CN106102757B

CN106102757B - 极香蓍草中抗神经炎和保护性化合物

Info

Publication number: CN106102757B
Application number: CN201480074124.2A
Authority: CN
Inventors: 安塔·艾尔曼; 瑞佛卡·奥菲尔; 约尔·凯许曼
Original assignee: Agricultural Research Organization of Israel Ministry of Agriculture
Current assignee: Agricultural Research Organization of Israel Ministry of Agriculture
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: IL245597B; DK3074029T3; US11752125B2; US20170020842A1; WO2015079390A1; EP3074029A4; CN106102757A; IL245597A0; EP3074029A1; EP3074029B1

Abstract

本发明涉及一种3,5,4'‑三羟基‑6,7,3'‑三甲氧基黄酮(TIF)及蓍内酯A用于预防或治疗阿兹海默症以及其他神经退化性疾病，如帕金森氏症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、局部缺血、免疫缺陷病毒‑1(HIV‑1)相关性痴呆、路易体相关性失智症、创伤性脑损伤(TBI)、神经胶质瘤、青光眼和癫痫、杭廷顿氏病、多发性硬化症，青光眼和精神分裂症，其中神经炎症、氧化压力、麸氨酸毒性和β类淀粉蛋白的毒性是病理生理机制的一部分。

Description

极香蓍草中抗神经炎和保护性化合物

技术领域

本发明涉及神经退化性病症的领域。

背景技术

随着西方世界人口寿命的提高，导致神经退化性病变频率随着升高，如阿兹海默症和帕金森氏症。这些疾病有多方的发病机制，并且，其中大多数大规模神经元细胞死亡的发生是由于不受控制的神经炎性反应以及氧化压力的结果。这些过程在各种神经退化性疾病的发生和发展扮演关键作用，并涉及脑中两种主要细胞类型的活化-星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞可产生发炎前细胞激素(如TNF-α)和细胞毒性剂，导致疾病过程的僵化。

神经炎症、氧化压力、麸氨酸毒性和β类淀粉蛋白的毒性涉及阿兹海默症和其他神经退化性病症的发病机制。

发明内容

依据本发明，发明人从沙漠植物极香蓍草(Achillea fragrantissima，Af)中纯化出两种化合物：(1)一抗神经炎且一保护性化合物，通过光谱方法确定为倍半萜内酯蓍内酯A(AcA)。AcA对小神经胶质细胞和脾淋巴细胞展现了抗发炎效果，并且保护性的作用在遭受氧化压力的细胞上。AcA通过干扰细胞传导信号亦保护培养的星形胶质细胞及神经元避免被诱导至细胞死亡。AcA也保护培养的神经元避免受到β类淀粉蛋白和麸氨酸的毒性诱导造成细胞死亡。

(2)一保护性化合物，通过光谱方法确定为3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)。TTF在小神经胶质细胞展现抗发炎作用，在星形胶质细胞展现抗氧化效果，并在遭受氧化压力的细胞上保护其活性。TTF通过干扰细胞传导信号亦保护培养的星形胶质细胞及神经元避免被诱导至细胞死亡。

并无证据显示TTF出现在Af的萃取物中，即使所述萃取物呈现了生物活性。在任何生物系统中，TTF的效果在过去并未被证实，这是描述抗氧化剂、抗发炎剂以及所述化合物展现抗氧化压力、抗β类淀粉蛋白和抗麸氨酸的毒性的保护效果在神经退化性病变研究上的首次公开。这也是证明TTF干扰细胞信号事件的首次研究。

本发明涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)，用于治疗患有或易感染一神经退化性病症的一哺乳动物。

更涉及本发明上述的组合物中，所述神经退化性病症包括神经元死亡。

更涉及本发明上述的组合物中，所述神经退化性病症选自阿兹海默症、帕金森氏症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、局部缺血、免疫缺陷病毒-1(HIV-1)相关性痴呆、路易体相关性失智症、创伤性脑损伤(TBI)、神经胶质瘤、青光眼和癫痫。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用于神经性发炎可被改善或预防的疾病。

更涉及本发明上述的组合物中，所述作用为抑制一选自于由细胞激素IL-6及细胞激素IL-Ιβ组成的群组的细胞激素的分泌。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用于一选自于由神经氧化压力和星状细胞氧化压力组成的群组的病症可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用位于脑部的氧化压力的病症可被改善或预防的疾病。

更涉及本发明上述的组合物中，所述作用更包括抑制一选自于由细胞外讯息调节激酶(ERK 1/2)、促分裂原活化蛋白激酶(MEK1)、应力活化蛋白激酶/c-Jun N端蛋白质激酶(SAPK/JNK)以及环磷酸腺苷反应组件结合蛋白(CREB)组成的群组的因子的磷酸化。

更涉及本发明上述的组合物中，所述作用为减少活性氧簇(ROS)的含量。

更涉及前段本发明上述的组合物中，所述活性氧簇被过氧化氢、β类淀粉蛋白和麸氨酸诱发。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响麸胺酸毒性可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响β类淀粉蛋白毒性可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响小胶质细胞活化可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一神经退化性病症的一哺乳动物。

更涉及前段本发明上述的组合物中，所述神经退化性病症选自帕金森氏症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、局部缺血、免疫缺陷病毒-1(HIV-1)相关性痴呆、路易体相关性失智症、创伤性脑损伤(TBI)、神经胶质瘤、精神分裂症、杭廷顿氏病、多发性硬化症、青光眼和癫痫。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用于神经性发炎可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用于一选自于由神经氧化压力和星状细胞氧化压力组成的群组的病症可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过作用位于脑部的氧化压力的病症可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响麸胺酸毒性可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响β类淀粉蛋白毒性可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过影响小胶质细胞活化可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过增加星状胶质细胞中的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的含量可被改善或预防的疾病。

本发明更涉及一种组合物，包括：蓍内酯A(AcA)，用于治疗患有或易感染一疾病的一哺乳动物，其中所述疾病是指通过减少由多个免疫细胞分泌的一细胞激素的含量可被改善或预防的疾病。

更涉及前述本发明上述的组合物中，所述组合物以药物、食品、药用食品、食品添加物或饮品的形式存在。

附图说明

本发明的部分实施例将在下文中描述，仅作为例示性的，并参考附图及图式。更详细地具体参考附图及图式说明，强调的是本发明的特征会通过例示和说明性讨论的方式达到叙明本发明细节的目的，本发明实施例的附图及图式说明并非用以限制本发明。

