CN104292278A - 诃子鞣质类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诃子的可水解鞣质，特别是新天然产物：(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-6′-yl]-12-chebulate,化合物 1 ]和(1-没食子酸酰)葡萄糖基4′→12-诃子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-4′-yl]-12-chebulate,化合物 2 ]的结构、分离纯化方法、抗氧化活性、抗丙肝病毒蛋白酶活性及其用途。这些成分本身或以其为组分的混合物可作为抗氧化剂、保肝或防治肝炎制剂在食品、化妆品和药品中应用。

Description

诃子鞣质类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然药物化学及食品化学技术领域，涉及2种诃子鞣质类新化合物及其有效部位及其制备方法和在防治肝炎和作为抗氧化剂在食品、化妆品和药品中的用途。 

背景技术

诃子为使君子科诃子(Terminalia chebula Retz.) 或绒毛诃子(Terminalia chebula Retz. Var. tomentella Kurt)的干燥果实，有涩肠止泻，敛肺止咳，降火利咽功能。中医药用于久泻久痢，肺虚咳喘好，咽痛音哑等疾病（国家药典委员会编 中华人民共和国药典 2010年版第一部，中国医药科技出版社，2010年印刷，第173-174页）。诃子是蒙医药和藏医药中最常用的药材，被称为“众药之王”，蒙藏医临床用于风热疹起、咽喉干痛、爆发火眼、湿热黄疸、肝区刺痛等（赵丽娟，杜遵义，诃子在藏蒙药中应用研究的概述，中国民族医药杂志，2007， 31-32。）。已知诃子中含有多种可水解鞣质类成分(Han, Q., Song, J., Wong, L., Xu, H., 2006. Preparative Isolation of hydrolysable tannins chebulagic acid and chebulinic acid from Terminalia chebula by high-speed counter-current chromatography.J Sep Sci. 29, 1653-1657.)，其中诃黎勒鞣花酸（chebulagic acid）有广谱抗病毒活性，可抑制病毒进入寄主细胞（Lin, L. T., Chen, T. Y., Lin, S. C., Chun, C. Y., Lin, T. C., Wang, G. H., Anderson, R., Lin, C. C., Richardson, C. D., 2013. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187.)。 

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）在全世界的感染率高达3%，造成全球约一亿七千万，中国内地约三千八百万的病毒携带者。HCV携带者虽然没有明显临床症状，但其中很大一部分人会逐渐发展为肝硬化和肝癌，同时还会作为传染源感染给别人。对于HCV感染，目前尚无特效药物，而且该病毒属于RNA病毒，经常发生变异使丙肝疫苗的研发异常困难，也使HCV容易对药物产生耐药性，所以寻找多种结构类型和多种作用机理的防治丙肝药物是药学研究者的紧迫任务（Francesco RD, Migliaccio G. Challenges and successes in developing new therapies for hepatitis C. Nature. 436: 953-960, 2005.）。在HCV病毒繁殖的成熟阶段先合成一种聚合蛋白，该蛋白必须经过病毒蛋白酶的加工才能成熟为有感染力的病毒，因此抑制HCV蛋白酶是寻找抗丙肝药物的有效手段（Clercq ED. The design of drugs for HIV and HCV. Nat Rev Drug Discov 6: 1001-1018. 2007.）。 

本发明以寻找多种结构类型和多种作用机理的防治丙肝药物为目的发现了具有抗HCV蛋白酶的诃子可水解鞣质（化合物1-10）。经解析核磁共振和质谱数据,鉴定为(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-6′-yl]-12-chebulate, 化合物1]和 (1-没食子酸酰)葡萄糖基4′→12-诃子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-4′-yl]-12-chebulate, 化合物2], 木麻黄鞣宁(casuarinin, 化合物3), 诃子裂酸(chebulic acid, 化合物4), 5-O-没食子酰基莽草酸（5-O-galloyl-shikimic acid, 化合物5), 五没食子酰葡萄糖（pentagalloyl glucose, 化合物6), 柯里拉京（corrilagin, 化合物7), 鞣花酸 (ellagic acid, 化合物8), 诃黎勒鞣花酸（chebulagic acid, 化合物9)，没食子酸（gallic acid, 化合物10) （附图16从诃子中分离鉴定出的化合物1-10的化学结构）； 

