CN110604736A - 一种延龄草皂苷在制备保护神经药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种延龄草甾体皂苷在制备保护神经药物中的应用。通过延龄草中提取得到的甾体皂苷DTCA和ETCA作为活性成分，作为激活强效抗氧化作用的自噬诱导剂，通过自噬促进抗氧化应激反应，增加细胞活力，降低H2O2诱导的PC12细胞损伤细胞内ROS水平，保护神经，发挥治疗神经变性疾病的潜力。

Description

一种延龄草皂苷在制备保护神经药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种天然药物化合物的应用，特别涉及一种延龄草皂苷在保护神经药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
延龄草(Trillium Tschonoskii Maxim，TTM)，又名“燕岭草”，属于延龄草属(百合科)，是一种分布于中国中西部地区的草本植物。延龄草干燥的根和根茎在传统中药应用中，被广泛用于治疗神经衰弱、癌症、头痛、炎症(如溃疡)、风湿性疼痛等。
现代药理研究发现，天然甾体皂苷具有多种生物活性，如抗癌、抗炎、抗菌和抗病毒等。甾体皂苷广泛存在并在植物中，如Smilax属，Solanum paniculatum L.，Furcraeahexapetala Leaves，Hosta plantaginea Rhizomes，Veronica fuhsii等植物提取的天然甾体皂苷。
早在三十多年前，将有学者从TTM的新鲜根、茎中分离出多种甾体皂苷，但关于延龄草甾体皂苷的药理活性报道有限。最近，Chai J，et al.从延龄草中分离出两种新的甾体皂苷，并发现它们在HepG2细胞中具有潜在的抗癌活性。王杰等，从TTM总提取物的水部分中分离出18-Norspirostanol皂苷，其对COX-2的产生具有强烈的抑制作用。另外，延龄草中分离得到的呋喃三萜，可以通过PI3K/Akt、MARK和Nrf2/HO-1途径抑制脂多糖诱导的炎症。据报道，从Trillium kamtschatcense的根中分离出的trillosides A和dioscin分别通过调节FaDu和人肺癌细胞系中的PI3K/Akt/mTOR信号通路来诱导自噬。
众所周知，氧化应激在神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)的发生和发展中起关键作用。活性氧(ROS)的产生由各种抗氧化系统平衡，如果ROS产生和抗氧化防御之间的平衡被打破，细胞中活性氧过度积累将导致氧化应激。目前已知氧化应激与多种疾病的发病有关，例如神经变性、高血压、糖尿病和动脉粥样硬化。
大脑是体内代谢最活跃的器官之一，使之更容易受氧化应激的损害。自噬是一种细胞过程，涉及将细胞质隔离成双膜形成，自噬体溶酶体融合，然后所有吞噬的物质被溶酶体降解成营养物和能量以维持细胞存活。最新研究表明自噬通过降解受损线粒体来抑制氧化应激以减少细胞内ROS产生的重要作用。
现有的防治氧化损害的药物，大多是采用化学合成的小分子抗氧化化合物，由于人工合成的化合物属于外源性非天然成分，这些化合物的代谢往往较为困难，大量药物分子以原形或者经过简单代谢，被肝、肾排泄出体外。化学合成的小分子化合物存在诸多不确定性，特别是药物代谢进入环境以后，由于自然界本身不存在这样的小分子化合物，因此小分子化合物在自然环境中降解周期较长，存在环境安全风险。另外，合成小分子化合物的过程中需要使用到大量的有机溶剂，同时合成过程中还会产生大量的副产物，这些合成过程中的废液、副产物等都会增加药厂排放废液的处理难度和处理成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的小分子化合物药物存在的副作用，生产化合物药物的成本限制等不足，提供一种延龄草甾体皂苷在制备保护神经药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种延龄草甾体皂苷在制备保护神经药物中的应用。
进一步，所述延龄草甾体皂苷是
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-去氧白花延龄草烯醇甙元(DeoxytrillenosideCA，DTCA)
和/或，
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-表白花延龄草烯醇甙元-21-O-乙酰基(EpitrillenosideCA，ETCA)。
进一步，延龄草甾体皂苷通过促进自噬作用发挥保护神经的作用。
进一步，延龄草甾体皂苷通过稳定GFP-LC3U87细胞引导自噬作用。
进一步，延龄草甾体皂苷通过ATG7，激活PC12细胞的自噬。
进一步，延龄草甾体皂苷通过增加细胞活力，降低H2O2诱导的PC12细胞损伤细胞内ROS水平。
进一步，延龄草甾体皂苷是用于治疗神经变性疾病的药物制备应用。