图1为3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)对于小神经胶质细胞存活率的效果；

图2A-2C为TTF对于星形胶质细胞的保护避免过氧化氢诱导细胞死亡；

图3A-3C为TTF抑制星形胶质细胞的过氧化氢诱导SAPK/JNK、ERK 1/2及MEK1的磷酸化；

图4为TTF对于在星形胶质细胞的CREB的过氧化氢提高磷酸化的作用；

图5A-5C为TTF在星形胶质细胞中降低过氧化氢诱发的活性氧簇含量升高；

图6为TTF的过氧化氢清除能力，相较于美金刚胺和槲皮素；

图7为TTF的2,2-二苯基-1-苦基苯肼自由基清除能力，相较于美金刚胺和槲皮素；

图8A-8C为星形胶质细胞中TTF降低由2,2'-偶氮二(脒基丙烷)产生的过氧自由基含量；

图9A-9C为TTF降低在脂多醣体体活化的星形胶质细胞中IL-1β和IL-6的分泌；

图10A-10B为TTF预防β-类淀粉蛋白_25-35诱导的神经元细胞死亡；

图11为TTF预防β-类淀粉蛋白_25-35诱导的活性氧簇提高

图12A-12B为TTF下调β-类淀粉蛋白_25-35诱导的MEK1在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响MEK1的总量；

图13为TTF下调β-类淀粉蛋白_25-35诱导的SAPK/JNK在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响SAPK/JNK的总量；

图14为TTF下调β-类淀粉蛋白_25-35诱导的ERK 1/2在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响ERK 1/2的总量；

图15A-15B为TTF下调β-类淀粉蛋白_25-35诱导的CREB在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响CREB的总量；

图16为TTF预防麸胺酸诱发的神经元细胞死亡；

图17为TTF预防麸胺酸诱发的活性氧簇(ROS)含量升高；

图18为TTF预防硝普钠(SNP)诱发的活性氧簇(ROS)含量升高；

图19为TTF下调硝普钠(SNP)诱发的ERK 1/2在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响ERK 1/2的总量；

图20为TTF下调硝普钠(SNP)诱发的MEK1在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响MEK1的总量；

图21为通过蓍内酯A从活化的小神经胶质细胞下调麸胺酸分泌；

图22A-22B为通过对应不同浓度的蓍内酯A活化的小神经胶质细胞抑制一氧化氮的产生并降低细胞毒性；

图23为蓍内酯A下调MMP-9活性及在活化的小神经胶质细胞的转录；

图24为蓍内酯A降低COX-2、iNOS、IL-Ιβ、IL-Ιβ及肿瘤坏死因子α的转录，及降低IL-Ιβ在脂多醣体体活化的星形胶质细胞中的分泌；

图25为蓍内酯A抑制小神经胶质细胞中过氧自由基-诱导氧化的DCFH；

图26为蓍内酯A对2,2-二苯基-1-苦基苯肼自由基清除能力；

图27A-27C为蓍内酯A(AcA)预防β-类淀粉蛋白_25-35诱导的神经元细胞死亡以及活性氧簇(ROS)含量升高；

图28为蓍内酯A(AcA)下调β-类淀粉蛋白_25-35诱发的SAPK/JNK在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响SAPK/JNK的总量；

图29为蓍内酯A(AcA)下调β-类淀粉蛋白_25-35诱发的ERK1/2在N2a神经元细胞的磷酸化，不影响ERK 1/2的总量；

图30为AcA作用于β-类淀粉蛋白_25-35诱发的MEK1在N2a神经元细胞的磷酸化的效果；

图31为蓍内酯A预防N2a神经元细胞免于麸胺酸诱发的细胞死亡；

图32为蓍内酯A避免麸胺酸诱发的神经元细胞死亡；

图33为蓍内酯A避免麸胺酸诱发的神经元细胞死亡；

图34为蓍内酯A避免N2a细胞中麸胺酸诱发的活性氧簇(ROS)量升高；

图35为蓍内酯A避免N2a神经元细胞中麸胺酸诱发的活性氧簇(ROS)量升高；

图36为AcA下调β-类淀粉蛋白_25-35诱发的CREB在N2a神经元细胞的磷酸化；

图37A-37B为蓍内酯A保护星形胶质细胞免于过氧化氢诱发的细胞死亡；

图38为AcA的过氧化氢清除能力；

图39A-39B为蓍内酯A降低星形胶质细胞内过氧化氢诱发的活性氧簇产生；

图40A-40D为蓍内酯A下调MEK 1、ERK 1/2、SAPK/JNK及p38在星形胶质细胞内的过氧化氢诱发的磷酸化，不影响上述蛋白质的总量；

图41为施予蓍内酯A增加GDNF在初级星形胶质细胞的含量；

图42A-42F为蓍内酯A下调细胞激素在原生小鼠脂多醣体体活化的脾淋巴细胞的分泌；

图43为美金刚胺在星形胶质细胞内对于ERK 1/2的过氧化氢诱发的磷酸化的抑制作用；

图44为美金刚胺在星形胶质细胞内对于MEK 1的过氧化氢诱发的磷酸化的抑制作用；

图45为美金刚胺对于β-类淀粉蛋白_25-35诱发的ERK 1/2在N2a神经元细胞的磷酸化并无作用；

图46为美金刚胺下调N2a神经元细胞中SAPK/JNK的β-类淀粉蛋白_25-35诱发的磷酸化；以及

图47为美金刚胺下调N2a神经元细胞中MEK 1的β-类淀粉蛋白_25-35诱发的磷酸化，不影响MEK 1的总量。

具体实施方式

在本发明中，发明人已经从极香蓍草fragrantissima(AJ)通过光谱学方法测定的活性化合物进行纯化，得到一个命名3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)。在TTF化合物的结构显示在式I中：

式I

在神经胶质细胞的初代培养物，TTF抑制促炎细胞因子(IL-6)和IL-1β的脂多醣体引起的分泌。TTF也经由干扰细胞信号的传送保护星形胶质细胞(抑制SAPK/JNK、ERK 1/2、MEK1和CREB的磷酸化)，并通过减少氧化压力诱导细胞内ROS含量诱导的细胞死亡。TTF保护神经细胞避免β类淀粉蛋白_25-35和麸氨酸的毒性。TTF干扰β类淀粉蛋白-诱导的细胞信号转导事件(抑制SAPK/JNK，ERK 1/2，MEK1和磷酸化的CREB)和降低了β类淀粉蛋白_25-35和麸氨酸诱导的细胞内活性氧(ROS)的含量。因此，本发明涉及转录因子在预防或治疗神经变性疾病如阿兹海默氏病、帕金森氏病和肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症，以及其它神经变性疾病，其中氧化压力、麸氨酸盐和β类淀粉蛋白_25-35毒性是病理生理学的一部分。

抗神经炎化合物蓍内酯A由极香蓍草纯化而得。所纯化的抗神经炎分子由ID和2D的NMR数据被认为是从蓍草纯化而得的蓍内酯A：C₁₇H₂₀O₆。MWt为320，8DBEs，分子结构提出在式II。