其中化合物1和2为新化合物，结构为诃子裂酸基和没食子酸基与葡萄糖形成的酯，与其他缩合鞣质的结构有很大差别。

本发明的目的在于提供2种诃子鞣质类新化合物及其有效部位及其制备方法和在防治肝炎和作为抗氧化剂在食品、化妆品和药品中的应用。 

发明内容

本发明涉及诃子裂酸衍生物：(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯（1）和 (1-没食子酸酰)葡萄糖基4′→12-诃子裂酸酯（2）的结构及诃子可水解鞣质的提取分离纯化方法和抗丙肝病毒蛋白酶活性。 

诃子的甲醇提取物经多种色谱分离得到10个纯品化合物，经解析多种核磁共振图谱和质谱数据确定出化合物的结构为：(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯（1）、 (1-没食子酸酰)葡萄糖基4′→12-诃子裂酸酯（2）、木麻黄鞣宁(3), 诃子裂酸(4)、5-O-没食子酰基莽草酸（5)、五没食子酰葡萄糖 (6)、柯里拉京（7)、鞣花酸 (8)、诃黎勒鞣花酸（9)和没食子酸（10)；其中(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯（1）和 (1-没食子酸酰)葡萄糖基4′→12-诃子裂酸酯（2）为新化合物；这些可水解鞣质类化合物均有较强的抗丙肝病毒蛋白酶活性和抗氧化活性。 

其具体技术方案为： 

诃子可水解鞣质的提取分离纯化方法： 

诃子粉碎后用甲醇迴流提取，提取物浓缩后直接用葡聚糖凝胶LH-20色谱分离，或者用乙酸乙酯和甲醇依次捏溶，或将浓缩物悬浮水中用乙酸乙酯萃取。各部分经ODS色谱分离,用甲醇/水梯度洗脱，经葡聚糖凝胶LH-20色谱，甲醇/水系统洗脱，ODS色谱包括制备液相色谱纯化得到诃子鞣质类化合物。 

上述化合物(3-10)经解析多种核磁共振图谱和质谱数据及和文献值对照确定出结构为：木麻黄鞣宁(3),诃子裂酸(4),5-O-没食子酰基莽草酸(5),五没食子酰葡萄糖(6),柯里拉京(7),鞣花酸(8),诃黎勒鞣花酸(9)和没食子酸(10)。 

化合物1和2为新化合物，结构测定过程如下： 

化合物1和2的结构测定 

化合物1和2的负离子电喷雾质谱均给出669.0的[M-H]^-峰。它们的负离子高分辨率电喷雾质谱分别给出m/z 669.0934和m/z 669.0943的精密分子量,结合核磁共振谱确定这两个化合物的分子式均为C₂₇H₂₆O₂₀(理论值:669.0939)。虽然因为化合物1和2的溶解度稍有差异因此在不同的氘代溶剂中测定了核磁共振谱,但它们的氢谱和碳谱在核磁信号的个数和偶合模式方面均很相似(表1)。这些现象说明化合物1和2是异构体,因此通过同时分析比较这2个化合物的图谱确定了它们的结构。化合物1和2的氢谱显示出可水解鞣质常有的芳香氢单峰和葡萄糖的信号。这些芳香氢单峰在多键碳氢关系(HMBC)谱中与酚性碳及羰基碳相关，说明存在没食子酰基。在每个化合物氢谱中均有2个这样的芳香单峰，1个积分值为2个氢,另一个积分值为1个氢，说明每个化合物均含有2个没食子酰基，其中1个为单取代的没食子酰基。化合物1和2的碳谱各显示5个羧/酯羰基信号(1:δ_C 179.5ppm,175.4ppm,175.3ppm,167.6ppm,166.2ppm；2:δ_C174.3ppm,173.8ppm,167.6ppm,165.7ppm,165.5ppm).其中3个(1:175.4ppm,167.6ppm,166.2ppm；2:173.8ppm,165.7ppm,165.5ppm)的信号强度较大推测为酯羰基。 