本发明通过延龄草中提取得到的甾体皂苷DTCA和ETCA作为活性成分，作为激活强效抗氧化作用的自噬诱导剂。利用细胞中与氧化应激密切相关性，通过自噬促进抗氧化应激反应。延龄草甾体皂苷通过稳定GFP-LC3U87细胞，显着增加GFP-LC3斑点形成。延龄草甾体皂苷可以通过ATG7激活PC12细胞的自噬，增加细胞活力，降低H2O2诱导的PC12细胞损伤细胞内ROS水平。两种延龄草甾体皂苷的抗氧化作用表明，其具有神经保护作用，具有治疗神经变性疾病的潜力，可以作为新药候选天然药物化合物活性成分使用。
本发明的另一目的是提供一种从延龄草中提取得到上述延龄草甾体皂苷化合物的方法，通过本发明的方法更好的从天然的延龄草原料药材中提取获得具有相应活性的甾体皂苷成分，满足延龄草提取物作为活性成分应用、研究的需求。
一种延龄草甾体皂苷的提取方法，包括以下步骤：
(1)将延龄草干燥，粉碎成粉末，用10倍体积60-95v％乙醇回流提取0.5-3小时，优选使用75v％乙醇用回流提取1h，重复两次；合并提取液，过滤，真空旋转蒸发浓缩至干。
(2)将步骤(1)得到的干燥的提取物重新溶解在水中，用等体积乙酸乙酯萃取3-5次，得乙酸乙酯相产物(ethyl acetate fraction，EF)；然后水相再用等体积正丁醇萃取3次，得正丁醇相产物(n-butanol fraction，NF)和水相产物(WF)。
(3)将步骤(2)得到的产物，真空除去溶剂，并冷冻干燥后，得到干燥的乙酸乙酯相产物(EF)、正丁醇相产物(NF)和水相产物(WF)。
(4)将乙酸乙酯相产物(EF)重新溶解在甲醇中，并与等量的硅胶混合，使用石油醚(PE)-甲醇(100：0-0：100，体积比)的梯度系统在硅胶开放柱上分级分离，得到十个部分F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10。
(5)将步骤(4)得到的F5通过pre HPLC进一步分离和纯化，色谱条件如下：色谱柱：C18柱，流速：3.0mL/min，流动相：甲醇-水溶液，CH3OH-H2O，比例48:52v/v；分离得到得到化合物1和化合物2。
其中，化合物1是：
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-去氧白花延龄草烯醇甙元(DeoxytrillenosideCA，DTCA)。
化合物2是：1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-表白花延龄草烯醇甙元-21-O-乙酰基(EpitrillenosideCA，ETCA)。
优选地，色谱柱为C18柱，Thermo250mm×10mm，粒径：5μm。
进一步，将步骤(3)从延龄草乙醇提取物中分离的WF、NF和EF组分，分别通过超高效液相色谱UHPLC(Agilent Technologies 1290系列)进行分离，通过液相色谱配备的6230TOF/MS进行负离子和正离子模式分析检测，确定分离产物。
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱上分离(粒径：1.8μm，流速：0.35mL/min)。
流动相：A(0.1％甲酸水溶液)和B(0.1％甲酸的乙腈溶液)。
梯度洗脱：0-8分钟，5-70％B；8-11分钟，70-100％B；11-12分钟，100％B；12-15分钟，5％B。
对于UHPLC-TOF/MS分析，数据是在扫描模式下获得的(m/z 100-1700Da，2.0sepectra/s)，并使用Agilent Mass HunterWorkstation B.01.03进行分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明通过延龄草中提取得到的甾体皂苷DTCA和ETCA作为活性成分，作为激活强效抗氧化作用的自噬诱导剂，利用细胞中与氧化应激密切相关性，通过自噬促进抗氧化应激反应。
2、延龄草甾体皂苷的抗氧化作用表明，其具有神经保护作用，具有治疗神经变性疾病的潜力，可以作为新药候选天然药物化合物活性成分。
附图说明：
图1是延龄草中WF、NF和EF中各种天然化学成分鉴别结果。
图2是从延龄草中分离的总乙醇提取物(TEE)中分离的各组分的自噬效应。
图3是从延龄草总乙醇提取物(TEE)的EF乙酸乙酯相中提取分离的各个组分的自噬诱导作用。
图4是在F5中分离得到的可能促使稳定GFP-LC3 U87细胞诱导自噬作用的化合物。
图5是化合物1和化合物2的分子结构。
图6是化合物1的COZY和HMBC主要空间结构变换。
图7是化合物1的NOESY主要空间结构变换。
图8是DTCA和ETCA通过ATG7基因诱导自噬作用。
图9是H2O2诱导的PC12细胞试验中，DTCA和ETCA降低细胞死亡和细胞内ROS水平。
图10是通过激活自噬，DTCA和ETCA降低H2O2诱导的PC12细胞中的细胞死亡和细胞内ROS水平。
图11是化合物DTCA的1H-NMR核磁共振图谱。
图12.是化合物DTCA的13C-NMR核磁共振图谱。.