式II

在小胶质细胞原代培养，蓍内酯A抑制促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-IP)和肿瘤坏死因子(TNF-α)和炎性酶环氧合酶-2(COX-2)的脂多醣引起的表现，诱导一氧化氮合酶(iNOS)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，和从活化的小神经胶质细胞下调一氧化氮(NO)和麸氨酸分泌。所述抑制性活动不是任何细胞毒性作用的结果。蓍内酯A也抑制炎性细胞因子从激活的脾细胞诱导分泌。蓍内酯A也诱导的脑星形胶质细胞的原代培养神经胶质源性神经营养因子(GDNF)的表现，以及从氧化压力诱导细胞死亡来保护这些细胞。蓍内酯A也可防止脑星形胶质细胞的原代培养的过氧化氢诱导ROS含量，和避免在这些细胞中的MEK1，ERK1/2，p38和SAPK/JNK的过氧化氢诱导磷酸化。研究表明，神经元细胞显示蓍内酯A在纳摩尔浓度下可避免Aβ_25-35诱导的细胞毒性作用、Aβ_25-35诱导的ROS升高以及Aβ_25-35诱导的SAPK/JNK，ERK1/2磷酸化。

在下文中概述的TTF和AcA的几个因素影响是本发明的一个主要部分。氧化压力已经成为各种神经病理疾病，包括缺血性中风、创伤性脑损伤(TBI)、抑郁症、精神分裂症、ALS、青光眼、癫痫症、多发性硬化症、亨廷顿氏病、阿兹海默氏病和帕金森氏的病因学的主要机制疾病。氧化压力诱导的活性氧(ROS)，是一种主要炎性肠病(IBD)相关肿瘤的主因。根据传染病杂志-2003.5.1；卷187(9)：1411-5，在细菌性脑膜炎试验上，基质金属蛋白酶(MMPs)和活性氧(ROS)造成脑损伤。MMP-9在细菌性脑膜炎期间随着脑损伤会增加脑脊髓液(CSF)，其为一个相关联的结果。在细菌性脑膜炎的实验，基质金属蛋白酶(MMPs)和活性氧(ROS)造成脑损伤。MMP-9在细菌性脑膜炎期间随着脑损伤会增加脑脊髓液(CSF)，其为一个相关联的结果。在细菌性脑膜炎，基质金属蛋白酶(MMPs)和活性氧(ROS)这两者都是产生作为宿主的细菌的免疫反应的一部分并造成脑损伤，MMP-9以未活化形式(proMMP-9)释放，必须进行处理以使其具有生物活性。在未活化MMP-9中的催化锌分子由一个半胱氨酸残基(即，半胱氨酸开关)立体受阻于前结构域。未活化MMP-9的活化发生在当前结构域被其他蛋白酶切割或当半胱氨酸开关被破坏。在活性氧的生理浓度可能发生中断，作为半胱氨酸硫醇基团氧化的结果。MMP-9和ROS都已经显示参与了血脑屏障破裂，并且在细菌性脑膜炎造成脑损伤。

IL-6是主要由单核细胞、巨噬细胞和活化的T细胞产生的多功能细胞因子。虽然IL-6已在多种疾病中表现，包括肾小球性肾炎、多发性骨髓瘤、类风湿性关节炎和心粘液瘤的发病机制中涉及，IL-6主要在溃疡性结肠炎和炎症样品的克隆氏病标中被检测。血清IL-6含量与对改善疾病状况的疾病状态含量降低相关，并且当肠发炎消退后返回到对照含量。此外，在结肠炎相关癌症，IL-6在早期肿瘤发生通过增强正常和癌前肠上皮细胞的增殖和存活过程中扮演重要肿瘤启动因子。

已知的是活性氧引起的IL-1β的释放和活性氧作为第二信使的信号传导驱动炎性活化。IL-1β的活化是ROS-诱导的(科学期刊，2008；320(5876)，674-7；纳特免疫学期刊，2009；10(3)：241-7)。在正反馈循环，IL-1β促进细胞内ROS的积累。此外，ROS的抑制物产生会抑制IL-1β的分泌(公共科学图书2012；7(9)：e45186)。

麸氨酸诱发的兴奋毒性已牵涉许多神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏病，缺血性中风的病因。ROS挑起麸氨酸联氧化压力在这些疾病的发病机理的关键作用。

β类淀粉蛋白_25-35诱导的ERK1/2、MEK1、SAPK/JNK和CREB的磷酸化。CREB是在神经系统中一个突出的转录因子，对应于刺激的多样化并激活目标基因的转录，包括氧化压力。它也众所周知，过氧化氢(H₂O₂)诱导的ERK1/2、MEK1、SAPK/JNK和CREB进行磷酸化。

本发明的化合物也可以在亨廷顿病(HD)施用。氧化损伤起着HD发病中的重要作用(亨廷顿氏病中线粒体功能障碍、代谢障碍并增加氧化压力，陈，长庚医学杂志，201134(2)：135-52)，以及(抗氧化剂在亨廷顿氏病，Johri A，生物化学和生物物理学报，2012，1822(5)：664-74)。

在本发明中所用的缩写如下：

Αβ-β类淀粉蛋白；ABAP-2,2'-偶氮二(脒基丙烷)；ACA-蓍内酯A；Af-极香蓍草；CAA-细胞抗氧化活性；CNS-中枢神经系统；COSY-相关光谱法；CREB-环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白；DCF-DA-2'7'-＝二氯荧光素双乙酸钠；DPPH-2,2-二苯基-1-三硝基苯肼；ERK-细胞外信号调节激酶；GDNF-胶质细胞源性神经营养因子；H₂O₂-过氧化氢；HMBC-异核多键相关质谱；HSQC-异核单量子相关光谱；MAPK-丝裂原活化的蛋白激酶；MEK-丝裂原活化蛋白激酶激酶；NMR-核磁共振；ROS-活性氧簇；SAPK/JNK-应激活化蛋白激酶/C-JunN-末端激酶；TTF-3,5,4'三羟基6,7,3'-三甲氧基黄酮；COX-2-环氧合酶-2；IL-2/6/10/12-白细胞介素2/6/10/12；IL-Ιβ-白细胞介素Ιβ；α-α；β-β；iNOS-诱导型一氧化氮合酶；LPS-脂多醣体；MMP-9-基质金属蛋白酶-9；NO-一氧化氮；SL-倍半萜内酯；TNF-α-肿瘤坏死因子-α；SNP-硝普钠；INF-干扰素γ。

在本发明中，发明人已经纯化并评估了3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮TTF的有效性，用于抵消培养的星形胶质细胞的氧化性损伤。发明人发现，TTF保护星形胶质细胞免于过氧化氢-诱导的细胞及减毒ROS的细胞内积累，随着以过氧化氢或ABAP治疗。

