CN111821372A - 紫洋葱萃取物与其化合物用于制备保护眼睛的组合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物提取物领域,尤其是关于一紫洋葱萃取物与其化合物用于制备保健保护眼睛的组合物的用途。本发明提供一种紫洋葱萃取物与其化合物用于保护眼睛的用途,其中该紫洋葱萃取物是紫洋葱以水、醇、或醇水混合物的溶剂所萃取而得,且该紫洋葱萃取物含有槲皮素‑3,4’‑二葡萄糖苷及/或色胺酸的效性成分。所述紫洋葱提取物及其化合物能有效减少视网膜细胞照射紫外光造成的细胞凋亡、以及减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力,以达到有效预防视网膜细胞受紫外光以及蓝光伤害的功效。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域,尤其是关于一紫洋葱萃取物与其化合物用于制备保护眼睛的组合物的用途。
背景技术
在视觉形成的过程中,光线会通过眼睛中透明的角膜及水晶体,并聚焦在视网膜上形成影像,接着视网膜中的感光细胞会将光刺激转换成电信号,并经由视神经将该电信号传递至大脑视觉区,于该处神经细胞的信号处理下形成视觉。其中,视网膜黄斑部为视网膜中最敏感的感光区域,如果这块区域发生病变,人体的视觉功能将会大大受到影响。
UVB为紫外光一种其波长为280到315nm,眼睛若长时间照射UVB,以致过度吸收辐射能量,则可能造成眼睛的辐射能伤害,进而导致白内障、翳状赘片、雪盲、强旋光性角膜炎、视网膜病变等眼睛疾病。
蓝光是最靠近紫外线光、能量较强的可见光,其波长介于380-530nm,蓝光波长较短而容易造成散射,眼睛需更用力聚焦而无法放松,因此长时间照射蓝光容易导致眼睛的视物影像对比以及清晰度降低而增加眼睛疲劳感;且蓝光无法被角膜与水晶体吸收而可直达视网膜,会破坏视网膜细胞内分子的结构,可能导致视网膜细胞损伤甚至凋亡;再者长期于高能量的蓝光的刺激下,亦可能会使代谢物沉积在组织中,或长出微血管修补受损组织,进而产生缺氧性的血管不正常新生,并造成如黄斑部病变等相关眼睛疾病,严重可能导致失明。
综上所述,为了减少环境中的紫外光以及蓝光对视网膜造成的损伤,以及预防相关眼睛疾病的发生,开发一种可以降低紫外光以及蓝光所造成的黄斑部病变、改善大量血管生长所引起的眼疾以及降低视网膜色素上皮细胞凋亡的产品,着实有其必要性。尤其在现代人经常性地使用手机、平板计算机等3C产品的状况下,保护眼睛免于蓝光伤害尤为重要,因为这些产品的屏幕皆以发射高能量蓝光的发光二极管为光源。
发明内容
缘此,本发明的一目的在提供一种紫洋葱萃取物用于制备保护眼睛的组合物的用途,其中所述紫洋葱萃取物是先进行一酵解步骤以得到一紫洋葱酵解产物,再以一溶剂萃取该紫洋葱酵解产物所获得,且该溶剂为水、醇、或醇水混合物。
本发明的又一目的在提供一种医药组合物用于制备保护眼睛的药物的用途,其中所述医药组合物包含一有效剂量的槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物,以及医药学上可接受的载体。
本发明的另一目的在提供一种槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷用于制备保护眼睛的药物的用途。
在本发明的一实施例中,该酵解步骤是将该紫洋葱加入一食用酸,并以一综合酵素于50-60℃作用以得到一紫洋葱酵解产物,其中所述综合酵素含有木聚糖酶、纤维素酶、及半纤维素酶;且该溶剂与该紫洋葱酵解产物的比例为 5-20:1-5,且该萃取步骤是在70-90℃进行。
在本发明的又一实施例中,该紫洋葱萃取物的浓度至少为138μg/mL。
在本发明的又一实施例中,该紫洋葱萃取物进一步包含由紫洋葱的水萃取物以一溶剂萃取而得的萃取物,该溶剂为水、乙酸乙酯、或正丁醇。
在本发明的又一实施例中,该紫洋葱萃取物包含一紫洋葱的乙酸乙酯萃取物;且该紫洋葱萃取物包含槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物。
在本发明的又一实施例中,该槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸是由紫洋葱分离纯化而得;且该槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸是由该紫洋葱的乙酸乙酯萃取物分离纯化而得。
在本发明的又一实施例中,该保护眼睛是预防视网膜细胞受紫外光及/或蓝光照射所致的伤害。
在本发明的另一实施例中,该槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷的浓度至少为10 μg/mL。
