TWI740130B - 紫洋蔥萃取物與其化合物用於保健視網膜的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種紫洋蔥萃取物與其化合物用於保健視網膜的用途，能有效減少視網膜細胞照射紫外光造成之細胞凋亡、以及減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力，以達到有效預防視網膜細胞受紫外光以及藍光傷害之功效。其中該紫洋蔥萃取物係紫洋蔥以水、醇、或醇水混合物之溶劑所萃取而得，且該紫洋蔥萃取物含有槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷及/或色胺酸之效性成分。

Description

紫洋蔥萃取物與其化合物用於保健視網膜的用途
本發明係關於一紫洋蔥萃取物與其化合物用於保健視網膜的用途，尤其是一種紫洋蔥萃取物及其所包含之槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及/或色胺酸用於預防視網膜細胞受紫外光以及藍光之傷害的用途。
在視覺形成的過程中，光線會通過眼睛中透明的角膜及水晶體，並聚焦在視網膜上形成影像，接著視網膜中的感光細胞會將光刺激轉換成電訊號，並經由視神經將該電訊號傳遞至大腦視覺區，於該處神經細胞的訊號處理下形成視覺。其中，視網膜黃斑部為視網膜中最敏感的感光區域，如果這塊區域發生病變，人體的視覺功能將會大大受到影響。
UVB為紫外光一種其波長為280到315nm，眼睛若長時間照射UVB，以致過度吸收輻射能量，則可能造成眼睛之輻射能傷害，進而導致白內障、翳狀贅片、雪盲、強光性角膜炎、視網膜病變等眼睛疾病。
藍光是最靠近紫外線光、能量較強的可見光，其波長介於380-530nm，藍光波長較短而容易造成散射，眼睛需更用力聚焦而無法放鬆，因此長時間照射藍光容易導致眼睛的視物影像對比以及清晰度降低而增加眼睛疲勞感；且藍光無法被角膜與水晶體吸收而可直達視網膜，會破壞視網膜細胞內分子的結構，可能導致視網膜細胞損傷甚至凋亡；再者長期於高能量之藍光的刺激下，亦可能會使代謝物沉積在組織中，或長出微血管修補受損組織， 進而產生缺氧性之血管不正常新生，並造成如黃斑部病變等相關眼睛疾病，嚴重可能導致失明。
綜上所述，為了減少環境中的紫外光以及藍光對視網膜造成的損傷，以及預防相關眼睛疾病的發生，開發一種可以降低紫外光以及藍光所造成的黃斑部病變、改善大量血管生長所引起的眼疾以及降低視網膜色素上皮細胞凋亡的產品，著實有其必要性。尤其在現代人經常性地使用手機、平板電腦等3C產品的狀況下，保護眼睛免於藍光傷害尤為重要，因為這些產品的螢幕皆以發射高能量藍光的發光二極體為光源。
緣此，本發明之一目的在提供一種紫洋蔥萃取物用於製備保健眼睛之組合物的用途，其中該紫洋蔥萃取物係先進行一酵解步驟以得到一紫洋蔥酵解產物，再以一溶劑萃取該紫洋蔥酵解產物所獲得，且該溶劑為水、醇、或醇水混合物。
本發明之又一目的在提供一種醫藥組合物用於製備保健眼睛之藥物的用途，其中該醫藥組合物包含一有效劑量之槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物，以及醫藥學上可接受之載體。
本發明之另一目的在提供一種槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷用於製備保健眼睛之藥物的用途。
在本發明之一實施例中，該酵解步驟係將該紫洋蔥加入一食用酸，並以一綜合酵素於50-60℃作用以得到一紫洋蔥酵解產物，其中該綜合酵素含有木聚糖酶、纖维素酶、及半纖維素酶；且該溶劑與該紫洋蔥酵解產物之比例為5-20：1-5，且該萃取步驟係在70-90℃進行。
在本發明之又一實施例中，該紫洋蔥萃取物之濃度至少為138μg/mL。
在本發明之又一實施例中，該紫洋蔥萃取物進一步包含由紫洋蔥之水萃取物以一溶劑萃取而得之萃取物，該溶劑係為水、乙酸乙酯、或正丁醇。
在本發明之又一實施例中，該紫洋蔥萃取物包含一紫洋蔥之乙酸乙酯萃取物；且該紫洋蔥萃取物包含槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物。
在本發明之又一實施例中，該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸係由紫洋蔥分離純化而得；且該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸係由該紫洋蔥之乙酸乙酯萃取物分離純化而得。
在本發明之又一實施例中，該保健眼睛係預防視網膜細胞受紫外光及/或藍光照射所致之傷害。
在本發明之另一實施例中，該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷之濃度至少為10μg/mL。