有趣的是，虽然槲皮素，将其用作对照黄酮，具有自由基和过氧化氢清除能力，其对于星形胶质细胞的保护作用比TTF的显着少。这些观察强调细胞信号干扰事件为TTF的保护机构的一部分的重要性。

在细胞抗氧化剂活性(CAA)测定中，细胞摄取及/或膜与自由基清除活性的组合的结合效率由减少ROS含量的测试化合物的效力决定。在细胞抗氧剂测定的结果表示，TTF(或其代谢产物)能够穿透细胞膜，并与活性氧在细胞内反应。因此，应进一步研究的TTF，其特点是相对低极性和低分子量(分子量为360.3)，可能穿越血脑屏障，如其他类黄酮影响脑功能的结果。

根据本发明提出的结果，TTF抗氧化压力的最大保护活性较美金刚胺更高。此外，尽管美金刚胺可以清除过氧化氢和自由基，，TTF有清除自由基的能力。相对于美金刚胺，TTF具有互补能力。

一些在本发明中使用的化学用品和试剂的被指定为：

Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)；Leibovitz-15培养基；谷氨酰胺；抗生素(10,000单位/mL青霉素和10,000微克/mL链霉素)；大豆胰蛋白酶抑制剂；胎牛血清(FBS)和Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)(无钙和镁)，从生物工业公司(贝特Ilaemek，以色列)购得；2-巯基乙醇；结晶紫；2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)；槲皮素(3,3'，4'，5,7-五羟基)，美金刚胺；以及2'7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)，购自Sigma化学公司(圣刘易斯，密苏里州，美国)。2,2'-偶氮二(脒基丙烷)(ABAP)溶液，购自Wako化学公司(里士满，弗吉尼亚)。二甲基亚砜(DMSO)，从APPLICHEM公司(达姆施塔特，德国)购得；和从MP Biomedicals公司购得的(俄亥俄州，美国)过氧化氢(H₂0₂)。

植物材料：

极香蓍草在阿拉瓦谷被收集保留，并认证为阿拉瓦裂谷植物采集的一部分；VPC(死海阿拉瓦科学中心，中央阿拉瓦科，以色列，代码AVPC0040)。

萃取和分离：

日晒/冷冻干燥的极香蓍草(1公斤)均质化并用石油醚提取(3×500毫升，24小时)，接着用乙酸乙酯(3×500毫升，24小时)萃取。后者蒸发溶剂后的残余的胶状物层析，在SephadexLH-20管柱层析，用甲醇/二氯甲烷(1：1)洗脱。萃取物包含TTF，根据TLC板的级分，再次色谱分离，两次在Sephadex LH-20管柱层析和硅胶，使用己烷随乙酸乙酯比例做为冲洗液。TTF在己烷中被40％乙酸乙酯的洗脱。用Bruker傅里叶变换向量22红外光谱仪(FTIR)得到红外线光谱(IR)。¹H及¹³C的NMR光谱被记录在Bruker Avance-500光谱仪。相关光谱(COSY)、异核单量子相干谱(HSQC)和异核多键相关谱(HMBC)实验使用标准布鲁克的脉冲序列记录。高分辨率电喷雾质谱法(HRESIMS)、运行时间(TOF)的测量被使用在仪器水微SYNAPT HDMS质谱仪。

化合物(分子量为360.3)由质子和碳NMR测定和主要2D NMR实验是3,5,4'三羟基6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)。纯分子的结构于式I提出。

神经胶质细胞的初代培养的制备：

所描述的星形胶质细胞原代培养，准备从1-2岁按日期新生的Wistar大鼠大脑皮质(Elmann等人，2011B)。十四天的成熟星形细胞在实验中使用。这项研究是按照NIH指南和实验动物使用进行，并由沃尔卡尼中心的机构动物护理和使用委员会、农业研究组织(IL-135/07，批准日期零七年十一月四日)所批准。所有努力都用以减少动物的痛苦，并减少所用动物的数量。

细胞存活率的测定：

星形细胞在24孔的聚-D-赖氨酸涂覆的塑料板重新涂敷，以密度1x 10⁵/孔，在DMEM中含/不含2％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/毫升青霉素，以及100微克/毫升链霉素。过氧化氢在TTF的存在或不存在，并将使用根据制造商的instmctions商用比色测定法(罗氏应用科学，德国)测定细胞生存力。此测定基于乳酸脱氢酶(LDH)活性的从损伤细胞的胞液释放到培养介质中的测量。吸亮度在酶标仪492nm处测定。细胞毒性的百分比根据下列方程，这里的“A_Triton-x处理细胞”是在细胞中最大释放的LDH的计算值：

在细胞的抗氧化活性(CAA)测定中，细胞存活率通过结晶紫测定法的改进法(Kueng等人，1989)如下。在细胞治疗结束后，固定细胞用5％(V/V)的甲醛(在PBS中)150μL的为在室温下15分钟。板用浸没在去离子水洗涤，干燥和染色15分钟用1％结晶紫溶液150微升。后结晶紫溶液小心吸液用的去离子水的板，以及之前用33％的含水冰醋酸溶液150的结合染料的溶解干燥。板的光学密度在微板分光亮度计540RRM(具有690nm参考波长的滤光器)进行测定。

细胞内ROS含量评估：

使用非荧光细胞渗透化合物2'7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)检测到细胞内ROS含量。DCF-DA是通过细胞内酯酶水解，然后通过活性氧氧化成荧光化合物2'-7'-DCF。星形胶质细胞涂敷于24孔板(300,000细胞/孔)并在37℃下30分钟以DCF-DA(20μΜ)处理。之后以DCF-DA培养，培养物用PBS洗涤两次，然后再悬浮在含有10％FBS，8.4毫米的HEPES，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，和100微克/毫升链霉素的DMEM中。ROS含量(荧光)在零时间与在485nm激发和发射在520nm板读取器测定。星形胶质细胞，然后用TTF处理2小时，随后添加过氧化氢和ROS含量(荧光)与在485nm激发和发射的板读取器测量在每一小时520毫微米4小时。ROS含量的百分比按照下述公式(其中F是荧光)计算值：

类黄酮TTF的细胞抗氧化活性(CAA)：

使用非荧光细胞化合物2'7'-二氯二乙酸酯(DCF-DA)检测到细胞内ROS的产生。DCF-DA是通过细胞内酯酶水解，然后通过活性氧氧化成荧光化合物2'-7'-DCF。过氧自由基通过在生理温度热分解2,2'-偶氮二(脒基丙烷)(ABAP)产生。ABAP的分解在37℃时约在1.36xl0^-6s^-1至多产生1×10¹²自由基/毫升/秒(Bowry和Stocker，1993；Niki等人，1986；Thomas等人，1997)。星形胶质细胞(300,000细胞/孔)在DMEM中含有2％FBS、8.4毫莫耳的HEPES、2mM谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100微克/毫升链霉素的24孔板被涂敷。为了测量TTF由ABAP产生过氧自由基进入细胞并防止二氯(DCF)的形成的能力，细胞培养用TTF 1小时。然后将细胞用的DCF-DA 30分钟，用PBS洗涤两次，和ABAP(0.6毫终浓度)预加载，然后加入。荧光，这表明ROS含量，在与在485nm激发和发射在520nm读板器测定。

