KR20210124975A - 캐나비스 사티바(Cannabis sativa) 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 화장용, 의약용 및 건강기능용 용도 - Google Patents

캐나비스 사티바(Cannabis sativa) 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 화장용, 의약용 및 건강기능용 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캐나비스 사티바의 세포 배양물로부터 유래된 추출물, 바람직하게는 하이드로-알코올성 추출물의 화장용, 제약용, 건강기능용 용도, 그리고 이 추출물을 포함하는 화장용, 제약용, 건강기능용 조성물에 관한 것이다; 특히, 이 캐나비스 사티바 추출물을 함유하는 상기 조성물은 신경성 염증을 감소시키고 도파민 및 엔도르핀과 같은 신경전달물질 또는 뉴로펩티드의 생성을 활발하게 하는데 사용될 수 있다.

Description

캐나비스 사티바(Cannabis sativa) 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 화장용, 의약용 및 건강기능용 용도
본 발명은, 개괄적으로, 식물 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 화장 분야, 제약 분야 및 건강기능 분야에서의 용도, 이 추출물의 제조방법, 및 상술한 다양한 응용 분야에서의 사용을 위한 이것을 포함하는 관련된 화장용, 의약용 및 건강기능성 조성물 및 제제에 관한 것이다.
캐나비스 사티바(Cannabis sativa)는, 전통적 약에 사용되며 섬유 공급원으로 사용되는 캐나비스(Cannabis) 속에 속하는 식물이다. 이 식물은 캐나비노이드(cannabinoids), 테르펜(terpenes) 및 페놀성 화합물(phenolic compounds)을 포함하는 식물 화학 물질(phytochemicals)이 특히 풍부한 것으로 알려져 있다.
이 식물에 의해 생성되는 파이토캐나비노이드(phytocannabinoids)는 인체에서 생성되는 엔도캐나비노이드(endocannabinoids)와는 다른 화학적 구조를 갖지만, 이들은 동일한 수용체와 결합할 수 있는 능력 및 통증, 염증, 영양, 감정 및 기억과 같은 다양한 종류의 생리학적 및 병리학적 과정을 조절할 수 있는 능력을 공유한다. 현재까지, 90개가 넘는 파이토캐나비노이드가 식물에서 특징지어져 있는데, 이들 중에는 THC[테트라하이드로캐나비놀(tetrahydrocannabinol)] 및 CBN[캐나비놀(Cannabinol)]과 같이 향정신성 효과(psychotropic effects)를 갖는 것들과 CBD[캐나비디올(Cannabidiol)] 및 CBG[캐나비게롤(Cannabigerol)]과 같이 향정신성 효과가 약하거나 없는 분자들이 확인되었다.
캐나비노이드에 의해 만들어지는 효과들의 대부분이 양-의존적(dose-dependent)으로 보인다는 것 역시도 알려져 있다: 예를 들어, 적은 양에서는 감각 뉴런(sensory neurons)에 의한 뉴로펩티드(neuropeptide)[즉, CGRP(“칼시토닌 유전자 관련 펩티드(Calcitonin Gene Related Peptide)”, 칼시토닌 유전자와 관련된 펩티드)] 방출을 감소시킬 수 있는 반면, 많은 양에서는 그 방출을 활성화시킨다.
많은 양의 캐나비노이드에서, 이 펩티드는 일단 그 수용체에 결합하게 되면 전염증성(proinflammatory) 시토킨(cytokines) 및 히스타민(histamine)을 생성하게 되며, 따라서 염증을 일으키는 신호를 활성화시키게 된다. 그에 반해, 적은 양의 캐나비노이드는 펩티드 방출을 감소시킴으로써 항염증 효과를 나타낸다.
뉴런 활성(neuronal activity)에 대한 캐나비노이드의 효과는 양-의존적이라는 것 역시도 알려져 있다: 적은 양에서는 중추신경계, 운동 제어, 인지 과정 및 거동에서 중요한 역할을 하는 신경전달물질인 도파민(dopamine)의 생성을 활성화시킨다; 대신에, 많은 양에서는, 이 화합물이 뉴런 활성을 억제한다.
캐나비노이드는, 오피오이드(opioid) 수용체와 결합함으로써 진통 효과 및 행복감을 야기하는 뉴로펩티드인 엔도르핀(endorphin)의 방출을 활성화시킬 수 있기 때문에, 통증 감각을 조절할 수도 있다.
캐나비스 식물에 존재하는 다른 분자들도 중요한 생리학적 기능을 갖는다는 것 역시 알려져 있다: 플라보노이드(flavonoids)는 항산화(antioxidant), 항염증(anti-inflammatory), 항암(anti-cancer), 항비만(anti-obesity), 및 신경-보호(neuro-protective) 특성들을 갖는 반면, 테르펜(terpenes)은 강력한 항종양(anti-tumor), 항불안(anxiolytic), 진통(analgesic) 및 면역-자극(immune-stimulating) 특성들을 나타낸다.
2017년 1월 14일자로 실행된 2016년 12월 2일자 입법 법령(legislative decree) 242는 이탈리아에서의 캐나비스 경작 및 농업 산업의 공급망 촉진을 위한 법조문들을 제시하면서 64 개의 다양한 품종의 캐나비스 사티바를 합법으로 규정하였는데, 이것은 이들이 낮은 레벨(0.2% 미만)의 THC를 함유하기 때문이며, 이를 통해 반가공(semi-finished) 제품, 식료품 및 화장용 성분을 얻는 것이 가능하게 되었다.
캐나비스 사티바 식물로부터의 추출물은 다양한 목적으로 이미 사용되고 있고 특허권 설정이 이루어지고 있다.
특허 출원 WO 2017/175126은, 항노화(anti-aging), 보습(moisturizing) 및 태양 복사 차단(solar radiation protection) 특성들을 갖는, 캐나비스 사티바 식물 추출물(꽃, 줄기 또는 잎으로부터 얻은) 및 캘렌쥴라 오피시날리스(Calendula Officinalis) 꽃 추출물을 함유한 혼합물의 국소부위용(topical) 조성물을 설명하고 있다.
특허 출원 CN 105998195는, 항염증 특성을 갖고 피부 민감성을 경감시키는, 캐나비스의 잎 추출물 또는 종자유(seed oil)의 화장용 용도를 설명하고 있다.
특허 출원 WO 2010/150245는, 항염증 특성을 갖는, 캐나비스의 꽃 또는 종자의 추출물을 함유한 화장용 및/또는 제약용 조성물을 설명하고 있다.