本发明的紫洋葱取物能有效减少视网膜细胞照射UVB造成的细胞凋亡、以及减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力,能有效预防视网膜细胞受紫外光以及蓝光的伤害。且自本发明的紫洋葱萃取物纯化出的化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷、及色胺酸亦能有效减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力。因此,本发明的紫洋葱萃取物以及自其中纯化出的化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷可用于制备保护眼睛的组合物的用途,且该组合物是一医药品、或一食品,可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式,下述所列举的实施例是用以阐明本发明,并非用以限定本发明的范围,任何熟习此技艺者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可做些许更动与润饰,因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物关于减缓视网膜细胞受UVB伤害的柱形图;
图2是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物关于减缓视网膜细胞受蓝光伤害的柱形图;
图3是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物的水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、及正丁醇层萃取物关于减缓视网膜细胞受蓝光伤害的柱形图;
图4是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物中萃取出的POB-1的氢光谱图;
图5是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物中萃取出的POB-2的氢光谱图;
图6是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物中萃取出的POB-3的氢光谱图;
图7是本发明的一实施例的紫洋葱萃取物中萃取出的POB-1、POB-2、及 POB-3关于减缓视网膜细胞受蓝光伤害的柱形图;*p值<0.05;***p值<0.001。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值,所有实验数据皆表示在20%的范围内,较佳为在10%的范围内,最佳为在5%的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示,各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
紫洋葱(Allium cepa cv.)为石蒜科(Amaryllidaceae)葱属(Allium)二年生或多年生的草本植物,是农业栽培的一种洋葱品种。其须根从鳞茎基部或根状茎上长出,通常微细长的弦线状,其具鳞球茎是由地下部分的肥厚叶鞘所形成呈扁球状或球状,鳞球茎外包覆一层紫色薄皮,其内具数层呈白微紫色且具特殊的葱蒜气味的肉质茎;其根状茎不甚明显为单叶,叶呈长圆筒形且端部呈尖状,叶为深绿色,表面有蜡质,且叶鞘肥厚呈鳞片状,密集于短缩茎的周围以形成鳞茎;花葶从鳞茎基部长出,花序生于花葶顶端,花呈白色;种子为黑色呈多棱形或近球状。
如本文中所使用的,用语「紫洋葱萃取物」:紫洋葱先加入一食用酸,并以一综合酵素进行酵解作用后,得到一紫洋葱酵解产物,再以一溶剂与该紫洋葱酵解产物以5-20:1-5比例混合,并经一特定时间与温度进行萃取而得的产物即为该紫洋葱萃取物。其中所述综合酵素含有木聚糖酶、纤维素酶、及半纤维素酶。
依据本发明,以管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法(Thin layerchromatography,TLC)自本发明的紫洋葱萃取物的乙酸乙酯层萃取物中,所纯化出的三种化合物-槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、及色胺酸,将于本文分别命名为BOP-1、BOP-2、及BOP-3。
依据本发明,有关混合物的化学分离及化学结构分析的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型,这包括,但不限于:注射品(injection)[例如,无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation) 以及类似物。
依据本发明,医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂:溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体 (liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂:水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol) 以及它们的组合。
依据本发明,该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药:皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