星形胶质细胞治疗：

细胞的原始培养基吸出并加入新鲜培养基到所述细胞中。首先在DMSO中稀释TTF，然后在生长培养基中从之前储存液取得为了每个实验新鲜制备并立即使用。DMSO在培养基中的最终浓度为0.2％。稀释在生长培养基的过氧化氢从之前储备的30％溶液新鲜配制，为了每个实验并立即使用。重复进行每个处理。

对全部和磷酸化SAPK/JNK、全部的和磷酸化的ERK(磷酸化p44/42MAPK)，全部的和磷酸化MEK 1以及全部的和磷酸化的CREB进行酶联免疫吸附测定(ELISA)：

星形胶质细胞中加入过氧化氢前与TTF处理2小时。细胞根据制造商的方案在由PathScan夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)提供的裂解缓冲液加入后裂解40分钟。细胞裂解物的蛋白质浓度通过Bradford试剂(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，CA)，测定和等量的蛋白质进行ELISA。为了测量在星形胶质细胞的细胞裂解物中全部的和磷酸化的SAPK/JNK的量，酶联免疫吸附用的是PathScan的总SAPK/JNK夹心ELISA试剂盒(CellSignaling Technology公司)和PathScan的磷酸化SAPK/JNK，根据制造商的方案进行(thr183/Tyr185)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。为了测量在星形胶质细胞的细胞裂解物中全部的和磷酸化的ERK 1/2(即磷酸化p44/42MAPK)的量，根据制造商的方案进行，酶联免疫吸附用的是PathScan的全部的p44/42MAPK(ERK 1/2)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)和PathScan的磷酸化p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)的夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。为了测量在星形胶质细胞的细胞裂解物中全部的和磷酸化的MEK1的量，根据生产商的方案进行，酶联免疫吸附用的是PathScan总的MEK1夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)和PathScan磷酸的MEK1(Ser217上/221)的夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。为了测量在星形胶质细胞的细胞裂解物全部的和磷酸化CREB的量，ELISA法根据使用PathScan总CREB夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)和PathScan磷酸CREB(Serl33)夹心ELISA试剂盒(生产商的方案进行分别为细胞信号技术)。光学密度用酶标仪在450nm测定。

DPPH法测定自由基清除活性：

抗氧化活性是使用DPPH(2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl)自由基清除测定法测量。不同稀释度TTF(或控制药物)用铝箔包裹的试管中加入1毫升的DPPH(3.9毫克/100毫升甲醇)。

吸亮度(A)在黑暗中培养后8分钟在517纳米测定。样品的清除能力(％)计算为(A控制组–A样品)/A控制组×100)。

过氧化氢清除活性的测定：

过氧化氢的清除通过鲁赫等人于致癌期刊，1989年六月；10(6)：1003-8的方法测定的，使用1mM过氧化氢代替4Mm的过氧化氢。过氧化氢的1mM的溶液在PBS中制备并用不同浓度的TTF、槲皮素或美金刚胺的混合物一起培养。吸亮度(A230)是对含TTF、槲皮素或美金刚胺在PBS没有过氧化氢的空白解决方案的分光亮度计10分钟以后确定的。

数据分析：

统计分析采用单向ANOVA，然后通过使用供微软窗口系统使用的GraphPadInStat3-克莱默多重比较检验(GraphPad软件，圣地亚哥，CA，USA)进行。

结果：

TTF保护星形胶质细胞避免过氧化氢诱导的细胞死亡：

为了表征TTF防止过氧化氢诱导的细胞死亡的星形细胞的能力，本发明人评估使用其中氧化压力诱导通过加入过氧化氢的初级星形细胞培养物模型中的细胞活力的变化。在实验中使用的过氧化氢的浓度(175-200μΜ)类似于在缺血性病症(Hyslop等人，1995)下大鼠纹状体的浓度。正常原代星形胶质在过氧化氢的曝光导致在20小时暴露后的时间和星形胶质细胞的浓度依赖性死亡(Elmann等，2011B)。由于具有TTF的星形胶质细胞的预培养被发现是用于对过氧化氢的细胞毒性的保护作用的先决条件(图2A)，星形胶质细胞用不同浓度的所述分子进行预培养，并确定所需的保护作用TTF的最佳浓度。以下预培养-加入过氧化氢溶液，并测定20小时后用LDH测定细胞毒性。结果表示，TTF表现出针对过氧化氢诱导的细胞死亡有保护作用，并且是完全有效(92％保护)在8μΜ(图2B)。应当注意的是，在所有测试浓度下，类黄酮本身的细胞毒性对于星形细胞非常低(<11％)，为由LDH法(图2C)来确定，作为阳性对照。本发明人已经使用了类黄酮槲皮素，一公知的抗氧化剂，这是在原代星形细胞研究，并发现是无毒的高达100μΜ(诺内斯等人，2012)。槲皮素相较于TTF显着不太有效(P<0.01)，并在10μΜ只有提供36％的保护(图2B)。进行了TTF保护活性比较。以美金刚胺-其被用作用于阿茨海默症的治疗药物。在TTF(8μΜ)最大有效浓度中，美金刚胺相较于TTF(即提供92％的保护)，仅提供58％的保护(图2B)，显着不太有效(P<0.005)。然而，在1μΜ(所测试的最低浓度)，美金刚胺针对过氧化氢毒性提供48％的保护，相较于相似浓度的TTF(24％保护)和槲皮素更有效。这些结果表明，在低浓度(1UM)，美金刚胺似乎比TTF和槲皮素更加有效；然而，其效果达到平稳，并在8μΜ(有效剂量的TTF)，美金刚胺相较于TTF不太有效。