특허 출원 CN 105943613은 캐나비스 사티바 전 추출물(whole extract)의 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환 예방 용도를 설명하고 있다.
Dvory Namdar 등에 의해 작성된 과학 기사 “Medical Cannabis for the treatment of inflammation”“Natural product Communications”vol.13, n.3, 1 March 2018)에는, 캐나비노이드(THC 및 CBD)를 함유하는 캐나비스 사티바를 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 염증성 신경 질환(inflammatory neuronal diseases)의 치료에 사용하는 것이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 추출물들의 제조는 몇 가지 문제점들이 있다.
우선, 이러한 추출물들은 변화하는 환경적 및 계절적 조건들을 겪게 되는 경작된 식물로부터 얻어지는데, 상기 환경적 및 계절적 조건들은 식물의 성장을 저해할 수 있을 뿐만 아니라 무엇보다도 이차 대사물질(secondary metabolites)의 생성에 상당한 영향을 줄 수 있기 때문에 상술한 바와 같이 상기 추출물 자체의 생물학적 특성에 직접적으로 영향을 미치는 상기 추출물 내 캐나비노이드의 가변적 함량을 결정하게 된다.
또한, 경작된 식물로부터 이 추출물들을 얻기 때문에, 식물이 성장하는 동안 노출되는 농약 및/또는 비료와 같은 독성 물질에 의해 상기 추출물이 오염될 수 있다.
더욱이, 상기 추출물들은 상기 식물에 서식하는 병원균을 함유함으로써, 최종 추출물의 질을 저하시키고, 화장용, 의약용 및 건강기능용 응용들에 적합한 최종 제품을 얻기 위해 추가적인 정제 단계를 요구할 수 있다.
마지막으로, CN 105998195 및 WO 2010150245는 면역체계의 중요한 병리 반응을 야기하며 면역계의 불안정화를 유발하고 손상된 면역력과 관련된 질환의 가능성 있는 발병을 유발하는 물질인 렉틴(lectins)이 특히 풍부한 캐나비스 종자로부터 얻어진 추출물을 설명하고 있다.
간행물 “Cannabinoids production in Cannabis sativa L.: An in vitro approach”, S. H. Farag (2014)에서는, 캘러스(callus) 배양물로부터의 체외 기관형성(organogenesis) 및 캐나비스의 세포 현탁(cell suspension), 모상근(hair root) 및 트리콤(trichome) 배양물들에서의 THC 및 다른 중요한 캐나비노이드 생성이 달성되었고, 캘러스 배양물로부터의 기관형성을 통해 완전한 식물 재생이 확립되었다.
이 간행물은 또한 상기 캐나비스 사티바 추출물의 제조방법도 설명하고 있는데, 이 방법은, 캘러스 배양물로부터 세포 현탁 배양물을 형성하는 단계, 건조 세포 현탁액을 70% 메탄올로 균질화하는 단계, 추출 용액(extracted solution)을 여과하는 단계, 및 여과된 추출 용액을 증발시키는 단계를 포함한다. 이 저자는 상기 추출물에서 캐나비노이드와 THCs를 증가시키는 방법도 설명하고는 있으나, 상기 추출물 내 다른 활성 화합물의 존재에 대해 보고하고 있지 않을 뿐만 아니라 상술한 화합물의 응용에 대해서도 보고하고 있지 않다. THCs는 8.12 및 4.45 μg/g 건조질량 수준으로 검출된 반면, 표명된 대부분의 CBD 수율은 1.5 μg/g 건조질량이었다.
본 발명의 기저를 이루는 객관적인 기술적 과제는, 치료용 및 화장용 용도에 적합하고 상술한 공지의 선행기술의 캐나비스 추출물의 문제점들이 본질적으로 없는, 이차 대사물질이 풍부한 캐나비스 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에서, 상술한 기술적 과제는, 염증, 특히 신경 염증(neuronal inflammation)의 예방 및 치료에 사용되기 위한, 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물을 제공함으로써 해결된다.
바람직하게는, 캐나비스 사티바 세포는 카르마뇰라(Carmagnola), 산티카 27(Santhica 27), 엘레타 캄파나(Eletta campana) 또는 펠리나 32(Felina 32)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종에 속하고, 가장 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속한다.
바람직하게는, 상기 추출물은 하이드로-알코올성(hydro-alcoholic) 추출물이다.
그 다른 측면에서, 본 발명은, 바람직하게는 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 더욱 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속하는 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 화장용 용도에 관한 것이기도 하다.
특히, 상기 화장용 용도는 피부 잡티(skin blemishes) 개선을 위한 것이다.
"피부(skin)"는 피부, 모발(hair) 및 손발톱(nails)을 의미한다.
바람직하게는, 이 추출물은 하이드로-알코올성 추출물이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 바람직하게는 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 더욱 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속하는 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 제조방법에 관한 것이기도 한데, 상기 제조방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 하이드로-알코올성 용액에서 상기 캐나비스 사티바 세포 배양물을 균질화시킴으로써 균질액(homogenate)을 얻는 단계;
b) 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 의해, 상기 균질액의 액체 분획(liquid fraction)으로부터 고체 분획(solid fraction)을 분리하는 단계;
c) 상기 액체 분획을 건조 상태로 만듦으로써 상기 추출물을 얻는 단계.
상술한 c) 단계에서 상기 액체 분획은 증발법(evaporation)과 냉동건조법(lyophilization) 중 어느 하나에 의해 건조 상태로 만들어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 캐나비스 사티바 세포 배양물은, 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 더욱 바람직하게는 카르마뇰라 품종의 캐나비스 사티바 식물로부터 식물성 조직(vegetable tissues)을 잘라내는 단계, 상기 조직으로부터 캘리(calli)가 고체 기재(solid substrate) 상에 형성되도록 유도하는 단계, 상기 캘리를 취하는(taking) 단계, 및 상기 캘리로 액체 세포 배양물을 만드는(setting up) 단계에 의해 얻어진다.
바람직하게는, 상술한 하이드로-알코올성 용액은 물에 10% 내지 98% v/v의 에탄올 농도를 갖는 에탄올 용액이다.
바람직하게는, 상기 하이드로-알코올성 용액의 체적과 상기 캐나비스 사티바 세포 배양물의 질량 사이의 비(ratio)는 5:1 내지 2:1이고, 유리하게는 3:1이다.