依据本发明,食品产品可被当作食品添加物(food additive),藉由习知方法于原料制备时添加,或是于食品的制作过程中添加,而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明,食品产品的种类包括但不限于:饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
本发明提供一种制备紫洋葱萃取物、纯化自其的化合物槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、色胺酸或其任意组合用于保护眼睛的组合物的用途,能有效减少视网膜细胞照射紫外光造成的细胞凋亡、以及减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力,能有效预防视网膜细胞受紫外光以及蓝光的伤害。
同时,本发明用于保护眼睛的组合物,亦可包含一有效量的紫洋葱萃取物、槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、色胺酸或其任意组合,及一医药上可接受的载体,且该组合物是一医药品、或一食品。
以下将详细说明本发明的紫洋葱萃取物的详细萃取方法;本发明的紫洋葱萃取物减少视网膜细胞照射UVB造成的细胞凋亡的测试;本发明的紫洋葱萃取物减少视网膜细胞照射蓝光造成的氧化压力的测试;槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸自紫洋葱萃取物中纯化的详细方法;以及测试槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸减少视网膜细胞照射蓝光造成的氧化压力的测试。以证实该本发明的紫洋葱萃取物以及自其中纯化出的化合物槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷及色胺酸能有效减少视网膜细胞照射紫外光造成的细胞凋亡、以及减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力,以有效预防视网膜细胞受紫外光以及蓝光的伤害。
细胞及细胞培养液
本发明的一实施例中使用的人类视网膜色素上皮细胞ARPE-19是购自美国典型培养物保藏中心,编号为CRL-2302,且该细胞是培养于含有10%的胎牛血清(FetalBovine Serum)以及90%的DMEM/F12培养液,该培养液含有1:1比例的DMEM培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium,购自Gibco,美国,12100-046)与汉氏F12培养液(Ham's F12 Nutrient Mixture,购自Gibco,美国,12500-026)其中加入0.5mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)以及15mM的4- 羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethylpiperazineethanesulfonic acid,HEPES)缓冲溶液。
化学分析材料
正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、正丁醇(n-butanol)、乙腈(acetonitrile)、氯仿-d1(氘化程度99.5%)、甲醇-d6(氘化程度99.5%)、重水(deuterium oxide,氘化程度大于99.8%)、及二甲基亚砜-d6(dimethyl sulfoxide-d6,氘化程度>99.9%)购自中国台湾默克公司。
化学分析仪器
化合物的分离是利用管柱层析法(Column chromatography)及薄层层析法 (Thinlayer chromatography,TLC)。管柱层析支管住是选用自Sephadex LH-20 (Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co., Japan)、Silica gel(0.040-0.023mm)、RP-18(0.040-0.023mm,Merck, EMD Millopore Co.,Germany)。高效液相层析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)系统装配Agilent 1200系列四元帮浦(G1311A)、Agilent 1200series variable wavelength侦测器(D1314B,侦测波长为200nm至380 nm);管柱是Luna 5μRP-C18(250x 10mm,Phenomenex,USA)。层析系统配备紫外灯UVP UVGL-25(波长为254nm及365nm)。薄层层析片是Silica gel60 F254(0.25mm;Merck,Germany)或RP-18F254S(0.25mm;Merck,Germany) 的铝片。