图13是化合物DTCA的无畸变的极化转移增强图谱(DEPT)。
图14是化合物DTCA的COSY(correlation spectroscopy)图谱。
图15是化合物DTCA的HMBC图谱(heteronuclear multible bond correlationspectroscopy)。
图16是化合物DTCA的NOESY图谱(nuclear overhauser effect spectroscopy)。
图17是化合物DTCA的HSQCY图谱(heteronuclear single quantum coherencespectroscopy)。
图18是化合物ETCA的1H-NMR核磁共振图谱。
图19是化合物ETCA的13C-NMR核磁共振图谱。
图20是蛋白质印迹测试的全谱图(full length of western blotting images)。
具体实施方式
一、试验仪器及设备
采用配备有DAD检测器的安捷伦Agilent 6230质谱仪，通过电喷雾电离(ESI)飞行时间(TOF)，检测得到DTCA和ETCA的UV和HRMS图谱。
采用Bruker Ascend 600核磁共振仪，TMS作为内标物，分别检测得到1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)的核磁共振图谱。其中，化学位移以δ(ppm)表示，偶合常数(J)以赫兹(Hz)给出。
首先，以填充硅胶(40-60μm，)柱进行色谱进行延龄草甾体皂苷的初步分离，分离过程中使用预涂60μm硅胶的F254板通过薄层色谱(TLC)进行平行检测。
然后，通过配备有1200型四元泵和1200型二极管阵列检测器的制备型高效液相色谱(Pre-HPLC，安捷伦)，C18柱(250mm×10mm，粒径：5μm)，进一步分离和纯化延龄草甾体皂苷。
二、原料药材
延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)根茎于2014年5月从中国河北永益中药有限公司购买。凭证样本(编号MUST-TR201410)已存放于澳门科技大学，中医药学院，质量研究国家重点实验室。
三、提取和分离
将风干的延龄草(2.5kg)粉碎成粉末，用10倍体积75v％乙醇用回流提取1小时，重复两次。合并提取液，过滤，真空旋转蒸发浓缩至干。将干燥的提取物重新溶解在水中，用等体积乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯相(ethyl acetate fraction，EF)；然后水相再用等体积正丁醇萃取3次，得正丁醇相(n-butanol fraction，NF)和水相产物(WF)。真空除去溶剂并冷冻干燥后，得到干燥的EF(56g)、NF(105g)和WF(201g)。
然后将40g EF重新溶解在甲醇中并与等量的硅胶混合，使用石油醚(PE)-甲醇(100：0-0：100，体积比)的梯度系统在硅胶开放柱上分级分离，得到十个部分(F1-F10)。其中，Fr.5(263mg)通过pre HPLC进一步分离和纯化，色谱柱：C18柱(Thermo fisher，250mm×10mm，粒径：5μm，流速：3.0mL/min)，流动相：甲醇水溶液，CH3OH-H2O(48:52v/v)，得到化合物1(10.3mg)和化合物2(31mg)。
四、色谱条件
将上述从延龄草乙醇提取物中分离的WF、NF和EF组分，分别通过超高效液相色谱UHPLC(Agilent Technologies 1290系列)进行分离，通过液相色谱配备的6230 TOF/MS进行负离子和正离子模式分析检测，确定分离产物。
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱上分离(粒径：1.8μm，流速：0.35mL/min)。
流动相：A(0.1％甲酸水溶液)和B(0.1％甲酸的乙腈溶液)。
梯度洗脱：0-8分钟，5-70％B；8-11分钟，70-100％B；11-12分钟，100％B；12-15分钟，5％B。
对于UHPLC-TOF/MS分析，数据是在扫描模式下获得的(m/z 100-1700Da，2.0sepectra/s)，并使用Agilent Mass HunterWorkstation B.01.03进行分析。
五、细胞培养
STable GFP-LC3 U87细胞系(澳门科技大学朱晓明博士提供)。
野生型Atg7和Atg7缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是来自Masaaki Komatsu(Juntendo University，School of Medicine，Tokyo，Japan)赠送。
PC-12细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD，USA)。
PC12细胞加入10％马血清培养基中培养。其他细胞加入10％胎牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素(Invitrogen，Scotland，UK)的培养基中培养。
将所有细胞在5％CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。
六、细胞毒性测定
将延龄草总乙醇提取物、各种分离物(EF、NF和WT)，用DMSO溶解，-20℃保存，备用。通过MTT法测量细胞活力，MTT法中用到的试剂为3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(Sigma-MO)。
细胞接种于96孔微量培养板中，培养一天，然后接种不同浓度的测试提取物，培养48小时。然后，向每个孔中加入10μL MTT溶液(5μg/mL)，并继续培育4小时。将结晶甲瓒用100μLDMSO溶解充分。