본 발명은, 상술한 제조방법에 의해 얻어진, 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 바람직하게는 카르마뇰라 품종의 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물과, 물 및 염분 수용액(saline aqueous solutions)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 친수성 용매, 또는 오일, 알코올, 글리세롤, 유기산, 아미드, 아민, 알데하이드 및 케톤으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 조성물에 관한 것이기도 하다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 상기 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터의 추출물을 상기 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.002 내지 0.01 중량%로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 염증, 특히 신경 염증, 더욱 구체적으로는 신경 세포에 의해 생성되는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)에 의해 유발되는 염증의 예방 및 치료 용도이며 도파민 및 엔도르핀과 같은 신경전달물질 및/또는 뉴로펩티드의 생성을 활성화시키는 위에서 정의된 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 조성물의 화장용 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 염증, 특히 신경 염증, 더욱 구체적으로는 신경 세포에 의해 생성되는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)에 의해 유발되는 염증의 치료에 사용되기 위한, 위에서 정의된 추출물 또는 조성물과 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle)을 포함하는 약학적 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 위에서 정의된 추출물 또는 조성물과 화장품용으로 허용 가능한 비히클을 포함하는 화장용 제제에 관한 것이다.
상기 화장용 제제는, 예를 들어, 크림, 겔, 피부에 바르는 로션, 립스틱, 파운데이션 크림 및 화장품(make-up)의 형태일 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 위에서 정의된 용도의 추출물 또는 조성물과 건강기능성 관점에서 허용 가능한 비히클을 포함하는 건강 보조제에 관한 것이다.
상기 약학적 제제 및/또는 식품 보조제는, 예를 들어, 정제(tablets), 캡슐, 드링크, 현탁액 또는 분말과 같은 경구 제제(oral preparations) 형태일 수 있다.
유리하게도, 본 출원인은, 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물, 특히 하이드로-알코올성 추출물로서, 분자 메커니즘을 통해 작용함으로써 “신경성 염증(neurogenic inflammation)”을 예방 및/또는 치료할 수 있고 도파민 및 엔도르핀과 같은 신경전달물질 및 뉴로펩티드의 생성을 활성화시킴으로써 신경세포 기능을 향상시킬 수 있는 추출물을 발견하였다.
여기서 사용되는 상기 용어 “신경성 염증”은 염증 매개체, 예를 들어 CGRP 뉴로펩티드가 구심성 뉴런(afferent neurons)으로부터 국부적으로 방출됨에 따라 유발되는 염증을 가리킨다. 특히, 상기 뉴로펩티드는 일단 방출되면 인접 세포, 예를 들어 피부 세포 및 비만 세포(mast cells)와 같은 인접 세포로부터의 전염증성 시토킨 및 히스타민 방출을 유발한다. 신경성 염증은 피부 과민증(skin hypersensitivity), 건선(psoriasis), 습진(eczema), 주사비(rosacea), 백반증(vitiligo)과 같은 다수의 피부 질환들 뿐만 아니라 편두통(migraine), 천식(asthma), 섬유근육통(fibromyalgia), 혈관운동비염(vasomotor rhinitis) 및 근긴장이상(dystonia)과 같은 그 밖의 장기 및 조직과 관련된 질환들의 발병에 중요한 역할을 한다.
이 추출물은 체외 식물 세포 배양물로부터 얻어지기 때문에 어떠한 독성 오염 물질(예를 들어, 농약 및/또는 비료) 및 환경적 병원균(environmental pathogens)도 존재하지 않으며, 세포가 제어된 실험실 조건에서 성장하기 때문에 계절적 및 환경적 조건의 변화에 영향을 받지 않는다.
이러한 조건들 덕분에, 본 발명의 또 다른 중요한 이점은 식물 추출물의 특성이 표준화될 수 있다는 것인데, 이것은, 이차 대사물질 생성이 항상 동일하고 일정하여 얻어지는 산물의 동일한 질적 특성 및 동일한 성질이 항상 보장되기 때문이다.
본 발명의 또 다른 이점은 배양 세포가 전능성(totipotent)이므로 구별되는 조직(differentiated tissue)에 존재하는 것에 비해 더욱 다양한 화합물(특히, 이차 대사물질)을 발현할 수 있고 상기 배양 세포가 실험실에서 조작될 수 있다는 것이다. 결과적으로, 세포 배양물의 물리적 처리(가시광선, UV, 열, 냉기) 또는 화학적 처리[당(sugars), 아미노산, 식물호르몬(phyto-hormones), 산화 활성을 가진 화합물]를 통해 이러한 이차 대사물질의 합성을 용이하게 조정함으로써 상기 대사물질의 생성을 제어할 수 있으며; 이렇게 얻어진 추출물은 본 발명에서 설명되는 활성을 보존하기에 충분한 양의 캐나비노이드 함량을 갖는다.
특히, 추출물이 상기 설명된 특성들을 발휘하고 CGRP 뉴로펩티드에 대한 최적의 억제 효과를 나타내는 것을 보장하기 위해서는, THC 및 CBN의 양이 추출물 건조 질량에 대해 0.1 내지 0.005 μg/g 수준인 것이 바람직하다.
마지막으로, 세포로부터 얻어진 상기 추출물은 알레르기성 또는 자극성 물질(예를 들어 다수의 식물 종자에 존재하는 렉틴과 같은)이 없으며, 개개인에게 알레르기성 반응 또는 과민성의 잠재적 위험을 야기하지 않는다.
도 1은 세포 독성 평가(cytotoxicity assay)(MTT)의 결과를 알려주는 막대 그래프를 보여주는데, 이것은 본 발명에 따른 하이드로-알코올성 추출물이 0.05%(0.5 mg/ml) 이하의 농도에서 피부 세포에 독성 효과가 없음을 나타낸다.