化合物的化学结构是以质谱法(Mass spectrometry,MS)及核磁共振光谱法(Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMR)进行分析。具体而言,使用二维离子阱串联傅里叶变换质谱(Bruker amaZon SL system)及电喷洒离子化串联质谱(ESI-MS/MS,Thermo Scientific Orbitrap Elite system)进行测定,单位为m/z;并使用Ascend 400'54 400MHz(Bruker Co.,Germany)取得一维与二维 NMR光谱,以δ表示化学位移(Chemicalshift),其中单位为ppm;偶合常数(J) 以Hz为单位,并以s窗体峰(Singlet),d表二重峰(Doublet),t表三重峰(Triplet), q表四重峰(Quartet),p表五重峰,m表多重峰(Multiplet),brs则表宽峰。
实施例1本发明的紫洋葱萃取物的制备方法
在本发明一实施例中,将紫洋葱整颗切碎后与水以1:2-5(w/w)的比例均匀混合,并加入0.1-5%(w/w)可食用并可调控pH于2-4的食用酸,例如醋酸、柠檬酸、或盐酸,其中食用酸较佳为柠檬酸,以及加入0.1-1%(w/w)综合酵素,该综合酵素包含木聚糖酶、纤维素酶、及半纤维素酶以1:1:0.5-1.5(w/w)比例组成,均质后于50-60℃进行酵解30-60分钟。并将该酵解物直接与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以1-5:5-20的比例混合,其中萃取溶剂较佳为水,于 70-90℃进行萃取0.5-1.5小时,接着将该粗萃取物以400目的滤网过滤以获得滤液。最后,将该滤液于45-65℃进行减压浓缩,得到本发明的紫洋葱萃取物。
实施例2本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受UVB伤害的功效
本发明的一实施例为测试本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受UVB伤害的功效,使用MTT(Methylthiazoleltetrazolium bromide)assay定量 ARPE-19细胞照射UVB后的存活率。其中,只有活细胞粒腺体内的琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase)可将水溶性黄色MTT还原成脂溶性的紫色 MTT formazan,因此可利用测量吸光值得知细胞还原MTT的能力,并以此吸亮度代表粒线体的活性,即活细胞的数目,故此试验可作为细胞存活率的指标。
首先,将5x103个ARPE-19细胞种植于含100μL细胞培养液的96孔培养盘中,在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时后,将细胞分成下列六组: (1)仅加入细胞培养液且未照射UVB的空白控制组、(2)仅加入细胞培养液且照射UVB的正控制组、(3)加入138μg/mL本发明的紫洋葱萃取物作用24小时的实验组、(4)加入187.5μg/mL本发明的紫洋葱萃取物作用24小时的实验组、 (5)加入279μg/mL本发明的紫洋葱萃取物作用24小时的实验组、及(6)加入 375μg/mL本发明的紫洋葱萃取物作用24小时的实验组,接着分别去除该六组细胞的培养液,并各加入150μL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline, PBS)清洗细胞后,移除该PBS再各加入100μL的PBS于每孔细胞中,接着将培养盘放置于蓝光箱(Ultravioler radiation chamber)中,照射功率为1.5J/cm2的 UVB,其中1.5J为LD 50(Lethal Dose 50%)的条件,是能杀死一半细胞数量的 UVB剂量。接着去除PBS后,加入100μL的细胞培养液,于37℃下培养24小时后,于培养盘每孔中各加入15μL以1xPBS配制浓度为4mg/mL的MTT溶液 (购自Amresco,编号为0793-5G),再于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养3小时后取出培养盘,并在不影响贴附于盘底的细胞及所形成的结晶的情况下,小心地移除黄色的MTT溶液,接着于培养盘每孔中加入50μL的二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide,DMSO)以6r.p.m.于震荡器摇动约10分钟,使MTT结晶完全溶解于DMSO中,待完全溶解后会溶液呈紫色,接着以酶标仪读取培养盘中每孔于570nm波长的吸光值,并以下列公式推算该六组细胞的存活率:细胞存活率(Cell viability%)=(样品OD570nm/空白控制组OD570nm)×100%,其中空白控制组为100%。最后,利用Excel软件进行Student-t test以决定统计样品间是否具有显著差异(*p值<0.05;**p值<0.01;***p值<0.001)。