对于通过结晶紫染色测量的细胞活力测定，将PC12细胞在6孔板中培养，然后加入不同浓度的延龄草提取物成分，继续培养24小时。然后将细胞与结晶紫溶液一起培养10分钟，PBS洗涤。
采用Nikon ECLIPSE 80i显微镜观察染色细胞，通过CCD数码相机Spot RT3TM采集图像。将染色细胞溶解于10％乙酸溶液中，测定细胞活力。
通过分光光度计在570nm波长下测定溶质混合物的比色读数。细胞活力的百分比按照以下公式进行计算：
细胞活力(％)＝处理的细胞数/细胞数DMSO对照×100％。
每个样品设置三个平行样。
七、GFP-LC3测试
按照文献(Wu AG,Wong VK,Xu SW,Chan WK,Ng CI,Liu L,et al.Onjisaponin Bderived from Radix Polygalae enhances autophagy and accelerates thedegradation of mutant alpha-synuclein and huntingtin in PC-12 cells.Int J MolSci.2013；14(11):22618-41.)所述的方法测定GFP-LC3。
将稳定的GFP-LC3 U87细胞和PC12细胞用GFP-LC3质粒快速转染，然后培养于6孔板中。转染处理后，用4％多聚甲醛(PFA)室温固化20分钟，PBS洗涤2次除去残留PFA。将载玻片风干，用FluorSaveTM固定剂(Calbiochem，San Diego，CA，USA)固化，然后采用荧光显微镜检查。使用Nikon ECLIPSE 80i显微镜40倍镜头下，检查具有GFP-LC3斑点形成的GFP阳性细胞的数目，并用Spot RT3TM数码相机(Diagnostic Instruments，Inc.，Melville，NY，USA)拍照得到具有代表性的图像。通过计数在GFP阳性细胞中形成斑点状GFP-LC3的细胞数来计算具有点状GFP-LC3荧光形成的细胞的百分比。计数包括三个随机选择的区域，每个区域中最少计数150个细胞。
八、蛋白质印迹(Western blot)
完成处理后，使用100μL RIPA(Cell Signaling Technologies Inc.Beverly，MA，USA))缓冲液(1x)收获细胞。使用Bradford试剂(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量蛋白质浓度。使用同等重量的SDS-PAGE溶解细胞裂解物。电压90V，电泳2小时，将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭60分钟，然后将加入抗体，4℃振摇过夜。使用TBST洗涤PVDF膜3次，加入HRP-conjugated第二抗体，培育60分钟。再次使用TBST洗涤3次，使用ECL Western Blotting Detection Reagents(4A Biotech Co.，Ltd，Beijing，China)使蛋白质条带显色。所有蛋白质印迹实验重复测试三个平行样。使用ImageJ软件(ImageJ 1.46r；National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)定量测试蛋白质表达，使用β-肌动蛋白对测量结果标准化处理，得到蛋白质条带强度标准化数值。
实验结果
1延龄草提取物组分鉴定
如图1A所示的延龄草根茎和根用75v％乙醇回流提取，然后总乙醇提取物(TEE)重新溶解于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯相(EF)、n-丁醇相(NF)和水馏分(WF)。通过UHPLC-TOF/MS对上述提取产物中的主要组分进行鉴定，扫描模式：m/z 100-1700Da(2.0spectra/s)，检测结果用Agilent MassHunter Workstation软件B.01.03进行数据分析。总离子色谱图(TIC)如图4B所示，在数据库“The Dictionary of NaturalProduct”中搜索关键词“Trillium”来鉴定各组分。如图4B和图4C所示，一部分延龄草中主要报道的化合物被鉴定，且主要分布在NF中。初步鉴定为延龄草进一步分离、生物活性测定实验提供了重要信息。
图1是延龄草中WF、NF和EF中各种天然化学成分鉴别结果。其中，图1A是延龄草植株的茎叶照片和根茎照片。图1B是WF、NF和EF的总离子色谱图TIC。将延龄草分离产物用Agilent 6230 UHPLC-MS-TOF分析，色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100mm×2.1mm，粒径：1.8μm)，流速：0.35mL/min。扫描参数：扫描模式m/z 100-1700Da2.0spectra/s。图1C是在数据库“The Natural of Natural Product”中搜索关键词“Trillium”获得并列出的已识别组分。
2延龄草乙酸乙酯相提取物(EF)诱导稳定的GFP-LC3 U87细胞自噬作用
在研究来延龄草总乙醇提取物(TEE)自噬作用之前，通过MTT方法测定稳定的GFP-LC3 U87细胞48小时细胞毒性。如图2A所示，EF的IC50值最低，低至4.015μg/mL。然后，通过检测稳定的GFP-LC3 U87细胞中的GFP-LC3斑点，分析TEE自噬诱导作用。将GFP-LC3 U87细胞和一定浓度的延龄草提取物组分混合，培育一段时间，测定具有GFP-LC3斑点的细胞百分比。结果如图2B和2C所示，延龄草总乙醇提取物中分离的乙酸乙酯相(EF)显示最佳的剂量增长和GFP-LC3B斑点形成相关性。另外，还通过检测LC3II表达来测量自噬效应。处理24小时后，将稳定表达的GFP-LC3 U87细胞并通过蛋白质印迹分析(western blotting)。其中，延龄草总乙醇提取物中分离的EF可以显着增加LC3-II的表达。总之，延龄草总乙醇提取物(TEE)的EF中的组分可以显著促进稳定GFP-LC3 U87细胞中的自噬效应。因此，在稳定GFP-LC3 U87细胞自噬诱导作用试验结果的指导下，我们进一步对EF相进行分离，并研究各组分的自噬诱导作用。