도 2는 신경 세포에서의 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 발현에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향을 나타내는 막대 그래프를 보여주는데; 상기 그래프의 값은 상기 추출물로 처리되지 않은 대조 세포(control cells)에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
도 3은 표피 세포에서 CGRP에 의해 유발되는 전염증성 시토킨인 IL-8 및 TNF-알파의 발현에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향을 나타내는 막대 그래프를 보여주는데; 상기 그래프에 나타낸 값은 CGRP 펩티드로 스트레스를 준 세포(100%로 임의 설정됨)에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
도 4는 대식세포(macrophages)에서 CGRP에 의해 유발되는 히스타민 생성에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향을 나타내는 막대 그래프를 보여주는데; 상기 그래프에 나타낸 값은 CGRP 펩티드가 존재하는(스트레스 조건) 대조 샘플(100%로 임의 설정됨)에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
도 5는 도파민 합성을 담당하는 효소인 타이로신 하이드록실라제(tyrosine hydroxylase)(TH)의 발현 및 신경 세포에서 도파민을 운반하는 소포성 모노아민 수송체 2(Vesicular MonoAmine Transporter 2)(VMAT2)의 발현에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향을 나타내는 막대 그래프를 보여주는데; 상기 그래프에 나타낸 값은 상기 추출물로 처리되지 않은 대조 세포(100%로 임의 설정됨)에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
도 6은 신경 세포(패널 A) 및 인간 외피 세포(human epidermis cells)(패널 B)에서 베타 엔도르핀 전구체(beta endorphin precursor)(POMC)의 발현에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향을 나타내는 막대 그래프를 보여주는데: 상기 그래프에 나타낸 값은 100%로 임의 설정된 대조 샘플에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
본 출원인은 화장 분야, 약학 분야 및 건강기능 분야에 있어서 캐나비스 사티바의 식물 세포 배양물로부터의 하이드로-알코올성 추출물에 특별한 흥미로움을 발견하였는데, 이것은, 염증, 특히 신경 세포에 의해 생성된 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)에 의해 유발되는 염증을 완화시키고 도파민 및 엔도르핀과 같은 신경전달물질의 생성을 활성화시킨다.
특히, 이 추출물은, 감각 뉴런에 의해 생성되며 각질세포(keratinocytes) 및 대식세포(macrophages)와 같은 인접 세포에 작용하여 신경성 염증 및 히스타민 생성을 유발하는 신호의 발생을 촉발하는 뉴로펩티드 CGRP의 생성을 놀랍게도 감소시킬 수 있다.
놀랍게도, 이 추출물은 상기 뉴로펩티드에 의해 표피 세포에 유발되는 IL-8 및 TNF-α와 같은 전염증성 시토킨의 생성을 감소시킬 수 있어 다음과 같은 이중 효과를 나타낸다: CGRP 신경성 펩티드 생성 억제 및 그에 의해 촉발된 염증의 치료. 또한, 이것은 신경성 펩티드에 의해 유발되는 면역계 세포에서의 히스타민 생성에 효과적으로 대처할 수 있다.
신경 세포에서, 이 추출물은, 노르에피네프린(norepinephrine)[노르아드레날린(noradrenaline)] 및 에피네프린(아드레날린)과 같은 그 밖의 중요한 신경전달물질의 전구체(precursor)인 도파민의 합성을 담당하는 효소의 발현을 활성화시킨다.
게다가, 이 추출물은 VMAT2 수송체 발현을 유발하는데, 이것은 도파민, 노르아드레날린, 아드레날린 및 세로토닌(serotonin)과 같은 몇몇 중요한 신경전달물질들을 시냅스 전 레벨(presynaptic level)에서 이들이 합성되는 세포질(cytoplasm)로부터 소포(vesicles)로 수송하는 것을 담당한다.
따라서, 본 발명에 의하면, 여기서 설명된 하이드로-알코올성 추출물은 신경계에서 핵심적 기능을 수행하는 중요한 신경전달물질의 합성 및 수송을 활성화시킬 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 추출물이 베타 엔도르핀을 포함하는 다양한 신경 호르몬 및 뉴로펩티드의 전구체인 POMC 유전자의 신경 세포 내 발현 및 인간 외피 세포 내 발현 모두를 활성화시킨다는 것이 관찰되었다. 실제로, 엔도르핀은 오피오이드(opioid) 수용체와 결합하여 인체에 진통 효과 및 행복감을 야기한다.
엔도르핀은 중추 신경계에서 주로 생성되긴 하지만, 완전 기능성(fully functional) 베타-엔도르핀/수용체 시스템은 피부 세포에도 존재하고, 본 발명에서 설명되는 추출물은 신경 세포 및 인간 외피 세포 모두에서 엔도르핀의 전구체 발현을 활성화시킬 수 있다.
화장 분야와 관련하여서는, 본 출원인은 본 발명의 추출물이 피부 잡티 개선에 특히 적합하다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
유리하게는, 아래에서 설명되는 “식물 조직 배양” 방법에 의해 얻어지는 본 발명의 세포 배양물은 제어된 확정적 방식으로 일종의 이차 대사물질을 합성할 수 있는 능력을 나타내는데, 이것은 신경 세포를 포함하는 상이한 세포 유형들에서 중요한 생리 기능을 조절할 수 있다.
고체 기재 상에 캘러스(calluses)[또는, “캘리(calli)”가 형성되도록 유도함으로써 캐나비스 사티바 엽편(leaf disks)으로부터 세포 배양물을 얻는다. 이렇게 얻어진 세포를 화합물(예를 들어, 염, 당, 아미노산, 비타민, 항산화제, 식물호르몬) 및/또는 물리적 요인[예를 들어, 가시광선, UV, 열, 냉기, 삼투성 스트레스(osmotic stress)]으로 처리될 수 있는 액체 매체 내에 준비하고 성장시킴으로써, 관심 있는 이차 대사물질의 생성을 촉진시키고 얻어지는 추출물의 생물학적 활성을 증가시킨다.
이어서, 이렇게 얻어진 배양물의 세포를 하이드로-알코올성 용액, 바람직하게는 하이드로-에탄올성 용액에서 균질화시켜 기계적으로 파열되도록 함으로써 균질액(homogenate)를 얻는다.
상기 용어 “균질화”는 식물 재료의 세분화 처리(fragmentation treatment)를 의미하는데, 이것은 미리 냉각된 막자(pestle) 및 세라믹 막자사발(ceramic mortar)과 같은 적절한 용기에서 수행되며; 더 큰 규모, 산업적 블렌더(blenders) 또는 프레스(presses)를 위해서는 강철 날이 장착된 금속 용기가 채용될 수도 있다.
이어서, 상기 균질액의 원심분리 및/또는 여과를 통해 상기 균질액을 액체 분획(liquid fraction)과 고체 분획(solid fraction)으로 분리한다. 상기 분리가 원심분리를 통해 수행되는 실시예의 경우, 상기 액체 분획은 얻어진 원심분리물의 상청액(supernatant)이다.