本發明之紫洋蔥取物能有效減少視網膜細胞照射UVB造成之細胞凋亡、以及減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力，能有效預防視網膜細胞受紫外光以及藍光之傷害。且自本發明之紫洋蔥萃取物純化出之化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷、及色胺酸亦能有效減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力。因此，本發明之紫洋蔥萃取物以及自其中純化出之化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷可用於製備保健眼睛之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物關於減緩視網膜細胞受UVB傷害的長條圖。
圖2係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物關於減緩視網膜細胞受藍光傷害的長條圖。
圖3係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物之水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、及正丁醇層萃取物關於減緩視網膜細胞受藍光傷害的長條圖。
圖4係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物中萃取出之POB-1之氫光譜圖。
圖5係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物中萃取出之POB-2之氫光譜圖。
圖6係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物中萃取出之POB-3之氫光譜圖。
圖7係為本發明之一實施例的紫洋蔥萃取物中萃取出之POB-1、POB-2、及POB-3關於減緩視網膜細胞受藍光傷害的長條圖。*p值<0.05；***p值<0.001。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
紫洋蔥(Allium cepa cv.)為石蒜科(Amaryllidaceae)蔥屬(Allium)二年生或多年生之草本植物，係農業栽培之一種洋蔥品種。其鬚根從鱗莖基部或根狀莖上長出，通常微細長之弦線狀，其具鱗球莖係由地下部分的肥厚葉鞘所形成呈扁球狀或球狀，鱗球莖外包覆一層紫色薄皮，其內具數層呈白微紫色且具特殊的蔥蒜氣味的肉質莖；其根狀莖不甚明顯為單葉，葉呈長圓筒形且端 部呈尖狀，葉為深綠色，表面有蠟質，且葉鞘肥厚呈鱗片狀，密集於短縮莖之周圍以形成鱗莖；花葶從鱗莖基部長出，花序生於花葶頂端，花呈白色；種子為黑色呈多稜形或近球狀。
如本文中所使用的，用語「紫洋蔥萃取物」：紫洋蔥先加入一食用酸，並以一綜合酵素進行酵解作用後，得到一紫洋蔥酵解產物，再以一溶劑與該紫洋蔥酵解產物以5-20：1-5比例混合，並經一特定時間與溫度進行萃取而得之產物即為該紫洋蔥萃取物。其中該綜合酵素含有木聚糖酶、纖维素酶、及半纖維素酶。
依據本發明，以管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)自本發明之紫洋蔥萃取物的乙酸乙酯層萃取物中，所包含之三種化合物-槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、及色胺酸，將於本文分別命名為POB-1、POB-2、及POB-3。
依據本發明，有關混合物之化學分離及化學結構分析的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、 賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
本發明提供一種製備紫洋蔥萃取物及其所包含之槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、色胺酸或其任意組合用於保健眼睛之組合物的用途，能有效減少視網膜細胞照射紫外光造成之細胞凋亡、以及減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力，能有效預防視網膜細胞受紫外光以及藍光之傷害。
同時，本發明用於保健眼睛之組合物，亦可包含一有效量之紫洋蔥萃取物、槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、色胺酸或其任意組合，及一醫藥上可接受之載體，且該組合物係一醫藥品、或一食品。