图2：从延龄草中分离的总乙醇提取物(TEE)中分离的各组分的自噬效应。图2A是延龄草总乙醇提取物(TEE)及其分离组分对稳定GFF-LC3 U87细胞48小时处理的细胞毒性。图2B是延龄草总乙醇提取物(TEE)对稳定gfp-lc3 U87细胞处理24小时后的GFP-LC3点状图像(图像放大倍率，x40)。图2C是稳定GFP-LC3 U87细胞经提取物处理后显示的GFP-LC3点状细胞百分比例条形图。S.D.*p<0.05,***p<0.001。图2D是用延龄草总乙醇提取物(TEE)、各分离组分分别对稳定GFF-LC3 U87细胞进行处理24小时，然后将细胞裂解，收集裂解物，分别经过LC3和β-肌动蛋白分析。图2E是稳定GFP-LC3 U87细胞经过提取物处理，Lc3ii/β-肌动蛋白表达变化柱状图，条形柱，S.D.**p<0.01。
3.从EF中分离得到的化合物f5显示出最佳自噬诱导作用
根据上述研究结果，从延龄草总乙醇提取物(TEE)中分离出的乙酸乙酯相(EF)具有最强的自噬诱导作用，因此我们用硅胶柱层析法对EF相进一步分离处理。使用UHPLC-MS-TOF液相色谱一起进行分离，扫描模式：100–1700Da(2.0spectra/s)，共得到10个组分。图3A是EF中分离得到的F1-F10的TIC图谱。采用MTT法检测了F1-F10对稳定GFP-LC3 U87细胞48小时细胞毒性，测定了F1-F10自噬诱导作用。如图3B所示，虽然F7具有最低自噬诱导作用的浓度(1.56μg/ml)，但也具有细胞毒性。而F5和F7具有相同的自噬诱导作用，但更安全。因此，组分F5主要发挥自噬诱导作用，而不造成严重的细胞毒性，使用Pre-HPLC进一步分离组分F5的关键药效成分。
图3是从延龄草总乙醇提取物(TEE)的EF乙酸乙酯相中提取分离的各个组分的自噬诱导作用。图3A是延龄草总乙醇提取物(TEE)的EF乙酸乙酯相中分离得到的F1-F10的tic图谱。所有组分均采用安捷伦Zorbax Plas Eclipse C18柱进行分离，(100mm×2.1mm，粒径：1.8μm)，流速100mL/min，流出物用安捷伦6230 UHPLC-MS-TOF进行分析。采用扫描模式：m/z 100-1700Da 2.0spectra/s。图3B是稳定GFP-LC3 U87细胞用分离得到的F1-F10组分处理48小时后，采用MTT法测定F1-F10细胞毒性的结果。图3C是用F1-F10处理稳定GFP-LC3U87细胞24小时，GFP-LC3点状形成图像(放大倍率，x40)。图3D是稳定GFP-LC3 U87细胞经过F1-F10组分处理后，形成的GFP-LC3点状细胞百分比比例，柱状图，S.D.**p<0.001。
4.从组分F5中分离得到的化合物1和2及其鉴定和分析
采用pre-HPLC分离对组分F5进行分离，得到具有自噬作用诱导效果的化合物1和化合物2。采用Agilent 6230 UHPLC-DAD-TOF/MS进行分离，得到两个主要的峰。所得到的两种化合物纯度高达95％，最大紫外线吸收波长为220nm。
化合物1是白色无定形粉末。如图4所示，HR-ESI-MS分析：负模式(negativemode)，显示m/z在941.3624[M+Cl]-和m/z 951.3915[M+COOH]-；正模式(positive mode)，显示m/z 889.3904[M+H-H2O+，m/z 907.3981[M+H]+和m/z 929.3789[M+Na]+；分子式计算值为C45H62O19，906.3885，包含13个不饱和键。化合物1的1H NMR图谱(图11和表1)特征信号：one angular methyl signals atδH 1.04(3H,s),two secondary methyl signals atδH0.81(3H,d,J＝6.6Hz)andδH 1.12,d,J＝7.2Hz)，an olefinic proton atδ563(d,J＝6.6Hz)；化合物1的C的13C NMR和DEPT图谱(图12-13和表1)，特征信号：three methylgroups,six methylenes(two oxygenated ones),ten methines(four oxygenatedones),two double bonds(δC 137.0/126.0 and 175.0/138.4),one quaternary carbon,one ketal(δC 111.7)and ketone group(δC 204.9)。此外，1D NMR图谱还显示：twoanomeric protons atδ4.26(d,7.8)and 5.46(d,1.8),corresponding to two anomericcarbon signals atδ100.7 and 96.3。上述独特数据表明化合物1是螺甾醇二糖苷。将NMR数据与本研究中从延龄草中分离的Epitrillenoside CA(30)的数据进行比较，两种化合物的NMR数据几乎相同，化合物1只是Epitrillenoside CA中C-21位的乙酰氧基被质子取代。进一步，通过1H-1H COSY和HMBC图谱验证化合物1的结构(图14-15和图12)。最终，化合物1分子平面结构被确定。通过在NOESY图谱(图16和图13)和偶联常数(coupling constants)中观察到的交叉峰确定化合物1的相对构型。H-9a/H-1和H-1/H-3的相关性显示OR-2和OH-3是β取向(orientations)。从H-17和CH3-21/H-16之间的相关性推导出CH3-21的α-取向。H2-26[δH3.77(t，J＝11.4Hz)和3.35(dd，J＝11.4,4.8Hz)]信号的耦合常数表明C-25处的甲基处于α-取向(图17)。最终确定了化合物1的结构，其IUPAC命名为：