이어서, 로토-증발법(roto-evaporation) 및/또는 동결건조법(freeze-drying), 건조 챔버(drying chambers) 또는 스프레이 건조기(spray dryer)를 통해 상기 액체 분획으로부터 용매(에탄올 및 물)를 제거한다.
화장품용으로 허용 가능한 비히클(cosmetically acceptable vehicle), 용매, 첨가제 및/또는 보조제와 가능하면 함께 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 화장용 조성물 역시 본 발명의 목적에 포함된다. 이 조성물은 피부에 바르는 화장용 로션, 크림, 겔의 형태일 수 있다.
허용 가능한 비히클, 용매, 첨가제 및/또는 보조제와 가능하면 함께 본 발명의 추출불을 포함하는 약학적 및 건강기능성 조성물 역시 본 발명의 목적에 포함된다. 이 조성물은 정제, 캡슐, 드링크, 현탁액 또는 분말과 같은 경구형 제제 형태일 수 있다.
상기 용매는 바람직하게는 친수성 용매, 더욱 바람직하게는 물 및 염분 수용액으로부터 선택되는 친수성 용매이거나, 적어도 하나의 화장품용으로 허용 가능한 유기 용매, 더욱 바람직하게는 오일, 알코올, 글리세롤, 유기산, 아미드, 아민, 알데하이드 또는 케톤으로부터 선택되는 유기 용매이거나, 하나 이상의 타입의 용매의 조합(이들이 서로 혼합될 수 있다면)이다.
본 발명은, 신경염증의 치료 및 신경전달물질과 뉴로펩티드의 활성화를 위한 상술한 조성물의 화장용, 의약용 및 건강기능용 용도에 관한 것이기도 하다.
이 조성물은 화장용 또는 피부용 제품 제조용 제제, 응용에 적합한 약학적 또는 건강기능성 제제에 첨가될 원료에 해당한다.
본 발명의 비제한적 예로서, 캐나비스 사바타 종, 카르마뇰라 품종으로부터 유래된 식물 세포 배양물 추출물의 제조와 관련된 예들이 아래에 제시되어 있다. 또한, 본 발명에 따른 추출물의 제조예 뿐만 아니라 상술한 몇 가지 응용 분야들에서의 이 추출물의 생물학적 활성 역시도 설명된다.
실시예들
본 발명의 추출물이 캐나비스 사바타, 카르마뇰라 품종의 세포 배양물에 의해 아래에 설명된 방법에 따라 얻어졌다.
실시예 1A.
캘러스(callus) 형성 단계:
캘러스를 얻기 위하여, 캐나비스 사티바 모종(Cannabis sativa seedlings)(카르마뇰라 품종)의 잎이 사용되었다. 상기 잎을 자르고, 표면을 말아 절단하여 5mm x 5mm 크기의 조각들을 얻었다. 미오-이노시톨(myo-inositol) 500 mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2.4D) 1 mg/L, 키네틴(kinetin) 0.01 mg/L, 아데닌(adenine) 1 mg/L, 수크로오스(sucrose) 30 g/L 및 “식물 한천(plant agar)”8 g/L (Duchefa Biochemie)가 보충된 pH 5.7의 고체 기재 Gamborg B5 (Duchefa Biochemie) 상에 상기 잎 조각들을 올려 놓고, 26℃의 암 조건에서(in the dark) 성장시켰다. 약 4주 동안의 성장 후에 고체 배지(solid culture medium) 상에 첫 번째 캘러스가 얻어졌고, 이어서 이것을 번식시켰다.
액체 배양물을 만들고 성장시키는 단계
약 2cm의 크기(약 50mg의 질량)에 도달했을 때 상기 캘러스를 취하여 50 ml의 Gamborg B5 배지(한천이 없고 키네틴이 0.1 mg/L이라는 것을 제외하는 상술한 고체 배지의 조성)가 담겨 있는 150 mL 플라스크에 넣었다. 상기 플라스크를 26℃ 온도의 암 조건 하에서 120 rpm 오비탈 진동을 하는 진동기 상에 올려 놓았다. 약 4주 후에, 배양 증대 수행에 필요한 밀도에 도달하였다.
세포 채취(cell collection) 단계
저-다공성(low-porosity) 필터(20-25 마이크론)를 통해 상기 배지를 제거하고 세포를 채취하였다. 이어서, 상기 세포를 멸균 증류수로 세척하고 -20℃에서 동결시켰다.
하이드로-알코올성 추출물의 제조
캐나비스 사티바 세포(100g)를 차가운(4℃) 에탄올 96%에 3:1의 체적/질량 비[100 g의 신선 세포(fresh cells) 당 약 300 ml의 에탄올]로 현탁하고 기계적 블렌더(mechanical blender)에서 15분 동안 균질화하였다.
균질한 용해물(lysate)이 일단 얻어지면, 상기 용해물을 비이커에 남긴 상태에서 2 시간 동안 교반하였고, 이어서 4℃에서 약 15분 동안 4000g에서 원심분리하였고, 추가 잔존물을 제거하고 상청액(supernatant)을 회수하기 위해 여과하였다. 상기 여과로부터 얻어진 상청액(약 300 mL이고, 에탄올과 물로 이루어짐)을 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 진공하에서의 증발(under-vacuum evaporation)을 통해 증류시켰고, 용매 제거 후 약 2.1g의 농축 추출물(concentrated extract)를 얻었다.
생물학적 검정을 수행하기 위하여, 이렇게 얻어진 상기 추출물을 에탄올에 10% 내지 0.1% 범위의 농도로 희석시켰다.
사용 투여량(doses of use) 및 세포 독성을 규명하기 위하여 상기 추출물을 인간 세포(각질세포, HaCat)에 테스트하였다. 이어서, 뉴런, 피부 세포 및 면역계 세포에 대한 상기 추출물의 특성들을 평가하기 위하여 상기 추출물을 상이한 세포 검정들에 사용하였다.
실시예 1B:
본 발명에 따른 추출물의 대안적 제조방법은, 상기 액체 배양물이 성장하는 4주 동안 상기 캐나비스 사티바 세포가 3 μg/mL의 프롤린(proline) 존재 하에서 16 시간의 가시광선 조건과 8 시간의 암 조건의 사이클을 겪었다는 것을 제외하고는 위의 실시예 1A와 동일하다.
실시예 1A에 대해, 증가된 세포 성장률(increased cell growth) 및 가속된 바이오매스 회수(accelerated biomass recovery)가 얻어졌다.