以TTF治疗星形胶质细胞抑制SAPK/JNK，MEK和ERK1/2的过氧化氢诱导磷酸化：

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是第二信使的一个家族，对应于范围广泛的刺激传达从细胞表面到细胞核的信号，包括压力。过氧化氢被报导会刺激MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)和应激活化的蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(SAPK/JNK)在原代培养的星形胶质细胞中的活性(图尼埃等人，1997)。此外，抗氧化剂已被证明用以衰减MAPK信号的激活，这表明MAPK信号传导途径是ROS(Mantena和Katiyar，2006)的一个目标。因此，发明人试图确定TTF对过氧化氢诱导的细胞死亡的保护作用是否通过过氧化氢诱导SAPK/JNK及MEK1及/或ERK 1/2磷酸化的抑制介导的。如在上述的保护实验中，星形胶质细胞，用其暴露于过氧化氢之前，不同浓度的TTF进行2小时预处理。用过氧化氢处理的星形胶质细胞的显着增加SAPK/JNK、MEK1和ERK 1/2的磷酸化，如用特异性ELISA试剂盒(图3)来确定。TTF抑制星形胶质细胞达80％的过氧化氢诱导SAPK/JNK的磷酸化，而不影响细胞(图3A)SAPK/JNK的总量。TTF也抑制了27％的MEK1(图3B)和ERK 1/2(图3C)，分别为30％的过氧化氢诱导磷酸化，而不影响在细胞中的这些蛋白质总量。发明仁认为在氧化压力下脑星形胶质细胞TTF的保护作用可能部分归因于SAPK/JNK、MEK1和ERK 1/2磷酸化的抑制。

以TTF治疗星形胶质细胞抑制转录因子CREB的过氧化氢诱导型磷酸化：

过氧化氢被示出调节在哺乳动物细胞转录因子的活性和诱导星形胶质细胞中环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(CREB)的磷酸化。CREB是在神经系统中的一个突出的转录因子，响应于刺激的多样化激活靶基因的转录，包括氧化压力。因此这是确定TTF对星形胶质细胞的CREB磷酸化氧化压力下的效果。为了这个目的，如在上述的先前的实验中，星形胶质细胞，用其暴露于过氧化氢之前，不同浓度的TTF进行2小时预处理。并如在图4中可以看出，CREB是响应于过氧化氢强烈磷酸化，和TTF抑制的过氧化氢诱导的星形胶质细胞的CREB的磷酸化，而不会影响在细胞中CREB的总量(图4)。在TTF的保护作用和CREB磷酸的抑制之间的相关性的光，发明人认为CREB磷酸化的抑制是参与TTF对过氧化氢诱导的星形细胞的细胞死亡的保护作用。

TTF抑制过氧化氢诱导产生的ROS：

过氧化氢诱导细胞死亡随着增加的ROS含量。因此本发明人提出的是，除了在信号事件的干扰，TTF可以保护星形胶质细胞免于过氧化氢诱导的细胞死亡，通过由过氧化氢诱导的ROS产生。为了评估ROS在细胞内的含量，星形胶质细胞预设星形胶质细胞的活性氧指标DCF-DA并在应用过氧化氢之前预先用不同浓度的TTF处理。ROS形成是由荧光检查每个小时4小时确定。如在图5A中所示，星形胶质细胞中过氧化氢诱导产生ROS，活性氧的最高含量在1小时后产生。为了测试以TTF治疗的星形胶质细胞是否影响诱导ROS含量，并确定在哪些时间TTF最佳可改善过氧化氢诱导ROS含量，将细胞用TTF(8UM)与TTF预培养2小时或1小时，与过氧化氢和TTF共处理，或以TTF后处理(2小时或1小时)。结果显示TTF抑制过氧化氢诱导细胞内ROS升高，并且当添加过氧化氢至星形胶质细胞之前2小时施加，TTF是更有效地衰减ROS含量(图5B)。发明人比较了TTF和槲皮素和美金刚胺的效果。在相同的实验条件下，作为细胞毒性和信号传递实验进行。如在图5C中可以看出，TTF在降低过氧化氢诱导的活性氧比美金刚胺更高效果，在其浓度高于16μΜ时，TTF与槲皮素与美金刚胺之间减少过氧化氢诱导活性氧的能力没有显着差异(p>0.05)。

TTF的过氧化氢清除活性:

为了确定TTF对过氧化氢细胞毒性的保护作用是否可能是由TTF清除过氧化氢的结果，对TTF清除过氧化氢的能力进行了测定，并进行了比较槲皮素和美金刚胺的清除能力。本发明为清除过氧化氢，所述化合物用1mM过氧化氢溶液培养10分钟，其中，过氧化氢浓度通过在吸收波长230nm运行的吸亮度分光亮度计测定。在图6中呈现的结果表示，在TTF(8μΜ)的保护浓度，而对照黄酮槲皮素清除的过氧化氢为57％，TTF只有清除7％的过氧化氢(图6)。在较高浓度(最多32μΜ)槲皮素的清除能力被提高到88％，而TTF的清除能力没有增加超出7％。因此，TTF的保护效果不能只归咎于过氧化氢清除。图6也表明美金刚胺并没有对任何过氧化氢清除能力。

TTF的自由基清除活性：

前面的实验的结果表明，TTF保护脑星形胶质细胞免受氧化压力(图2)，并抑制了过氧化氢诱导产生ROS(图5)。这些影响可能不是由于过氧化氢的直接清除(图6)，但可能与TTF的自由基清除能力有关。为了测试这种可能性，TTF的自由基清除活性，在自由体外系统使用2,2-二苯基-1-pieryhydrazyl(DPPH)基团来确定。在测定中，TTF被发现是一种自由基清除剂，具一IC 50值在45μΜ，517纳米波长，有60％DPPH的抑制率(图7)。和美金刚胺相比，TTF是一个更好的自由基清除剂，美金刚胺只有7％的抑制，并且美金刚胺具有比槲皮素-其用作黄酮对照(90％抑制)较低的清除活性。因此，似乎TTF的保护作用可能部分是其自由基清除能力，而非其过氧化氢清除的能力。

TTF减少星形胶质细胞中2,2'-偶氮二(ainidinopropanc)产生过氧自由基由的含量：

TTF可能是由在细胞表面破坏过氧自由基链反应引发其抗氧化作用，或通过穿透细胞与ROS在细胞内反应。为了在这些可能性之间进行区分，发明人使用一细胞抗氧化活性试验以测定TTF，防止由ABAP细胞内产生的由过氧自由基细胞内形成DCF的能力。星形细胞与ABAP预培养，其会在细胞内产生过氧自由基。星形胶质细胞中于细胞内通过过氧自由基从ABAP产生形成DCF的动力学显示在图8A中。如图(图8A，B)中所示，ABAP产生的自由基与TTF细胞的时间依赖性和治疗缓和在活性氧引起的荧光的增加。应当注意的是，细胞存活率在此实验系统(图8C)的影响。在所测试槲皮素所有浓度，将其用作对照黄酮，是如在星形胶质细胞降低细胞内ROS含量的TTF同样有效(P>0.05；图8B)。