1-O-[2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-4-O-acetyl-α-L-arabinopyranosyl]-21-Deoxytrillenogenin，命名为脱氧三萜皂苷CA(DTCA)(图5)。
化合物2是白色无定形粉末。HR-ESI-MS CM分析，负模式(negative mode)，在m/z999.3712[M+Cl]-和m/z 1009.4004[M+COOH]-；正模式(positive mode)，在m/z 947.3921m/z 947.3921[M+H-H2O]+，m/z 965.4007[M+H]+和m/z 982.4282[M+NH4]+计算确定分子式C47H64O21，964.3885)(图4)。1H NMR(CDCl3，600MHz)和13C NMR(CDCl3，150MHz)图谱显示如补充图8-9所示，详细数据列于表1中，和文献中报道的化合物一致(文献30)。所以，化合物2如图5所示，命名为：
1-O-[2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-4-O-acetyl-α-L-arabinopyranosyl]-21-O-acetyl-epitrillenogenin(epitrillenoside CA,ETCA)，上皮苷CA，ETCA。
图4是在F5中分离得到的可能促使稳定GFP-LC3 U87细胞诱导自噬作用的化合物。图4A是从F5分离的化合物的TIC图谱。样品在Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100mm×2.1mm，粒径：1.8μm)，流速0.35mL/min，使用Agilent 6230 UHPLC-DAD-TOF/MS分析，扫描模式：m/z 100-1700Da 2.0spectra/s。其中S1是化合物1的TIC；S2是化合物1的DAD色谱图(250nm)；S3是化合物2的TIC图谱；S4是化合物2的DAD色谱图(250nm)；图4B是正模式和负模式下化合物1的质谱图(MS)。图4C是化合物2在正模式和负模式下的质谱图(MS)。
图5是化合物1和化合物2的分子结构。
图6是化合物1的COZY和HMBC主要空间结构变换。
图7是化合物1的NOESY主要空间结构变换。
表1化合物1和化合物2在CDCl3中的1H(600MHz)和13C(150MHz)NMR质谱数据
表1中，a：重叠的信号
6 DTCA和ETCA通过ATG7基因诱导自噬作用
研究DTCA和ETCA在各种细胞系中的自噬作用，包括ATG7或ATG7缺陷的稳定GFP-LC3 U87细胞、PC12细胞、MEF细胞。首先，使用MTT法测量DTCA和ETCA对稳定的GFP-LC3 U87和PC12细胞的细胞毒性(图8A和8B)。DTCA和ETCA在稳定的GFP-LC3 U87中的自噬作用，通过计算GFP positive细胞中具有GFP-LC3斑点形成的细胞的百分比来监测PC12细胞。如图8C和8D所示，DTCA和ETCA可以在稳定GFP-LC3 U87细胞和瞬时转染(transientlytransfected)GFP-LC3质粒的PC12细胞中，对于GFP-LC3斑点形成，呈现剂量正相关的增长。蛋白质印迹(Western blotting)结果显示DTCA和ETCA也显着改善PC12细胞中的LC3II表达(图8G和8H)。此外，测定DTCA和ETCA在具有Atg7或Atg7缺陷的MEF细胞中自噬作用，结果如图8I和8J所示，DTCA和ETCA可以改善具有Atg7的野生型MEF细胞的LC3II表达，结果呈现剂量正相关，但对于具有Atg7。缺陷的MEF细胞影响不显著。
图8是DTCA和ETCA通过ATG7基因诱导自噬作用。图8A是DTCA和ETCA对于稳定的GFP-LC3 U87细胞处理48小时的细胞毒性。图8B是DTCA和ETCA对PC12细胞处理48小时的细胞毒性。图8C是将稳定的GFP-LC3 U87细胞与DTCA和ETCA在一定浓度下培育24小时，得到的具有GFP-LC3斑点的图像(放大倍数，×40)。图8D是一定浓度DTCA和ETCA处理稳定的GFP-LC3 U87细胞后，产生具有GFP-LC3斑点形成的细胞的百分比例条形图。图8G是在一定浓度下用DTCA和ETCA处理PC12细胞24小时，然后收集细胞，用蛋白质印迹分析蛋白质的LC3II表达。图8H是条形图，表示一定浓度处理下PC3细胞中LC3II/β-肌动蛋白的表达。图8I是在一定浓度下用DTCA和ETCA处理野生型Atg7和Atg7缺陷的MEF细胞24小时，然后收集细胞，用蛋白质印迹分析蛋白质用于测量LC3II表达。图8J是一定浓度药物处理下野生型Atg7和Atg7缺陷型MEF细胞中LC3II/β-肌动蛋白的表达的条形图，柱状图，S.D.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
7.DTCA和ETCA通过降低细胞内ROS水平改善H2O2诱导的PC12细胞的细胞活力
氧化应激在神经退行性疾病的进展中起重要作用。神经元中过度受损的线粒体释放出ROS的量，并诱导细胞死亡。在本实验中，使用导致氧化应激的常用试剂H2O2模拟诱导PC12细胞的细胞损伤。MTT测试结果显示100、200μM H2O2可显着降低PC12细胞的细胞活力，而DTCA和ETCA剂量依赖性地改善细胞活力(图9A和9B)。结晶紫染色试验也显示DTCA和ETCA可显着加深紫色，表明在H2O2诱导试验中的PC12细胞活力提高(图9C和9D)。此外，流式细胞术分析结果进一步证明DTCA和ETCA可以减少H2O2诱导的PC12细胞凋亡，并增加细胞活力(图9E和9F)。众所周知，H2O2诱导的细胞死亡与细胞内ROS水平的增加有关。图9G和9H显示，H2O2可以显着增加PC12细胞中通过DTCA和ETCA的处理降低的细胞内ROS水平。总之，DTCA和ETCA在H2O2诱导的PC12细胞氧化作用中发挥重要的抗氧化作用。