실시예 2 - 세포 독성 평가(Cytotoxicity assay).
후속의 검정을 위해 사용될 추출물의 농도를 결정하기 위하여, 본 발명의 추출물이 세포에 유해하지 않는 농도 범위를 파악하기 위한 세포 독성 평가를 수행하였다.
이 평가는 화합물 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸일)-2,5-디페닐테트라졸륨-브로마이드][3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]의 사용에 기초한 것인데, 이것은 1983년 모스만(Mosmann)에 의해 처음으로 설명된 것이다. 이것은 바이탈 세포(vital cells)의 미토콘드리아 효소 디하이드로지나제(mitochondrial enzyme dehydrogenase)가 MTT(옅은 황색)의 테트라졸 고리(tetrazole ring)를 가수분해하여 포르마잔(formazan) 결정(짙은 청색)을 형성할 수 있는 능력에 기반한 것이다. 이 결정은 세포막에 대해 불침투성이고 대사 활성 세포(metabolically active cells)의 세포질에 축적된다. 따라서, 살아있고 건강한 세포의 개수는 생성된 포르마잔의 양에 정비례한다.
HaCat 세포를 96-웰 플레이트(96-well plates) 내에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Lonza) 배지에서 웰당 1 x 105의 초기 개수로 약 8시간 동안 성장시켰다.
0.05% 내지 0.0004%(500 μg/ml 내지 4 μg/ml)의 범위에서 추출물의 농도를 증가시키면서 상기 추출물로 세포를 처리한 후 PBS에서 세척하였고 웰당 100 μl의 “반응용 완충액(reaction buffer)”으로 인큐베이팅하였는데, 상기 반응용 완충액은 pH 7.4에서 PBS 완충액 내에 10 mM의 Hepes, 1.3 mM의 CaCl2, 1 mM의 MgSO4, 5mM의 글루코오스(glucose) 및 0.5 mg/ml의 비색 기질 MTT(colorimetric substrate MTT)를 함유하였다. 37℃에서 5%의 CO2로 3 시간 동안 인큐베이팅한 후에 100 μl의 가용화 용액(solubilizing solution)을 각 웰에 첨가하였는데, 상기 가용화 용액은 무수 이소프로판올(absolute isopropanol)에 10%의 Triton X-100과 0.1N의 HCl을 함유하였다. 2 시간 후에, 비색 반응(colorimetric reaction)을 Victor3 플레이트 판독기로 595 nm에서 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 추출물은 모든 사용된 농도에서 세포에 대해 독성 효과가 없었다.
실시예 3 - 캐나비스 사티바 추출물 내 캐나비노이드 함량 분석
캐나비스 사티바 추출물 내 캐나비노이드 함량을 파악하기 위하여, 기체 크로마토그래피-질량분석법(gas chromatography-mass spectrometry)(GC/MS)에 의한 화학적 분석을 수행하였다. GC/MS는 상이한 타입의 매트릭스에서 다양한 유기 물질을 확인하고 정량하는 것을 가능케 하는 분석 기법이다. Federico II University of Naples의 화학 과학부에서 수행된 화학적 분석을 통해, 건조 추출물의 약 1 mg/100g(0.01 μg/g) 농도로 캐나비디올(CBN)과 Δ-테트라하이드로캐나비디올(Δ-THC)이 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 법정 한도 내의 값이며, 본 발명의 추출 대상물의 특성 및 효과를 분명히 나타낸다.
실시예 4 - 신경 세포에서의 뉴로펩티드 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 발현 분석
신경 세포 내 뉴로펩티드 CGRP 발현을 분석하기 위해, 반정량적 RT-PCR[“역전사 효소-중합 효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)”실험이 그 발현을 측정하기 위해 수행되었다. 신경아세포종 세포(neuroblastoma cells)(SHSY5Y)를 6-웰 플레이트(6-well plates) 내에서 10% FBS로 보충된 DMEM 배지(Lonza)에서 웰당 15 x 104의 초기 개수로 16 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 상기 세포를 2개의 서로 다른 농도의 캐나비스 사티바 추출물(0.002% 및 0.01% w/v)로 6 시간 동안 처리하였다.
이어서, 상기 세포를 채취하고, Sigma로부터 구입한 키트(GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kit)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 오염 유전자 DNA를 제거하기 위해 상기 RNA 샘플을 DNase I(Ambion)으로 처리하였다. “로딩 다이(loading dye)”[물 내에 0.25%의 브로모페놀 블루(bromophenol blue); 0.25%의 크실렌 시아놀 FF(xylene cyanol FF); 40%의 수크로오스(sucrose)]의 존재 하에, 2 μl의 각 샘플을 1% 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩하고, 참조로서 RNA특이성 마커(Riboruler RNA ladder, Fermentas)를 이용하여 정량하였다. 정량을 위해, Gene tools software(Perkin Elmer)를 사용하였다. 역전사 효소(enzyme Reverse Transcriptase)(Fermentas)를 이용하여 총 RNA의 300 ng을 역전사하였다.
6:4 비율의 18S pair/competimer 다용도 프라이머 쌍(universal primer pair)(Ambion)을 내부 표준(internal standard)으로 이용하여 반정량적 RT-PCR 반응을 수행하였다. PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔에 분리하였고, Geliance instrument(Perkin Elmer)를 이용하여 가시화하였으며, Genetools software를 이용하여 농도계(densitometer)로 분석하였다.
도 2의 그래프에 나타난 값들은 분석된 유전자와 관련된 밴드의 강도와 참조 기준 18S와 관련된 밴드의 강도 사이의 비율을 나타내는데, 이것은, 값이 그 유전자의 실제 발현과 관련되도록 하고 그 샘플에 존재하는 RNA 또는 PCR 시약의 양에 좌우되지 않도록 하기 위함이다.
CGRP 증폭(amplification)용 특이 프라이머(primer)의 염기서열은 다음과 같았다:
hs CGRP b for2: GCAGGTGTGGTGTTCATCCC (Seq. Id. No. 1)
hs CGRP b rev2: GGGCATTCTCACCAAGTTCT (Seq. Id. No. 2)
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물에 의한 처리는, 사용된 두 농도들 모두에서, CGRP 유전자 발현을 현저히 감소시켰는데; 특히, 가장 낮은 농도(0.002%)에서 약 65%의 유전자 발현 감소를 가져왔다.