本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受UVB伤害的实验结果如图1所示。经UVB照射后能使约40%的ARPE-19细胞死亡,此结果显示照射UVB确实能使人类视网膜细胞死亡;经138μg/mL、187.5μg/mL、279μg/mL、及375μg/mL 本发明的紫洋葱萃取物预处理后,与正控制组比较,能分别提升约15%、35%、 36%、及44%的ARPE-19细胞存活率,此结果显示本发明的紫洋葱萃取物能有效减少视网膜细胞照射UVB造成的细胞凋亡,能有效预防视网膜细胞受紫外光的伤害。
实施例3本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受蓝光伤害的功效
本发明的一实施例为测试本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受蓝光伤害的功效,以ARPE-19细胞测试其减缓细胞中活性氧化物(Reactive Oxygen Species,ROS)累积的情形。首先,将1.5x105个ARPE-19细胞种植于含2mL细胞培养液的6孔培养盘中,在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时后,在不扰动贴附盘底细胞的情况下移除细胞培养液,并将细胞分成下列三组处理:(1) 仅加入细胞培养液且未照射蓝光的空白控制组、(2)仅加入细胞培养液且照射蓝光的正控制组、(3)加入375μg/mL本发明的紫洋葱萃取物作用1小时的实验组,接着于各组加入5μg/mL的二氯二氢荧光素二乙酸酯 (2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA,购自Sigma,美国,编号SI-D6883-50MG,5mg/mL保存于DMSO中)于37℃下处理15分钟以标记细胞中的活性氧化物,接着将细胞移置蓝光箱(Chamber)中于室温下照射蓝光15 分钟后,在不扰动细胞的情况下将培养液移入15mL试管并置于暗处。接着以下步骤皆须避光,将移除培养液的细胞以1mL的1xPBS冲洗细胞二次,并加入 200μL胰蛋白酶(Trypsin)在室温下反应5分钟,使细胞由培养盘上脱落,并将细胞收集至先前收集培养液的15mL试管,将该试管以300g离心10分钟后移除上清液,再以1mL的PBS冲洗细胞一次,接着再以300g离心10分钟并移除上清液,并以1mL的PBS使细胞悬浮。接着,使用流式细胞仪(购自Beckman,美国)侦测细胞中激发波长为450-490nm且放射波长为510-550nm的荧光强度。
2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)是一种稳定的非极性化合物,可自由通透细胞膜,当DCFH-DA进入细胞后,会被细胞内的脂质酶水解,形成具有极性的2’,7’-dichlorodihydrofluorescin(DCFH),停留在细胞内无法出来,而细胞内的活性氧化物与DCFH产生氧化还原反应形成 2’,7’-dichlorofluorescin(DCF),以450-490nm波长激发后,会产生的绿色荧光可以被于510-550nm波长被侦测出,因此侦测经DCFH-DA处理的细胞的荧光强度,能反映细胞内活性氧物质的含量。
视网膜细胞在运作过程中进行氧化反应而产生能量时,容易因为短波长光线的照射而产生许多活性氧化物,进而对细胞造成氧化伤害。由于视网膜的感光细胞具有构造特殊的细胞膜而富含脂肪酸,其在蓝光过度照射下,特别容易发生过氧化反应与累积自由基,最终造成视网膜相关疾病,例如黄斑部病变。
本发明的紫洋葱萃取物预防视网膜细胞受蓝光伤害的实验结果如图2所示。未照射蓝光的空白控制组的ARPE-19细胞中,活性氧化物的产生量极低;而经蓝光照射后的正控制组的ARPE-19细胞中,活性氧化物的产生量明显上升至22.5,此结果显示照射蓝光确实能使人类视网膜细胞中活性氧化物的产生量急遽上升。经本发明的紫洋葱萃取物预处理后,能使ARPE-19细胞中的活性氧化物产生量明显下降至3.25,此结果显示本发明的紫洋葱萃取物能有效减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物及氧化压力,能有效预防视网膜细胞受蓝光的伤害。
实施例4分离本发明的紫洋葱萃取物的效性成分
本发明的一实施例为分离本发明的紫洋葱萃取物的效性成分,先取5L的实施例1中所述的紫洋葱粗萃取物以乙酸乙酯与水等比例1:1的液相分配萃取方式共萃取3次,合并萃取液经减压浓缩干燥,得到乙酸乙酯层萃取物共3.9g,而水层萃取液则继续以正丁醇与水等比例1:1的液相分配萃取方式共萃取3次,合并萃取液经减压浓缩干燥,得到正丁醇层萃取物共25.9g、及水层萃取物共 158g。