化合物1的碳谱显示4个连氧的芳香碳信号(144.5ppm,142.0ppm,140.0ppm,139.0ppm),其中144.5ppm的信号非常强，为3个碳信号重叠所致。化合物2的碳谱显示5个连氧的芳香碳信号(145.3ppm,145.1ppm,142.7ppm,139.1ppm,138.3ppm)，其中145.1ppm的信号明显强于其他信号，为结构对称的C-3″和5″信号重叠所致。在较高场的芳香/烯碳区域有5个信号(1:119.3ppm,119.1ppm,115.0ppm,110.3ppm,109.3ppm；2:120.0ppm,119.2ppm,116.7ppm,114.8ppm, 109.1ppm)，其中1个信号(1:110.3ppm；2:109.1ppm)强度明显大于其他信号归属于没食子酸的C-2″和C-6″(附图17化合物1和2的结构及其2维核磁共振谱中观察到的重要关联). 

化合物1和2分别在δ_C 94.1ppm和94.3ppm出现的¹³C信号归属于糖的端基碳。从异核单量子关系(HSQC)光谱可以找到糖的端基氢信号分别出现在5.57(d,7.0)和5.74(d,8.2).¹H-¹H COSY光谱揭示以端基氢为起点,化合物1出现了3.46ppm-3.65ppm-2.51ppm/2.35ppm；5.57ppm-3.51ppm的相邻质子相关峰；化合物2出现了5.74ppm-3.56ppm-3.78ppm-5.03ppm-3.75ppm-3.79ppm/3.62ppm的相邻质子相关峰,提示化合物1和2的结构中各有1个葡萄糖基。另外,¹H-¹H COSY光谱揭示了另1组相关(1:5.56ppm-3.75ppm-3.01ppm-2.58ppm/2.39ppm；2:5.51ppm-3.89ppm-3.09ppm-2.99ppm/2,30ppm)揭示了这2个化合物中的C3–C4–C9–C10的连接部分(附图17). 

H-3信号(1:5.56ppm,2:5.51ppm)的化学位移值及其在HMBC谱中出现的与C-1和C-12羰基的相关峰揭示该H-3信号夹在这2个羰基之间(附图17).另外,H-4(1:3.75ppm,d,J＝6.0；2:3.89ppm,d,J＝5.7)在HMBC谱中与芳香性C-5(1:144.5ppm；2:145.3ppm)明显相关,揭示C3-C4-C9-C10部分通过C-4与单取代的没食子酸部分相连.在HMBC谱中还显示了下述远程相关:H-10/C-11/C-13；H-9/C-13和H-4/C-12/C-13,说明在C3-C4-C9-C10部分有3个羧基取代。这些特征和相关峰说明化合物1和2中各有一个诃子裂酸的结构部分。通过上述分析可知化合物1和2中各有3部分结构：1个没食子酸基,1个吡喃葡萄糖基及一个诃子裂酸的结构部分. 

在HMBC谱中,糖的端基氢(1:5.57ppm,d,J＝7.0；2:5.74ppm,d,J＝8.2)与没食子酸的C-7″羰基(1:166.2ppm；2:165.5ppm)有远程相关,说明没食子酸基与葡萄糖基相连。诃子裂酸的C-12羰基信号(175.4ppm)在化合物1中与糖基H-6′的两个亚甲基质子(2.51ppm,m/2.35ppm,m)相关,说明诃子裂酸连接在C-6′位。在化合物2中,诃子裂酸的C-12羰基信号(173.8ppm)与糖基H-4′(5.03ppm,m)相关,说明诃子裂酸连接在C-4′位。化合物1和2的端基氢的偶合常数分别为7.0Hz和8.2Hz,说明糖的1位以β键与没食子酸相连。因此,化合物1和2的结构分别为(1-没食子酸酰)葡萄糖基6′→12-诃子裂酸酯 