실시예 5 - 피부 세포에서 뉴런 펩티드 CGRP에 의해 유발되는 염증을 감소시키는 캐나비스 사티바 추출물의 능력에 대한 연구
본 발명에 따른 식물 세포 배양물의 추출물이 신경성 펩티드에 의해 유발되는 피부 세포의 염증을 감소시킬 수 있는 지를 파악하기 위하여, CGRP 뉴로펩티드로 처리된 인간 각질세포에서 전염증성 시토킨인 IL-8 및 TNFα의 발현을 평가하기 위해 RT-PCR(“역전사 효소-중합 효소 연쇄 반응”) 실험을 수행하였다.
인간 각질 세포(HaCat)를 웰당 15 x 104의 초기 개수로 6-웰 플레이트(6-well plates) 내에서 10% FBS로 보충된 DMEM 배지(Lonza)에서 16 시간 동안 성장시켰다.
이어서, 상기 세포를 2개의 서로 다른 농도의 캐나비스 사티바 추출물(0.002% 및 0.01% w/v)로 16 시간 동안 처리한 후, 전염증성 시토킨인 IL-8 및 TNFα 발현을 각각 측정하기 위해, CGRP 펩티드(1 nM)의 존재에 의해 유발되는 염증성 스트레스를 1 시간 및 6 시간 동안 겪게 하였다. 이어서, 상기 세포를 채취하였고, 추출된 RNA를 역전사하였으며, 4:6(IL-8용) 및 2:8(TNFα 용) 비율의 다용도 프라이머 쌍인 18S/competimer(Ambion)을 내부 표준으로 이용하여 이전 실시예에서 설명한 바와 같이 반정량적 RT-PCR을 통해 분석하였다. PCR 생성물을 이전 실시예에서 이미 설명한 바와 같이 아가로오스 겔에서 분석하였다.
증폭 특이성 프라이머의 염기서열은 다음과 같았다:
hs IL-8 for: GCCACCGGAGCACTCCATAA (Seq. Id. No. 3)
hs IL-8 rev: CT CTT CAAAAACTT CTCCACAACC (Seq. Id. No. 4)
hs TNFα for: ATGAGCACT GAAAGCAT GATCC (Seq. Id. No. 5)
hs TNFα rev: TCATACCAGGGCTTGGCCTCA (Seq. Id. No. 6)
도 3에 나타난 바와 같이, 1 nM의 CGRP로 처리한 경우 염증으로 이끄는 생물학적 이벤트의 캐스케이드(cascade)가 촉발됨으로써, 미처리 대조 세포에 비해 두 종류 시토킨 모두의 발현 증가가 유발되었다.
특히, 상기 뉴로펩티드에 노출되기 전 캐나비스 사티바 추출물로 16 시간 동안 처리된 각질세포는 음성 대조 샘플(상기 펩티드에 노출되었으나 본 발명의 추출물로 처리되지는 않은)에 비해 두 종류의 전염증성 시토킨 모두의 발현 감소를 나타냈다: 상기 추출물은 테스트된 두 개의 사용량 모두에서 그리고 분석된 두 종류의 시토킨 모두에 대해서 감소를 가져왔다; 특히, 더 적은 사용량은 IL-8의 발현에 있어 약 25%의 감소를 야기하였고 TNFα에 있어서는 약 50%의 감소를 야기하였다. 상기 펩티드에 노출되었지만 항염증성 특성으로 알려져 있는 합성 화합물인 TO901317로 미리 사전-처리된 양성 대조 샘플에서도 유사한 효과가 얻어졌다.
실시예 6 - 히스타민 함량 측정
본 발명에 따른 식물 세포 배양물의 추출물이 CGRP 펩티드에 의해 면역계 세포에서 유발되는 히스타민의 생성을 감소시킬 수 있는 지를 파악하기 위하여, CGRP 뉴로펩티드에 의한 스트레스 조건을 겪은 대식세포(macrophages)에서의 히스타민 함량을 정량하기 위한 분석을 실시하였다.
RAW 264.7 세포들을 15 x 104의 초기 개수로 96-웰 플레이트에 접종하였고, 16 시간 후에, 상기 세포들을 상이한 양의 상기 추출물로 처리하거나 항히스타민 화합물인 세티리진 디하이드로클로라이드(cetirizine dihydrochloride)(50 μg/ml)로 처리하였는데, 후자는 실험의 양성 대조군으로 이용되었다. 상기 추출물 또는 세티리진으로 처리하고 2 시간 후에 10 nM의 CGRP로 처리하여 히스타민 생성을 유도하였고, 16 시간 후에 0.4 M의 NaOH 및 1 mg/ml의 o-프탈디알데하이드(o-Phthaldialdehyde)(OPT)를 함유한 100 μl의 메탄올을 첨가함으로써 히스타민 함량을 측정하였다. 상온에서 10 분 동안 인큐베이팅한 후에, 반응을 정지시키기 위해 각 웰에 50 μl의 0.1 M HCl을 첨가하였다. 멀티-플레이트 판독기인 Victor3(Perkin Elmer)로부터의 360 nm 여기 파장(excitation wavelength)을 이용하여 443 nm에서 형광(fluorescence)을 측정하였다. 히스타민 함량은, 10 nM CGRP로 스트레스가 가해진 대조 세포의 값(100%로 임의 설정됨)에 대한 퍼센티지로 산출되었다.
얻어진 결과는, 본 발명의 추출물을 이용한 세포 처리가, 두 농도들 모두에서, 세티리진 경우에 발생한 것과 유사하게 대식세포에서의 히스타민 생성을 상당히 감소시켰음을 보여주었다(도 4).
실시예 7 - 도파민 합성을 담당하는 효소인 타이로신 하이드록실라제(Tyrosine hydroxylase)(TH) 및 신경 세포에서 도파민을 수송하는 VMAT2의 발현 연구
합성에 수반되는 유전자의 발현 및 신경 세포에서의 도파민 수송에 대한 본 발명에 따른 추출물의 조절 능력을 분석하기 위하여, RT-PCR 실험(“역전사 효소-중합 효소 연쇄 반응”)을 수행함으로써 TH 및 VMAT2의 발현을 평가하였다.