以下將詳細說明本發明之紫洋蔥萃取物之詳細萃取方法；本發明之紫洋蔥萃取物減少視網膜細胞照射UVB造成之細胞凋亡的測試；本發明之紫洋蔥萃取物減少視網膜細胞照射藍光造成之氧化壓力的測試；槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸自紫洋蔥萃取物中純化之詳細方法；以及測試槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸減少視網膜細胞照射藍光造成之氧化壓力的測試。以證實該本發明之紫洋蔥萃取物以及其所包含之化合物槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸能有效減少視網膜細胞照射紫外光造成之細胞凋亡、以及減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力，以有效預防視網膜細胞受紫外光以及藍光之傷害。
細胞及細胞培養液
本發明之一實施例中使用之人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19係購自美國典型培養物保藏中心，編號為ATCC® CRL-2302，且該細胞係培養於含有10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)以及90%之DMEM/F12培養液，該培養液含有1：1比例之DMEM培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium，購自Gibco，美國，12100-046)與漢氏F12培養液(Ham's F12 Nutrient Mixture，購自Gibco，美國，12500-026)其中加入0.5mM之丙酮酸鈉(sodium pyruvate)以及15mM之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid,HEPES)緩衝溶液。
化學分析材料
正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d 1 (氘 化程度99.5%)、甲醇-d 6 (氘化程度99.5%)、重水(deuterium oxide，氘化程度大於99.8%)、及二甲基亞碸-d 6 (dimethyl sulfoxide-d 6 ，氘化程度>99.9%)購自台灣默克公司。
化學分析儀器
化合物的分離係利用管柱層析法(Column chromatography)及薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)。管柱層析支管住係選用自Sephadex LH-20(Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co.,Japan)、Silica gel(0.040-0.023mm)、LiChroprep® RP-18(0.040-0.023mm,Merck,EMD Millopore Co.,Germany)。高效液相層析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)系統裝配Agilent 1200系列四元幫浦(G1311A)、Agilent 1200 series variable wavelength偵測器(D1314B，偵測波長為200nm至380nm)；管柱係Luna 5μ RP-C18(250 x 10mm,Phenomenex,USA)。層析系統配備紫外燈UVP UVGL-25(波長為254nm及365nm)。薄層層析片係Silica gel 60 F254(0.25mm；Merck,Germany)或RP-18 F254S(0.25mm；Merck,Germany)之鋁片。
化合物的化學結構係以質譜法(Mass spectrometry,MS)及核磁共振光譜法(Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMR)進行分析。具體而言，使用二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜(Bruker amaZon SL system)及電噴灑離子化串聯質譜(ESI-MS/MS,Thermo Scientific Orbitrap Elite system)進行測定，單位為m/z；並使用Ascend 400'54 400MHz(Bruker Co.,Germany)取得一維與二維NMR光譜，以δ表示化學位移(Chemical shift)，其中單位為ppm；偶合常數(J)以Hz為單位，並以s表單峰(Singlet)，d表二重峰(Doublet)，t表三重峰(Triplet)，q表四重峰(Quartet)，p表五重峰，m表多重峰(Multiplet)，brs則表寬峰。
實施例1 本發明之紫洋蔥萃取物的製備方法
在本發明一實施例中，將紫洋蔥整顆切碎後與水以1：2-5(w/w)之比例均勻混合，並加入0.1-5%(w/w)可食用並可調控pH於2-4之食用酸，例如醋酸、檸檬酸、或鹽酸，其中食用酸較佳為檸檬酸，以及加入0.1-1%(w/w)綜合酵素，該綜合酵素包含木聚糖酶、纖维素酶、及半纖維素酶以1：1：0.5-1.5(w/w)比例組成，均質後於50-60℃進行酵解30-60分鐘。並將該酵解物直接與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑以1-5：5-20之比例混合，其中萃取溶劑較佳為水，於70-90℃進行萃取0.5-1.5小時，接著將該粗萃取物以400mesh之濾網過濾以獲得濾液。最後，將該濾液於45-65℃進行減壓濃縮，得到本發明之紫洋蔥萃取物。