图9是H2O2诱导的PC12细胞试验中，DTCA和ETCA降低细胞死亡和细胞内ROS水平。使用H2O2诱导PC12细胞，然后用DTCA(图9A)或ETCA(图9B)处理24小时。处理后，通过MTT法测量细胞毒性(细胞活力)。图9C是使用H2O2诱导PC12细胞建立细胞损伤模型，然后将细胞用DTCA或ETCA处理24小时。处理后，用4％PFA固定细胞，并用结晶紫溶液染色，得到图像。图9D是使用Image J软件定量测量用结晶紫染色的PC12细胞的细胞活力，图中条形图显示有效浓度处理的PC12细胞活力。图9E是用H2O2诱导PC12细胞，然后将细胞与DTCA或ETCA共处理24小时。处理后，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术分析细胞凋亡。图9F是有效浓度处理PC12细胞的细胞活力条形图。图9G是通过H2O2诱导PC12细胞，然后将细胞与DTCA或ETCA共同处理24小时，处理后，将细胞与H2DCFDA荧光探针一起培育，然后使用流式细胞术分析。图9H是PC12细胞的细胞内ROS产生的条形图，柱状图，S.D。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
8.DTCA和ETCA通过自噬诱导保护PC12免受H2O2诱导的损伤
基于上述试验结果，DTCA和ETCA不仅可诱导自噬，还可改善H2O2诱导的PC12细胞的细胞活力。已知，自噬作用在维持细胞应激条件下的存活起重要作用。在本实验中，我们研究了DTCA和ETCA激活的自噬与H2O2诱导的PC12细胞中细胞活力的改善之间的关系。通过采用MTT和流式细胞术方法，图10A和10B显示自噬抑制剂如3-MA和Baf可显着抑制DTCA和ETCA在H2O2诱导的PC12细胞中的细胞活力的改善作用。此外，通过添加3-MA和Baf，DTCA和ETCA抑制的ROS产生增加。因此，我们得出结论DTCA和ETCA通过激活H2O2诱导的PC12细胞中的自噬来改善细胞活力并降低细胞内ROS水平。
图10是通过激活自噬，DTCA和ETCA降低H2O2诱导的PC12细胞中的细胞死亡和细胞内ROS水平。图10A，通过H2O2诱导PC12细胞，然后用DTCA，ETCA处理细胞，或用自噬抑制剂如3-MA和Baf共处理细胞。处理后，通过MTT法测量细胞活力结果。图10B是通过H2O2诱导PC12细胞，然后用DTCA、ETCA处理细胞，或用自噬抑制剂如3-MA和Baf共处理细胞。处理后，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术分析细胞凋亡。图10C是，处理后的PC12细胞的细胞活力条形图。图10D是用H2O2诱导PC12细胞，然后用DTCA、ETCA处理细胞，或用自噬抑制剂如3-MA和Baf共处理细胞。处理后，将细胞与H2DCFDA荧光探针一起培育，然后使用流式细胞术分析。图10E是处理后PC12细胞中的ROS产生条形图。S.D.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
讨论
神经退行性疾病是一组异质性疾病，主要特征就在于神经元的损失。迄今为止，神经退行性疾病的准确机制尚未完全阐明，但氧化应激已成为各种神经退行性疾病的主要潜在治病机制。累积的氧化应激导致DNA修复系统和线粒体功能障碍的损害，最终诱导神经元死亡并加速神经退行性疾病的进展。细胞ROS来自外源和内源，外源性ROS来源包括紫外线、药物、环境毒素、化学物质、电离辐射等。内源性ROS主要由线粒体呼吸链和Nox系统产生。
阿尔茨海默病(AD)作为最常见的神经退行性疾病之一，β样蛋白(Aβ)和细胞内tau缠结的积累。新出现的证据表明，Aβ和高度磷酸化的tau的积累导致氧化应激增加，并导致线粒体功能障碍和能量衰竭。作为反馈，氧化应激也会加剧Aβ的积累和tau的磷酸化。因此，氧化应激诱导AD的发病机制的恶性循环。
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病，多巴胺能(DA)的神经元丧失和路易体中的突变α-突触核蛋白。已发现与PD紧密相关的α-突触核蛋白，帕金和磷酸酶以及张力蛋白同源物诱导的假定激酶(PINK)的基因突变会影响线粒体功能并增加氧化应激。尽管其作用机制尚不清楚，但氧化应激也被认为是PD的主要病理生理机制之一。
亨廷顿舞蹈病(HD)是一种常染色体显性神经退行性疾病，其特征在于神经元中的突变亨廷顿蛋白(mHtt)。该疾病的病理学归因于mHtt功能的毒性增加。神经元中mHtt的聚集导致线粒体功能障碍并增加氧化应激，最终导致神经元死亡。因此，氧化应激也是HD发病机制中的主要事件之一。总之，氧化应激在神经退行性疾病的发病机理中起关键作用，抑制氧化应激已成为调节神经退行性疾病的最有希望的策略之一。
已知，自噬通常被称为巨自噬，是一种细胞内降解过程，可以利用溶酶体的功能去除细胞质成分，产生的酸性和营养素可以维持细胞的存活。自噬在氧化应激反应中起双重作用。据报道，中度自噬可以降解细胞中受损的成分，而急性或持续的氧化应激通常导致细胞内的氧化成分在细胞溶质中或在自噬吞噬的溶酶体内积累。溶酶体内未消化的物质会破坏其正常功能并释放自由基。然而，在氧化应激的早期阶段，自噬的激活通过在进一步损伤或聚集发生之前去除受损组分而起到保护作用。对于与神经退行性疾病等年龄相关的疾病，自噬活性下降，氧化成分在细胞内积累。因此，基于这些发现，增强自噬效应将是抗氧化损伤的理想防御机制，并且自噬激活剂已成为抗氧化应激的候选者。