接着,为试验乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、及水层萃取物于减缓视网膜细胞照射蓝光产生的氧化压力的功效,以ARPE-19细胞分别测试该三分层萃取物减缓细胞中活性氧化物累积的情形。首先,将1.5x105个ARPE-19细胞种植于含2mL细胞培养液的6孔培养盘中,在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时后,在不扰动贴附盘底细胞的情况下移除细胞培养液,并将细胞分成下列五组处理:(1)仅加入细胞培养液且未照射蓝光的空白控制组、(2)仅加入细胞培养液且照射蓝光的正控制组、(3)加入2mg/mL水层萃取物作用1小时的实验组、(4)加入2mg/mL乙酸乙酯层萃取物作用1小时的实验组、(5)加入2 mg/mL正丁醇层萃取物作用1小时的实验组,接着于各组加入5μg/mL的 DCFH-DA于37℃下处理15分钟以标记细胞中的活性氧化物,接着将细胞移置蓝光箱中于室温下照射蓝光15分钟后,在不扰动细胞的情况下将培养液移入15 mL试管并置于暗处。接着以下步骤皆须避光,将移除培养液的细胞以1mL的 1xPBS冲洗细胞二次,并加入200μL胰蛋白酶在室温下反应5分钟,使细胞由培养盘上脱落,并将细胞收集至先前收集培养液的15mL试管,将该试管以300 g离心10分钟后移除上清液,再以1mL的PBS冲洗细胞一次,接着再以300g离心10分钟并移除上清液,并以1mL的PBS使细胞悬浮。接着,使用流式细胞仪侦测细胞中激发波长为450-490nm且放射波长为510-550nm的荧光强度。
本发明的紫洋葱萃取物的水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、及正丁醇层萃取物于减缓人类视网膜色素上皮细胞因照射蓝光所产生的氧化压力的实验结果如图3所示。经蓝光照射后,ARPE-19细胞中可侦测到7x106的荧光强度,显示照射蓝光确实能使视网膜上皮细胞产生大量的活性氧化物,并增加细胞中的氧化压力,而经本发明的紫洋葱萃取物的水层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、或正丁醇层萃取物预处理,皆可降低ARPE-19细胞中的活性氧化物,其中又以乙酸乙酯层萃取物具有最佳的活性功效。因此,进一步自乙酸乙酯层萃取物中分离出具有减缓照射蓝光产生的氧化压力的效性成分。
接着,依据生物活性导引分离方法(Bioassay guided fractionation),追踪乙酸乙酯层萃取物中的效性成分。首先,将3.9g乙酸乙酯层萃取物以硅胶为层析材料,以100:1比例混合的正己烷与乙酸乙酯为冲提液,经管柱层析后共分离得到10个划分层(F1-F10)。
将划分层F6经薄层层析片(TLC)点片合并,共得到7个划分层 (F6-1-F6-7)。其中,在分层6中经TLC片上的MeOH:H2O=3:7溶媒系统中,有良好的分离效果,而其中在分层6-2有一明显的短波UV吸收点,经95%的硫酸甲醇溶液呈色点黄色,因此利用HPLC以上述条件为冲提溶媒系统将划分层F6-2 进行进一步的分离纯化,其中以3:7比例混合的甲醇与水为移动相,并得到3.5 mg的化合物POB-1。
将划分层F5以逆相管柱层析RP18划分成10个划分层(F5-1-F5-10)。其中, Fr.5在逆相薄层色层分析法(TLC)上有较佳的分离效果,故利用逆相层析法配合MeOH:H2O=1:4为冲提溶媒系统后,硅胶薄层色层分析法(TLC)判断将其分为Fr.5-1-5-4。其中在分层5-4具有一个明显短波常吸收的点,因此利用HPLC 将划分层F5-4进一步进行去除杂质及纯化。再以HPLC进行纯化,其中以2:8比例混合的甲醇与水为移动相,并得到3.0mg的化合物POB-2。
其中划分层F3在MeOH:H2O=3:7的溶媒系统中,有良好的分离效果,其中有一明显的短波UV吸收点,经95%的硫酸甲醇溶液具有颜色,故决定分离划分层F3,并将其以HPLC进行纯化,其中以3:7比例混合的甲醇与水为移动相,得到1.3mg的化合物POB-3。
将化合物POB-1、POB-2、及POB-3经由核磁共振光谱仪与质谱仪分析后经文献比对,确定该三化合物的名称及化学结构式如下表1所示,POB-1的氢光谱资料如图4所示;POB-2的氢光谱资料如图5所示;POB-3的氢光谱资料如图6所示。其中,化合物POB-1为槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷;化合物POB-2为槲皮素-3-葡萄糖苷;化合物POB-3则为色胺酸。
表1.槲皮素-3,4‘-二葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、及色胺酸的化学结构式。
实施例5本发明的紫洋葱萃取物中效性成分预防视网膜细胞受蓝光伤害的功效
本发明的一实施例为进行本发明的紫洋葱萃取物中效性成分于护眼功效的再验证,将分别测试POB-1、POB-2、及POB-3于减缓视网膜细胞照射蓝光产生的氧化压力的功效,以ARPE-19细胞分别测试该三分层萃取物减缓细胞中活性氧化物累积的情形。首先,将1.5x105个ARPE-19细胞种植于含2mL细胞培养液的6孔培养盘中,在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时后,在不扰动贴附盘底细胞的情况下移除细胞培养液,并将细胞分成下列五组处理:(1) 仅加入细胞培养液且未照射蓝光的空白控制组、(2)仅加入细胞培养液且照射蓝光的正控制组、(3)加入10μg/mL的POB-1作用1小时的实验组、(4)加入10 μg/mL的POB-2作用1小时的实验组、(5)加入10μg/mL的POB-3作用1小时的实验组,接着于各组加入5μg/mL的DCFH-DA于37℃下处理15分钟以标记细胞中的活性氧化物,接着将细胞移置蓝光箱中于室温下照射蓝光15分钟后,在不扰动细胞的情况下将培养液移入15mL试管并置于暗处。