[(1-galloyl)glucopyranosyl-6′-yl]-12-chebulate,化合物1]和(1-没食子酸酰)葡萄糖 基4′→12-诃子裂酸酯[(1-galloyl)glucopyranosyl-4′-yl]-12-chebulate,化合物2]。 

表1 化合物1(D₂O)和2(CD₃OD)的¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR数据 

蛋白酶抑制实验

HCV蛋白酶抑制实验根据所买的HCV试剂盒说明配制所需溶剂。将2 μl溶于DMSO的样品溶液和10 μl新配制的50 X酶底物混合加入384孔黑色板中。空白对照组用二甲亚枫溶液代替样品溶液，阳性对照组用蒽贝素（embelin）溶液代替样品溶液。然后每孔各加入8 μl酶（0.5 μg/ml），混匀在37?C温浴30 min后在490 nm/ 520 nm波长处测其荧光强度（F），抑制率计算如下：

HCV蛋白酶抑制率(%) =100*（F_空白-F_样品）/ F_空白         

每个样品测定3孔，取三孔的抑制率平均值。抑制率较好的样品，再依次以10倍浓度差稀释3个梯度，测其在不同浓度下的抑制率。然后绘制抑制率为Y轴，浓度的对数值为X轴的曲线，求出其抑制率为50%时的浓度，即得到IC₅₀；诃子可水解鞣质对HCV蛋白酶半数抑制浓度IC₅₀ (μg/ml)如表2所示 (表2)；所有分离到的诃子鞣质均对HCV蛋白酶产生抑制活性。值得一提的是木麻黄鞣宁 (3)和诃黎勒鞣花酸 (9)对HCV蛋白酶的抑制活性最强。文献报道木麻黄鞣宁(3)有抗带状疱疹的活性(Cheng, H., Lin, C., Lin, T., 2002. Antiherpes simplex virus type 2 activity of casuarinin from the bark of Terminalia arjuna Linn. Antiviral Research. 55(3), 447-455)，诃黎勒鞣花酸 (9)有抑制HCV 进入细胞的作用(Lin, L. T., Chen, T. Y., Lin, S. C., Chun, C. Y., Lin, T. C., Wang, G. H., Anderson, R., Lin, C. C., Richardson, C. D., 2013. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187.) 。这些结果提示可水解鞣质可能有与病毒多个靶点结合的能力，有望作为广谱抗病毒制剂的组分或先导化合物。

抗氧化活性测定

参考本发明人报道的方法（Ma, C. M., Sato, N., Li, X. Y., Nakamura, N., Hattori, M., 2010. Flavan-3-ol contents, anti-oxidative and α-glucosidase inhibitory activities of Cynomorium songaricum.Food Chem 118, 116-119.），在96-孔板上测定清除自由基的作用。每孔加入10 μl化合物溶液(DMSO为溶剂，浓度为1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml)和190 μl DPPH [1,1-二苯基-2-间三硝基苯肼自由基(1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl radical)] 的乙醇溶液(0.1 mM)。室温培养20分钟后测定540 nm的吸收值A。清除自由基作用的计算公式如下：

有效率%=100×(A_对照－A_{受试化合物})/A_对照,

其中对照孔用DMSO代替受试化合物溶液。每个样品测定3孔，取三孔的有效率%平均值。以有效率%平均值为纵坐标，化合物浓度为横坐标绘制曲线，求得有效率为50%时的浓度为EC₅₀；

诃子可水解鞣质对DPPH游离基的清除作用EC₅₀ (μg/ml)如表2所示 (表2)；所有分离到的诃子鞣质对DPPH游离基均有较强的清除作用，可作为食品及化妆品的抗氧化剂或用于氧化应激引起的健康问题。

表2 诃子鞣质对HCV蛋白酶的抑制活性（IC₅₀）及对DPPH游离基的清除活性（EC₅₀） 

。

本发明的优点和效果在于，提供了诃子可水解鞣质新化合物及其有效部位，其原料药材资源丰富，价廉易得，采用现代技术分离精制，工艺可行，质量可控，活性实验结果肯定，填补了目前市场上尚无非拟肽类HCV蛋白酶抑制剂的空白，显示了诃子鞣质制备新型防治丙型肝炎药物的良好前景。 