實施例2 本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受UVB傷害之功效
本發明之一實施例為測試本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受UVB傷害之功效，使用MTT(Methylthiazoleltetrazolium bromide)assay定量ARPE-19細胞照射UVB後之存活率。其中，只有活細胞粒腺體內的琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase)可將水溶性黃色MTT還原成脂溶性的紫色MTT formazan，因此可利用測量吸光值得知細胞還原MTT的能力，並以此吸光度代表粒線體的活性，即活細胞之數目，故此試驗可作為細胞存活率的指標。
首先，將5x103個ARPE-19細胞種植於含100μL細胞培養液之96孔培養盤中，在含5% CO2之37℃恆溫培養箱中培養24小時後，將細胞分成下列六組：(1)僅加入細胞培養液且未照射UVB之空白控制組、(2)僅加入細胞培養液且照射UVB之正控制組、(3)加入138μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物作用24小時之實驗組、(4)加入187.5μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物作用24小時之實驗組、(5)加入279μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物作用24小時之實驗組、及(6)加入375μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物作用24小時之實驗組，接著分別去除該六組細胞之培養液，並各加入150μL之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞後，移除該PBS再各加入100μL之PBS於每孔細胞中，接著將培 養盤放置於藍光箱(Ultravioler radiation chamber)中，照射功率為1.5J/cm2之UVB，其中1.5J為LD 50(Lethal Dose 50%)之條件，係能殺死一半細胞數量之UVB劑量。接著去除PBS後，加入100μL之細胞培養液，於37℃下培養24小時後，於培養盤每孔中各加入15μL以1xPBS配製濃度為4mg/mL之MTT溶液(購自Amresco，編號為0793-5G)，再於含5% CO2之37℃細胞培養箱中培養3小時後取出培養盤，並在不影響貼附於盤底之細胞及所形成之結晶的情況下，小心地移除黃色的MTT溶液，接著於培養盤每孔中加入50μL之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)以6r.p.m.於震盪器搖動約10分鐘，使MTT結晶完全溶解於DMSO中，待完全溶解後會溶液呈紫色，接著以Microplate reader讀取培養盤中每孔於570nm波長之吸光值，並以下列公式推算該六組細胞之存活率：細胞存活率(Cell viability%)=(樣品OD570nm/空白控制組OD570nm)×100%，其中空白控制組為100%。最後，利用Excel軟體進行Student-t test以決定統計樣品間是否具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受UVB傷害的實驗結果如圖1所示。經UVB照射後能使約40%之ARPE-19細胞死亡，此結果顯示照射UVB確實能使人類視網膜細胞死亡；經138μg/mL、187.5μg/mL、279μg/mL、及375μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物預處理後，與正控制組比較，能分別提升約15%、35%、36%、及44%之ARPE-19細胞存活率，此結果顯示本發明之紫洋蔥萃取物能有效減少視網膜細胞照射UVB造成之細胞凋亡，能有效預防視網膜細胞受紫外光之傷害。
實施例3 本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受藍光傷害之功效