在一个实施方案中，利用TTF作为用于预防或治疗脑损伤和神经变性疾病，其中氧化压力和星形胶质细胞的细胞死亡中起重要作用的药物。

在另一个实施方案中，在小神经胶质细胞的原代培养，TTF抑制促炎细胞因子白细胞介素白细胞介素6(TL-6)和IL-1β的脂多醣体引起分泌。

根据本发明，TTF明显抑制经LPS诱发IL-6和IL-Ιβ从小神经胶质细胞(图9A-C和图1)的分泌无显着的细胞毒性作用(图22B)。

TTF对培养的神经元细胞的作用：

本发明的一实施方案是β类淀粉蛋白_25-35(Aβ_25-35)诱导神经元细胞死亡。发明人已研究TTF的对神经元生存力在与细胞毒性多肽β类淀粉蛋白_25-35(Αβ2535)细胞的治疗效果。神经元细胞与β类淀粉蛋白_25-35的处理引起的细胞毒性如由LDH法(图10A)和通过结晶紫染色(图10B)测量。如在图10显示，TTF在纳摩尔浓度防止细胞的毒性作用。

本发明的另一个实施例涉及β类淀粉蛋白_25-35-诱导的活性氧(ROS)升高。发明人接着检视TTF对β类淀粉蛋白_25-35诱导ROS含量的影响。神经元细胞与β类淀粉蛋白_25-35的处理导致ROS含量升高，并用TTF处理防止ROS含量升高(图11)。

本发明的另一个实施例涉及β类淀粉蛋白_25-35-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白质的诱导磷酸化。发明人还检视了TTF对于诱导的讯号传递途径的效果。在图12-14中可以看出，以β类淀粉蛋白_25-35处理神经元细胞会导致有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK1)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和应激活化的蛋白激酶/Jun-氨基末端激酶(SAPK/JNK)的磷酸化。图12-14也显示，TTF显着抑制β类淀粉蛋白_25-35诱导中的N2a神经细胞中的这些蛋白的磷酸化，而不会影响各个这些蛋白质的总量。因此，TTF上的N2a细胞的保护作用可能部分归因于这些蛋白质属于有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的β类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化的抑制。

本发明的另一个实施例是环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(CREB)的β类淀粉蛋白_25-35诱导磷酸化。发明人检视了TFT对于环化单磷酸腺苷酸反应组件结合蛋白(CREB)的β类淀粉蛋白_25-35诱导磷酸化的效果。如图15中可以看出，以β类淀粉蛋白_25-35处理神经元细胞造成CREB的磷酸化，TTF显着抑制N2a神经元细胞的CREB的β类淀粉蛋白_25-35诱导磷酸化，而不会影响所述蛋白质的总量。因此，TTF的N2a细胞的保护作用可能部分归因于所述转录因子的β类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化的抑制。

本发明的另一个实施例是指麸氨酸诱导的神经细胞死亡。发明人检视TTF对麸氨酸细胞处理下的神经元生存能力的效果。作为由LDH法(图16)测得的麸氨酸神经元细胞的处理引起的细胞毒性。如在图16表明，TTF在纳摩尔浓度防止细胞毒性作用。

本发明的另一个实施例涉及麸氨酸诱导的活性氧(ROS)升高。发明人检视TTF对麸氨酸诱导ROS含量的影响。神经元细胞因麸氨酸的处理导致ROS含量升高，并用TTF处理防止ROS含量升高(图17)。

本发明的另一个实施例涉及SNP-诱导的活性氧(ROS)升高。神经元细胞与SNP的处理导致ROS含量升高，并用TTF处理衰减神经元细胞中ROS含量(图18)。

本发明的另一个实施例是指SNP诱导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白质的磷酸化。发明人还检视了TTF对硝普钠(SNP)诱导的铉号传递路径的效果。如在图19-20中可以看出，以SNP处理神经元细胞会导致有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK1)和细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化。图19-20也表示，TTF显着抑制SNP中的N2a神经细胞中的上述蛋白诱导的磷酸化，而不会影响各这些蛋白质的总量。

蓍内酯A：

本发明发明人已经从Af分离出名为蓍内酯A的倍半萜内酯。蓍内酯A的效果尚未在任何先前生物系统被研究。此外，关于上小神经胶质细胞的倍半萜内酯的影响仅有很少的证据，以及所述研究皆使用BV2细胞系，而非如本发明中使用初级小胶质细胞进行研究。结果表明，蓍内酯A和美金刚胺的最大效果是相似的，尽管美金刚胺是在较低浓度下有效，阿茨海默氏病的患者通常以单独的美金刚胺或乙酰胆碱酯酶抑制剂和美金刚胺的组合处理直到病程晚期。因此，联合用药也可能会为蓍内酯A的作品是否会达成其在人类临床试验的要求。

抗氧化剂的细胞内测定的结果表示，蓍内酯A可穿透细胞膜，并与那些细胞内部的活性氧反应。这一观察与蓍内酯A(分子量320)的相对低分子量相结合，支持蓍内酯A也可能穿过血脑屏障和有利地影响大脑功能的假说。

在所述发明测试的发炎介质在神经退行性疾病的治疗目标已经成为公认的标的物，具体抑制剂和相关的基因可能防止脑病变的各种型号脑损伤的策略。因此，像蓍内酯A可以减少小胶质细胞激活并能保护免受氧化压力的脑细胞可能成为治疗神经退行性疾病的潜在工具的物质。

虽然蓍内酯A的抗炎作用的分子机制还需要进一步的研究，结果表明，

蓍内酯A值得潜在的进一步评估待开发作为用于脑损伤和神经变性疾病的预防或治疗的药物，其中发炎症和氧化压力是病理生理学的一部分。

蓍内酯A下调小胶质细胞的活化：

根据本发明，蓍内酯A显着抑制LPS引起亚硝酸盐积累(图22A)，不产生显着的细胞毒性作用(图22B)。蓍内酯A的抑制作用相较于抗炎药地塞米松的抑制作用，以及相较于美金刚胺-其被用作用于阿尔茨海默氏病的治疗。在低浓度时，美金刚胺抑制一氧化氮分泌比蓍内酯A更有效，然而，在最高浓度测试(40μΜ)，蓍内酯A和美金刚胺均同样有效(分别为66％和64％的抑制)，并且抑制活性以及他们之间的毒性没有显着差异(P>0.05)。在所有浓度下测试，地塞米松较美金刚胺和蓍内酯A更有效的以90％抑制由活化产生的细胞一氧化氮(图22A)。

当由促炎性刺激物激活，小神经胶质细胞实质分泌麸氨酸。后果可能从正常神经传递兴奋性毒性到在附近的神经元造成干扰。以LPS处理小胶质细胞治疗是已知会从胶质细胞增加麸氨酸分泌。倍半萜对小胶质细胞分泌麸氨酸的影响是前所未有的研究。因此，为了测试蓍内酯A是否影响麸氨酸从小神经胶质细胞中释放，LPS分别加入到含有或不含有蓍内酯A的细胞的培养基中，以LPS刺激细胞导致了麸氨酸盐增加2.6倍的分泌。蓍内酯A抑制80％含量的麸氨酸诱导分泌，而用作对照药物的地塞米松，抑制了90％含量的麸氨酸诱导分泌(图21)。