附图说明： 

附图1   化合物1的¹HNMR谱图；

附图2   化合物1的¹³CNMR谱图；

附图3   化合物1的HMQC-NMR谱图；

附图4   化合物1的HMBC-NMR谱图；

附图5   化合物1的H-H COSY谱图；

附图6   化合物1的NOESY谱图；

附图7   化合物1的高分辨率质谱图（负离子模式）；

附图8   化合物2的¹HNMR谱图；

附图9   化合物2的¹³CNMR谱图；

附图10   化合物2的HMQC-NMR谱图；

附图11   化合物2的HMBC-NMR谱图；

附图12   化合物2的H-H COSY谱图；

附图13   化合物2的NOESY谱图；

附图14   化合物2的高分辨率质谱图（负离子模式）；

附图15   化合物1 和2的CD谱图；

附图16从诃子中分离鉴定出的化合物1-10的化学结构 

附图17化合物1和2的结构及其2维核磁共振谱中观察到的重要关联

实施范例：

下面给出实施例进一步说明本发明这些实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但不对本发明进行限制。任何熟悉本技术领域的人员在本发明披露的技术范围内，简单变化或等效替换的技术方案均落入本发明的保护范围内；

实施例一：诃子果肉部分可水解鞣质的提取分离纯化

3公斤诃子敲碎后，分出果肉部分（1公斤）粉碎后用甲醇迴流提取，提取物浓缩后用乙酸乙酯和甲醇依次捏溶。乙酸乙酯可溶部分经cosmosil 140C18色谱,用甲醇/水梯度洗脱得到化合物5 (0.0005%w/w), 6 (0.0078%w/w) 和 7 (0.0055%w/w). 甲醇捏溶部分经葡聚糖凝胶LH-20色谱， 10%, 20%, 30%.....100% 甲醇/水系统洗脱，40%甲醇/水洗脱部分用 cosmosil 75C18 色谱分离只用水洗脱得到化合物 1(0.00125% w/w)和2 (0.0004%w/w). 化合物4 从10% MeOH 的甲醇流份中析出进一步经制备液相SIELC Primesep P层析柱 (10x250mm, 5μm)分离, 用0.1%甲酸水恒定比例洗脱得到纯品。各含纯品化合物溶液经减压浓缩和冷冻干燥后为化合物成品；

实施例二：诃子果核部分可水解鞣质的提取分离纯化

上述诃子敲碎后得到的果核部分（2公斤）粉碎后用甲醇回流提取. 提取物浓缩后用葡聚糖凝胶LH-20色谱分离, 用乙醇和甲醇洗脱. 乙醇洗脱部分经cosmosil 75C18色谱分离甲醇/水系统洗脱，减压浓缩后冷冻干燥得到化合物3 (0.0025%w/w), 8 (0.0009%w/w), 9 (0.0065%w/w) 和 10 (0.0070%w/w)。

Claims (7)

1.2种可水解鞣质新化合物及其有效部位, 其结构式如式(I)所示: 

式 （I）。

2.以含有可水解鞣质新化合物1和/或2及其有效部位为活性成分与一种或多种辅料组成的药物制剂。

3.如权利1所述化合物及其有效部位的制备方法，所述方法特征包括化合物及其有效部位的提取，化合物的分离与纯化。

4.如权利3所述制备方法，其特征是诃子果肉或果核或其混合物粉碎后用水、醇、水-醇混合物、或水-丙酮混合物迴流或室温提取。

5.如权利3所述制备方法，其特征是采用色谱法分离纯化，特别是填料用cosmosil 75C18 仅用水洗脱得化合物 1，以及 Cosmosil 140 C18，Primesep P 为分离柱的制备液相分离。

6.诃子鞣质，特别是所述新化合物及其有效部位或以其为组分的混合物作为抗氧化剂在食品、化妆品和药品中的应用。

7.诃子鞣质，特别是所述新化合物及其有效部位或以其为组分的混合物在制备防治丙型肝炎或保肝药品及保健、功能食品中的应用。