신경아세포종 세포(neuroblastoma cells)(SHSY5Y)를 실시예 4에서 상술한 바와 같이 처리하였고, 아래의 특이 증폭 프라이머들을 이용하여 두 개 유전자들의 발현에 대해 분석하였다.
hs TH for 2: ACTGCAGCCCCAGCTGCATCCTA (Seq. Id. No. 7)
hs TH rev: AGGTGATGACACTTGTCCAG (Seq. Id. No. 8)
hs VMAT2 for: GAAGCTCATCCTGTTCATCG (Seq. Id. No. 9)
hs VMAT2 rev: ATCAGCAGGAAGGCATAGCT (Seq. Id. No. 10)
도 5에 나타난 바와 같이, 추출물 처리가, 사용된 두 농도 모두에서, 분석된 상기 유전자들의 발현을 상당히 활발하게 하였다; 특히, 더 높은 농도(0.01%)에서 TH 및 VMAT2 유전자 각각에 대해 약 50% 및 70%로 유전자 발현이 유도되었다.
실시예 8 - 신경 세포 및 인간 외피 세포에서의 베타 엔도르핀 전구체(POMC) 발현에 미치는 캐나비스 사티바 추출물의 영향 분석
신경 세포 및 인간 외피 세포에서의 베타 엔도르핀 전구체(POMC) 발현에 대한 본 발명의 추출물의 조절 능력을 분석하기 위하여, RT-PCR 실험(“역전사 효소-중합 효소 연쇄 반응”)을 수행함으로써 그 발현을 평가하였다.
신경아세포종 세포(SHSY5Y) 및 일차 인간 각질세포(primary human keratinocytes)(NHEK)를 실시예 4에서 상술한 바와 같이 처리하였고, 아래의 특이 증폭 프라이머들을 이용하여 POMC의 발현에 대해 분석하였다.
hs POMC for 2: GGCAAGCGCTCCTACTCCAT (Seq. Id. No. 11)
hs POMC rev 2: TCACTCGCCCTTCTTGTAGG (Seq. Id. No. 12)
도 6A 및 6B에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물을 이용한 처리가, 두 농도 모두에서, 신경 세포(6A) 및 일차 인간 각질세포(6B)에서의 POMC 발현을 상당히 활발하게 하였다: 특히, 가장 낮은 농도(0.002%)에서 신경 세포 및 각질세포 모두에 있어 약 75%로 발현이 유도되었다.
<110> Arterra Bioscience S.P.A. <120> Cosmetic, pharmaceutical and nutraceutical use of an extract derived from Cannabis sativa cell cultures <130> ATR004BWO <150> IT102018000020590 <151> 2018-12-20 <160> 12 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 1 gcaggtgtgg tgttcatccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 2 gggcattctc accaagttct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 3 gccaccggag cactccataa 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 4 ctcttcaaaa acttctccac aacc 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 5 atgagcactg aaagcatgat cc 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 6 tcataccagg gcttggcctc a 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 7 actgcagccc cagctgcatc cta 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 8 aggtgatgac acttgtccag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 9 gaagctcatc ctgttcatcg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 10 atcagcagga aggcatagct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 11 ggcaagcgct cctactccat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> None <400> 12 tcactcgccc ttcttgtagg 20

Claims (16)

  1. 염증, 특히 신경 염증의 예방 및 치료에 사용되기 위한, 캐나비스 사티바(Cannabis sativa) 세포 배양물로부터 유래된 추출물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 캐나비스 사티바 세포는 카르마뇰라(Carmagnola), 산티카 27(Santhica 27), 엘레타 캄파나(Eletta campana) 또는 펠리나 32(Felina 32)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속하는,
    추출물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 추출물은 하이드로-알코올성(hydro-alcoholic) 추출물인,
    추출물.
  4. 바람직하게는 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 더욱 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속하는 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물, 바람직하게는 하이드로-알코올성 추출물의 화장용 용도.
  5. 제4항에 있어서,
    피부 잡티(skin blemishes) 개선을 위한,
    화장용 용도.
  6. 바람직하게는 카르마뇰라, 산티카 27, 엘레타 캄파나 또는 펠리나 32로 구성된 그룹으로부터 선택되는 품종, 더욱 바람직하게는 카르마뇰라 품종에 속하는 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물의 제조방법에 있어서,
    a) 하이드로-알코올성 용액에서 상기 세포 배양물을 균질화시킴으로써 균질액(homogenate)을 얻는 단계;
    b) 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 의해, 상기 균질액의 액체 분획(liquid fraction)으로부터 고체 분획(solid fraction)을 분리하는 단계;
    c) 상기 액체 분획을 건조 상태로 만듦으로써 상기 추출물을 얻는 단계
    를 포함하는,
    제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 상기 액체 분획은 증발법(evaporation)과 냉동건조법(lyophilization) 중 어느 하나에 의해 건조 상태로 만들어지는,
    제조방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 캐나비스 사티바 세포 배양물은, 캐나비스 사티바 식물로부터 식물성 조직(vegetable tissues)을 잘라내는 단계, 상기 조직으로부터 캘리(calli)가 고체 기재(solid substrate) 상에 형성되도록 유도하는 단계, 상기 캘리를 취하는(taking) 단계, 및 상기 캘리로 액체 세포 배양물을 만드는(setting up) 단계에 의해 얻어지는,
    제조방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드로-알코올성 용액은 물에 10% 내지 98% v/v의 에탄올 농도를 갖는 에탄올 용액인,
    제조방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드로-알코올성 용액의 체적과 상기 캐나비스 사티바 세포 배양물의 질량 사이의 비(ratio)는 5:1 내지 2:1, 바람직하게는 3:1인,
    제조방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 얻어진 캐나비스 사티바 세포 배양물로부터 유래된 추출물과,
    물 및 염분 수용액(saline aqueous solutions)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 친수성 용매, 또는 오일, 알코올, 글리세롤, 유기산, 아미드, 아민, 알데하이드 및 케톤으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 유기 용매
    를 포함하는,
    조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    염증, 특히 신경 염증의 예방 및 치료에 사용되기 위한,
    조성물.
  13. 제11항에 따른 상기 조성물의 화장용 용도.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 추출물 또는 제12항에 따른 조성물과,
    약학적으로 허용 가능한 비히클(pharmaceutically acceptable vehicle)
    을 포함하는,
    약학적 제제.
  15. 제4항에 따른 추출물 또는 제13항에 따른 조성물과,
    화장품용으로 허용 가능한 비히클(cosmetically acceptable vehicle)
    을 포함하는,
    화장용 제제.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 추출물 또는 제12항에 따른 조성물과,
    기능식품용으로 허용 가능한 비히클(nutraceutically acceptable vehicle)
    을 포함하는,
    건강 보조제.
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