該組合物係透過提升神經細胞粒線體活性達成該能量產生與物質代謝之用途，該組合物包含一選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、胡椒酚-β-D-葡萄糖苷、及其任意組合所組成群組之化合物，且該高良月桃萃取物係以水對一高良月桃根莖部進行萃取而得。
  2. 一種化合物用於製備一神經保護之組合物之用途，其中該化合物係選自由反式-對香豆醇、反式-對乙醯氧基肉桂醇、及胡椒酚-β-D-葡萄糖苷所組成之群組，且該組合物係透過提升神經細胞粒線體活性達成該神經保護之用途。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該化合物的濃度為至少10μg/mL。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該組合物係以口服方式給予。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該組合物具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之用途，其中該組合物另包含一藥學上可接受的載體。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該水與該高良月桃根莖部之重量比範圍為10：1至5：1。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係先以水而後以乙酸乙酯對該高良月桃根莖部進行萃取而得。
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