延龄草作为一种传统中药材成分，具有抗癌、抗炎、抗病毒等多种生物活性。尽管在二十年前分离和鉴定了许多甾体皂苷，但研究的生物活性很小。首先，我们发现TCMs文库中的延龄草总乙醇提取物(TEE)在稳定的GFP-LC3 U87细胞中具有潜在的自噬作用。因此，在本研究中，自噬激活的指导下从TTM中分离自噬诱导物。通过在稳定GFP-LC3 U87细胞中引导自噬诱导的分离，总共两种化合物包括一种新的甾体皂苷，命名为：
1-O-[2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-4-O-acetyl-α-L-arabinopyranosyl]-21-Deoxytrillenogenin,(Deoxytrillenoside CA,DTCA)
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-去氧白花延龄草烯醇甙元(DeoxytrillenosideCA，DTCA)。
和已知的甾体皂苷:
1-O-[2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-4-O-acetyl-α-L-arabinopyranosyl]-21-O-acetyl-epitrillenogenin(Epitrillenoside CA,ETCA)
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-表白花延龄草烯醇甙元-21-O-乙酰基(EpitrillenosideCA，ETCA)。并通过UHPLC-DAD-TOF/MS和NMR技术进行表征。
最后，证明从延龄草总乙醇提取物中分离的乙酸乙酯相(EF)中分离的DTCA和ETCA在PC12细胞中具有有效的自噬作用。自噬相关蛋白(Atg)是控制自噬激活的主要调节剂。迄今为止，已发现31种自噬相关(ATG)基因，ATG5和ATG7是诱导自噬的必需分子。在本发明的研究中，我们发现DTCA和ETCA诱导的自噬依赖于ATG7基因。在H2O2诱导的氧化应激细胞模型中，DTCA和ETCA可以显着改善PC12细胞的细胞活力并降低产生的ROS水平。此外，3-MA和Baf等自噬抑制剂可抑制DTCA和ETCA对抗氧化应激的作用，提示DTCA和ETCA诱导的自噬在发挥抗氧化作用中起重要作用。除了自噬在抗氧化中的作用外，还证明了降解错误折叠的蛋白质如Aβ、tau、α-突触核蛋白和mHtt，它们与神经退行性疾病的病理学密切相关。DTCA和ETCA的神经保护作用对于未来的探索具有重要意义。

Claims (9)

1.一种延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述延龄草甾体皂苷是：
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-去氧白花延龄草烯醇甙元
和/或，
1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-表白花延龄草烯醇甙元-21-O-乙酰基。
3.如权利要求1所述延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用，其特征在于，延龄草甾体皂苷通过促进自噬作用发挥保护神经的作用。
4.如权利要求3所述延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用，其特征在于，延龄草甾体皂苷通过稳定GFP-LC3U87细胞引导自噬作用。
5.如权利要求3所述延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用，其特征在于，延龄草甾体皂苷通过ATG7，激活PC12细胞的自噬。
6.如权利要求1所述延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用，其特征在于，延龄草甾体皂苷通过增加细胞活力，降低H2O2诱导的PC12细胞损伤细胞内ROS水平。
7.如权利要求1所述延龄草甾体皂苷在制备保护神经的药物中的应用，其特征在于，延龄草甾体皂苷是用于治疗神经变性疾病的药物的制备应用。
8.一种延龄草甾体皂苷的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将延龄草干燥，粉碎成粉末，用10倍体积60-95v%乙醇回流提取0.5-3小时，重复两次；合并提取液，过滤，真空旋转蒸发浓缩至干；
（2）将步骤（1）得到的干燥的提取物重新溶解在水中，用等体积乙酸乙酯萃取3-5次，得乙酸乙酯相产物；然后水相再用等体积正丁醇萃取3次，得正丁醇相产物和水相产物；
（3）将步骤（2）得到的产物，真空除去溶剂，并冷冻干燥后，得到干燥的乙酸乙酯相产物、正丁醇相产物和水相产物；
（4）将乙酸乙酯相产物重新溶解在甲醇中，并与等量的硅胶混合，使用石油醚-甲醇=100：0-0：100，体积比，的梯度系统在硅胶开放柱上分级分离，得到十个部分F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10；
（5）将步骤（4）得到的F5通过pre HPLC进一步分离和纯化，色谱条件如下：色谱柱：C18柱，流速：3.0mL / min，流动相：甲醇-水溶液，CH3OH-H2O，比例48:52 v/v；分离得到化合物1和化合物2；
其中，化合物1是：1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-去氧白花延龄草烯醇甙元；
化合物2是：1-O-[2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-(1→2)-4-O-乙酰基-α-L-阿拉伯吡喃糖基]-表白花延龄草烯醇甙元-21-O-乙酰基。
9.根据权利要求8所述的延龄草甾体皂苷的提取方法，其特征在于，色谱柱为C18柱，250mm×10mm，粒径：5μm。
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