本發明之一實施例為測試本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受藍光傷害之功效，以ARPE-19細胞測試其減緩細胞中活性氧化物(Reactive Oxygen Species,ROS)累積之情形。首先，將1.5x105個ARPE-19細胞種植於含2 mL細胞培養液之6孔培養盤中，在含5% CO2之37℃恆溫培養箱中培養24小時後，在不擾動貼附盤底細胞的情況下移除細胞培養液，並將細胞分成下列三組處理：(1)僅加入細胞培養液且未照射藍光之空白控制組、(2)僅加入細胞培養液且照射藍光之正控制組、(3)加入375μg/mL本發明之紫洋蔥萃取物作用1小時之實驗組，接著於各組加入5μg/mL之二氯二氫螢光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA，購自Sigma，美國，編號SI-D6883-50MG，5mg/mL保存於DMSO中)於37℃下處理15分鐘以標記細胞中的活性氧化物，接著將細胞移置藍光箱(Chamber)中於室溫下照射藍光15分鐘後，在不擾動細胞之情況下將培養液移入15mL試管並置於暗處。接著以下步驟皆須避光，將移除培養液之細胞以1mL之1xPBS沖洗細胞二次，並加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)在室溫下反應5分鐘，使細胞由培養盤上脫落，並將細胞收集至先前收集培養液之15mL試管，將該試管以300g離心10分鐘後移除上清液，再以1mL之PBS沖洗細胞一次，接著再以300g離心10分鐘並移除上清液，並以1mL之PBS使細胞懸浮。接著，使用流式細胞儀(購自Beckman，美國)偵測細胞中激發波長為450-490nm且放射波長為510-550nm之螢光強度。
2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)是一種穩定的非極性化合物，可自由通透細胞膜，當DCFH-DA進入細胞後，會被細胞內的脂質酶水解，形成具有極性的2’,7’-dichlorodihydrofluorescin(DCFH)，停留在細胞內無法出來，而細胞內的活性氧化物與DCFH產生氧化還原反應形成2’,7’-dichlorofluorescin(DCF)，以450-490nm波長激發後，會產生的綠色螢光可以被於510-550nm波長被偵測出，因此偵測經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度，能反映細胞內活性氧物質之含量。
視網膜細胞在運作過程中進行氧化反應而產生能量時，容易因為短波長光線的照射而產生許多活性氧化物，進而對細胞造成氧化傷害。由於視網膜的感光細胞具有構造特殊的細胞膜而富含脂肪酸，其在藍光過度照射下， 特別容易發生過氧化反應與累積自由基，最終造成視網膜相關疾病，例如黃斑部病變。
本發明之紫洋蔥萃取物預防視網膜細胞受藍光傷害的實驗結果如圖2所示。未照射藍光之空白控制組的ARPE-19細胞中，活性氧化物的產生量極低；而經藍光照射後之正控制組的ARPE-19細胞中，活性氧化物的產生量明顯上升至22.5，此結果顯示照射藍光確實能使人類視網膜細胞中活性氧化物的產生量急遽上升。經本發明之紫洋蔥萃取物預處理後，能使ARPE-19細胞中的活性氧化物產生量明顯下降至3.25，此結果顯示本發明之紫洋蔥萃取物能有效減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物及氧化壓力，能有效預防視網膜細胞受藍光之傷害。
實施例4 分離本發明之紫洋蔥萃取物的效性成分
本發明之一實施例為分離本發明之紫洋蔥萃取物的效性成分，先取5L之實施例1中所述的紫洋蔥粗萃取物以乙酸乙酯與水等比例1：1的液相分配萃取方式共萃取3次，合併萃取液經減壓濃縮乾燥，得到乙酸乙酯層萃取物共3.9g，而水層萃取液則繼續以正丁醇與水等比例1：1的液相分配萃取方式共萃取3次，合併萃取液經減壓濃縮乾燥，得到正丁醇層萃取物共25.9g、及水層萃取物共158g。
接著，為試驗乙酸乙酯層萃取物、正丁醇層萃取物、及水層萃取物於減緩視網膜細胞照射藍光產生之氧化壓力的功效，以ARPE-19細胞分別測試該三分層萃取物減緩細胞中活性氧化物累積之情形。首先，將1.5x105個ARPE-19細胞種植於含2mL細胞培養液之6孔培養盤中，在含5% CO2之37℃恆溫培養箱中培養24小時後，在不擾動貼附盤底細胞的情況下移除細胞培養液，並將細胞分成下列五組處理：(1)僅加入細胞培養液且未照射藍光之空白控制組、(2)僅加入細胞培養液且照射藍光之正控制組、(3)加入2mg/mL水層萃取 物作用1小時之實驗組、(4)加入2mg/mL乙酸乙酯層萃取物作用1小時之實驗組、(5)加入2mg/mL正丁醇層萃取物作用1小時之實驗組，接著於各組加入5μg/mL之DCFH-DA於37℃下處理15分鐘以標記細胞中的活性氧化物，接著將細胞移置藍光箱中於室溫下照射藍光15分鐘後，在不擾動細胞之情況下將培養液移入15mL試管並置於暗處。接著以下步驟皆須避光，將移除培養液之細胞以1mL之1xPBS沖洗細胞二次，並加入200μL胰蛋白酶在室溫下反應5分鐘，使細胞由培養盤上脫落，並將細胞收集至先前收集培養液之15mL試管，將該試管以300g離心10分鐘後移除上清液，再以1mL之PBS沖洗細胞一次，接著再以300g離心10分鐘並移除上清液，並以1mL之PBS使細胞懸浮。接著，使用流式細胞儀偵測細胞中激發波長為450-490nm且放射波長為510-550nm之螢光強度。