接着以下步骤皆须避光,将移除培养液的细胞以1mL的1xPBS冲洗细胞二次,并加入200μL胰蛋白酶在室温下反应5分钟,使细胞由培养盘上脱落,并将细胞收集至先前收集培养液的15mL试管,将该试管以300g离心10分钟后移除上清液,再以1mL的 PBS冲洗细胞一次,接着再以300g离心10分钟并移除上清液,并以1mL的PBS 使细胞悬浮。接着,使用流式细胞仪侦测细胞中激发波长为450-490nm且放射波长为510-550nm的荧光强度。
本发明的紫洋葱萃取物的乙酸乙酯层萃取物中效性成分POB-1、POB-2、及POB-3,于减缓人类视网膜色素上皮细胞因照射蓝光所产生的氧化压力的实验结果如图7所示。经POB-1预处理后,与正控制组相比,可显著的降低 ARPE-19细胞中62.3%的活性氧化物;经POB-2预处理的细胞中的活性氧化物则与正控制组差异不大;经POB-3预处理后,与正控制组相比,则可显著的降低细胞中12.2%的活性氧化物。此结果显示本发明的紫洋葱的乙酸乙酯层萃取物中POB-1及POB-3可有效减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物及氧化压力,有效预防视网膜细胞受蓝光的伤害。
综上所述,本发明的紫洋葱取物能有效减少视网膜细胞照射UVB造成的细胞凋亡、以及减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力,能有效预防视网膜细胞受紫外光以及蓝光的伤害。且自本发明的紫洋葱萃取物纯化出的化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷、及色胺酸亦能有效减少视网膜细胞照射蓝光所产生的活性氧化物与氧化压力。因此,本发明的紫洋葱萃取物以及自其中纯化出的化合物槲皮素-3,4’-二葡萄糖苷可用于制备保护眼睛的组合物的用途,且该组合物是一医药品、或一食品,可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。
Claims (13)
1.一种紫洋葱萃取物用于制备保护眼睛的组合物的用途,其中所述紫洋葱萃取物是先进行一酵解步骤以得到一紫洋葱酵解产物,再以一溶剂萃取所述紫洋葱酵解产物所获得,且所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述酵解步骤是将所述紫洋葱加入一食用酸,并以一综合酵素于50-60℃作用以得到一紫洋葱酵解产物,其中所述综合酵素含有木聚糖酶、纤维素酶、及半纤维素酶。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述溶剂与所述紫洋葱酵解产物的比例为5-20:1-5,且所述萃取步骤是在70-90℃进行。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述紫洋葱萃取物的浓度至少为138μg/mL。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述紫洋葱萃取物进一步包含由紫洋葱的水萃取物以一溶剂萃取而得的萃取物,所述溶剂为水、乙酸乙酯、或正丁醇。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述紫洋葱萃取物包含一紫洋葱的乙酸乙酯萃取物。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述紫洋葱萃取物包含槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物。
8.一种医药组合物用于制备保护眼睛的药物的用途,其特征在于,所述医药组合物包含一有效剂量的槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷、色胺酸或其混合物,以及医药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸是由紫洋葱分离纯化而得。
10.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷或色胺酸是由所述紫洋葱的乙酸乙酯萃取物分离纯化而得。
11.一种槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷用于制备保护眼睛的药物的用途。
12.根据权利要求11所述的用途,其特征在于,所述槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷的浓度至少为10μg/mL。
13.根据权利要求1、8或11所述的用途,其特征在于,所述保护眼睛是预防视网膜细胞受紫外光及/或蓝光照射所致的伤害。
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