本發明之紫洋蔥萃取物之水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、及正丁醇層萃取物於減緩人類視網膜色素上皮細胞因照射藍光所產生之氧化壓力的實驗結果如圖3所示。經藍光照射後，ARPE-19細胞中可偵測到7x106的螢光強度，顯示照射藍光確實能使視網膜上皮細胞產生大量的活性氧化物，並增加細胞中的氧化壓力，而經本發明之紫洋蔥萃取物之水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物、或正丁醇層萃取物預處理，皆可降低ARPE-19細胞中的活性氧化物，其中又以乙酸乙酯層萃取物具有最佳的活性功效。因此，進一步自乙酸乙酯層萃取物中分離出具有減緩照射藍光產生之氧化壓力的效性成分。
接著，依據生物活性導引分離方法(Bioassay guided fractionation)，追蹤乙酸乙酯層萃取物中的效性成分。首先，將3.9g乙酸乙酯層萃取物以矽膠為層析材料，以100：1比例混合之正己烷與乙酸乙酯為沖提液，經管柱層析後共分離得到10個劃分層(F1-F10)。
將劃分層F6經薄層層析片(TLC)點片合併，共得到7個劃分層(F6-1-F6-7)。其中，在分層6中經TLC片上的MeOH：H2O=3：7溶媒系統中，有良好的分離效果，而其中在分層6-2有一明顯的短波UV吸收點，經95%的硫酸甲 醇溶液呈色點黃色，因此利用HPLC以上述條件為沖提溶媒系統將劃分層F6-2進行進一步的分離純化，其中以3：7比例混合之甲醇與水為移動相，並得到3.5mg之化合物POB-1。
將劃分層F5以逆相管柱層析RP18劃分成10個劃分層(F5-1-F5-10)。其中，Fr.5在逆相薄層色層分析法(TLC)上有較佳的分離效果，故利用逆相層析法配合MeOH：H2O=1：4為沖提溶媒系統後，矽膠薄層色層分析法(TLC)判斷將其分為Fr.5-1-5-4。其中在分層5-4具有一個明顯短波常吸收的點，因此利用HPLC將劃分層F5-4進一步進行去除雜質及純化。再以HPLC進行純化，其中以2：8比例混合之甲醇與水為移動相，並得到3.0mg之化合物POB-2。
其中劃分層F3在MeOH：H2O=3：7的溶媒系統中，有良好的分離效果，其中有一明顯的短波UV吸收點，經95%的硫酸甲醇溶液具有顏色，故決定分離劃分層F3，並將其以HPLC進行純化，其中以3：7比例混合之甲醇與水為移動相，得到1.3mg之化合物POB-3。
將化合物POB-1、POB-2、及POB-3經由核磁共振光譜儀與質譜儀分析後經文獻比對，確定該三化合物之名稱及化學結構式如下表1所示，POB-1之氫光譜資料如圖4所示；POB-2之氫光譜資料如圖5所示；POB-3之氫光譜資料如圖6所示。其中，化合物POB-1為槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷；化合物POB-2為槲皮素-3-葡萄糖苷；化合物POB-3則為色胺酸。
Figure 108113458-A0305-02-0016-1
實施例5 本發明之紫洋蔥萃取物中效性成分預防視網膜細胞受藍光傷害之功效
本發明之一實施例為進行本發明之紫洋蔥萃取物中效性成分於護眼功效的再驗證，將分別測試POB-1、POB-2、及POB-3於減緩視網膜細胞照射藍光產生之氧化壓力的功效，以ARPE-19細胞分別測試該三分層萃取物減緩 細胞中活性氧化物累積之情形。首先，將1.5x105個ARPE-19細胞種植於含2mL細胞培養液之6孔培養盤中，在含5% CO2之37℃恆溫培養箱中培養24小時後，在不擾動貼附盤底細胞的情況下移除細胞培養液，並將細胞分成下列五組處理：(1)僅加入細胞培養液且未照射藍光之空白控制組、(2)僅加入細胞培養液且照射藍光之正控制組、(3)加入10μg/mL的POB-1作用1小時之實驗組、(4)加入10μg/mL的POB-2作用1小時之實驗組、(5)加入10μg/mL的POB-3作用1小時之實驗組，接著於各組加入5μg/mL之DCFH-DA於37℃下處理15分鐘以標記細胞中的活性氧化物，接著將細胞移置藍光箱中於室溫下照射藍光15分鐘後，在不擾動細胞之情況下將培養液移入15mL試管並置於暗處。接著以下步驟皆須避光，將移除培養液之細胞以1mL之1xPBS沖洗細胞二次，並加入200μL胰蛋白酶在室溫下反應5分鐘，使細胞由培養盤上脫落，並將細胞收集至先前收集培養液之15mL試管，將該試管以300g離心10分鐘後移除上清液，再以1mL之PBS沖洗細胞一次，接著再以300g離心10分鐘並移除上清液，並以1mL之PBS使細胞懸浮。接著，使用流式細胞儀偵測細胞中激發波長為450-490nm且放射波長為510-550nm之螢光強度。
本發明之紫洋蔥萃取物之乙酸乙酯層萃取物中效性成分POB-1、POB-2、及POB-3，於減緩人類視網膜色素上皮細胞因照射藍光所產生之氧化壓力的實驗結果如圖7所示。經POB-1預處理後，與正控制組相比，可顯著的降低ARPE-19細胞中62.3%之活性氧化物；經POB-2預處理之細胞中之活性氧化物則與正控制組差異不大；經POB-3預處理後，與正控制組相比，則可顯著的降低細胞中12.2%之活性氧化物。此結果顯示本發明之紫洋蔥之乙酸乙酯層萃取物中POB-1及POB-3可有效減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物及氧化壓力，有效預防視網膜細胞受藍光之傷害。
綜上所述，本發明之紫洋蔥取物能有效減少視網膜細胞照射UVB造成之細胞凋亡、以及減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧 化壓力，能有效預防視網膜細胞受紫外光以及藍光之傷害。且自本發明之紫洋蔥萃取物純化出之化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷、及色胺酸亦能有效減少視網膜細胞照射藍光所產生之活性氧化物與氧化壓力。因此，本發明之紫洋蔥萃取物以及自其中純化出之化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷可用於製備保健眼睛之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。

Claims (12)

  1. 一種紫洋蔥萃取物用於製備保健視網膜之組合物的用途，其中該紫洋蔥萃取物包含槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物，且該紫洋蔥萃取物係先進行一酵解步驟以得到一紫洋蔥酵解產物，該酵解步驟係將該紫洋蔥加入一食用酸，並以一綜合酵素於50-60℃作用以得到一紫洋蔥酵解產物，其中該綜合酵素含有木聚糖酶、纖维素酶、及半纖維素酶，再以一溶劑萃取該紫洋蔥酵解產物所獲得，且該溶劑為水、醇、或醇水混合物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該溶劑與該紫洋蔥酵解產物之比例為5-20：1-5，且該萃取步驟係在70-90℃進行。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該紫洋蔥萃取物之濃度至少為138μg/mL。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該紫洋蔥萃取物進一步包含由紫洋蔥之水萃取物以一溶劑萃取而得之萃取物，該溶劑係為水、乙酸乙酯、或正丁醇。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該紫洋蔥萃取物包含一紫洋蔥之乙酸乙酯萃取物。
  6. 一種組合物用於製備保健視網膜之組合物的用途，其中該組合物包含槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸係由紫洋蔥分離純化而得。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸係由該紫洋蔥之乙酸乙酯萃取物分離純化而得。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該組合物包含一醫藥學上可接受之載體。
  10. 一種槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷用於製備保健視網膜之藥物的用途。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷之濃度至少為10μg/mL。
  12. 如申請專利範圍第1項、第6項或第10項所述之用途，其中該保健視網膜係預防視網膜細胞受紫外光及/或藍光照射所致之傷害。
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媽咪們敢吃紫洋蔥嗎?因為紫洋蔥似乎對眼睛保健不錯? - BabyHome親子討論區，2017-10-01，https://forum.babyhome.com.tw/topic/4735404
媽咪們敢吃紫洋蔥嗎?因為紫洋蔥似乎對眼睛保健不錯? - BabyHome親子討論區，2017-10-01，https://forum.babyhome.com.tw/topic/4735404 Wang, Lu, et al. "Fermentation and complex enzyme hydrolysis for improving the total soluble phenolic contents, flavonoid aglycones contents and bio-activities of guava leaves tea." Food chemistry 264 (2018): 189-198. *

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