MMPs的病理活化，特别是MMP-9，已经显示出导致许多有害结果，包括血-脑屏障(BBB)的阻断、出血、神经细胞凋亡和脑损伤。本发明检视蓍内酯A对LPS活化的小神经胶质细胞中的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的效果。LPS分别加入到含有或不含有蓍内酯A的细胞的培养基中，并且培养基将细胞在24小时后收集。MMP-9除了降解变性胶原(明胶)为胶原，MMP-9的活性用明胶酶谱分析测定的。如图23A所示，未刺激的小神经胶质细胞的MMP-9活性是非常低的。然而，用LPS刺激细胞导致与对照细胞相比，MMP-9活性的显着增加，并且所述活性明显由蓍内酯A(图23A)抑制。抑制效果可能是抑制MMP-9的转录的结果，过定量实时PCR(图23B)表示。作为使用细胞生存力的结晶紫测定法没有观察到细胞死亡结果不是毒性的抑制作用(图23C)。

蓍内酯A也衰减LPS-诱导的转录因子和发炎酵素。在未刺激的小神经胶质细胞，只有少量诱导的一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)、和白介素1β(IL-Ιβ)可能被检测到。用LPS刺激细胞导致这些转录因子的含量相比于对照组细胞显着增加。这些发炎介质的诱导含量被蓍内酯A显着抑制(图24A)。蓍内酯A对IL-Ιβ含量的抑制作用是通过从LPS活化的小神经胶质细胞分泌的IL-Ιβ蛋白的含量验证测定。如图24B所示，蓍内酯A从活化细胞抑制59％IL-Ιβ的分泌，地塞米松抑制85％细胞因子的分泌。

为了测量蓍内酯A防止2,2'-偶氮二(脒基丙烷)(ABAP)产生过氧自由基穿透细胞膜，并防止DCF的形成的能力，使用了细胞抗氧化活性测定。在试验中，细胞摄取的效率，与化合物的自由基清除活性组合决定在降低细胞内自由基的含量的试验化合物的效力。DCFH通过从ABAP产生过氧自由基的动力学在小神经胶质细胞氧化进行了研究，结果于图25呈现。如图所示，ABAP以时间依赖的方式生成自由基，以蓍内酯A处理细胞(5 4％抑制)控制活性氧(ROS)的诱导荧光的增加。作为对照药物发明人已经测试了地塞米松对由ABAP产生ROS含量的作用。图25显示地塞米松更有效(在纳摩尔浓度75％的抑制)并高于蓍内酯A。蓍内酯A清除自由基的能力是在细胞系统使用2,2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)被确定的。在测定中，蓍内酯A被发现在IC₅₀值与45μΜ和60％时是一种自由基清除剂并具有最大清除能力(图26)槲皮素被用作清除自由基的能力(90％清除活性)的阳性对照。

试剂：

Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)；RPMI-1640(含有或不含酚红)；Leibovitz-15培养基；谷氨酰胺；抗生素(10,000单位/毫升青霉素和10000皮克/毫升链霉素)；大豆胰蛋白酶抑制剂；牛胎血清(FBS)和Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)(没有钙和镁)，从生物工业公司(贝特Haemek，以色列)购得；自Cayman化学获得Griess试剂和COX-2的多克隆抗体，ML，美国；iNOS的多克隆抗体，从ABD Serotec公司获得；牛体，英国购买；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体是从杰克逊免疫研究实验室公司在美国巴尔的摩获得；单克隆小鼠抗β-肌动蛋白由MP Biomedicals，俄亥俄，美国购得；脂多醣体{大肠杆菌0127A：8)；2-巯基乙醇，L-NMMA(N^G-甲基-L-精氨酸乙酸盐)，2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH)；美金刚胺(大于等于98％，GC)；地塞米松(大于等于98％，HPLC)；槲皮素(大于等于98％，HPLC)；明胶和结晶紫购自Sigma化学公司(圣刘易斯，USA购买)。下列试剂盒被用于化验的基因表达：RNeasy试剂加Mini试剂盒(Qiagen公司，德国希尔登)，Thermo ScientificVerso的cDNA序列(Thermo Fisher Scientific公司)，TaqMan基因表达测定法。

植物材料：

蓍内酯A的萃取：

极香蓍草干燥地上部分(Af)(37克)被匀化，并用乙酸乙酯(EA；3x100mL)萃取。蒸发得到棕色胶状物(2.5克)，将其以Sephdex LH-20(2.5厘米×30厘米)层析，并以石油醚/二氯甲烷/甲醇(2：1：1)，300毫升；分10次各30毫升洗脱。洗脱液含有蓍内酯A(TLC、硅石，以EA/石油醚1：1洗脱中R_f0.5)，合并并蒸发(在真空下旋转蒸发器)，得到粗蓍内酯A-290毫克。通过在硅胶上真空液相色谱(VLC)，后者再被色谱分离(2厘米×5厘米柱)用极性递增的石油醚EA(乙酸乙酯百分比为5％在时间升高)25毫升的洗脱液洗脱15次。得到蓍内酯A(90毫克)，用从溶剂的蒸发得到的30％的EA洗脱。从石油醚/丙酮混合物(体积比制备)两次结晶，得到纯的(98％)蓍内酯A(40毫克)，通过NMR，根据熔点及光学活性测定纯分子结构，提出在式II。

胶质细胞原代培养的制备：

如所描述，从1-2日龄新生大鼠大脑皮质制备原代大鼠小胶质细胞的培养物。小神经胶质细胞接种于24孔塑料板中，以1x10⁵/孔于RPMI-1640中，包含2％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/毫升链霉素、100微克/毫升青霉素、1mM丙酮酸钠和50μΜβ巯基乙醇。细胞治疗之前36小时培养。这项研究是在根据M IL升指南护理和使用实验动物进行，并批准了沃尔卡尼中心的机构动物护理和使用委员会，农业研究组织(IL-135/07，批准日期04.1 1.07)。所有作出了努力，以减少动物的痛苦，并减少所用动物的数量。

实时定量PCR分析：

RNA通过RNeasy试剂加Mini试剂盒(Qiagen公司，德国希尔登)根据制造商的指示萃取。基因组DNA通过使用50个单位不含RNA酶的DNasel以及使用Thermo ScientificVerso的试剂盒(赛默飞世尔科技公司)的在37℃下1小时从RNA样品中移除按照制造商的方案转换为cDNA。将cDNA与TaqMan化学(Applied Biosystems公司)的大鼠MMP9、TNF-α、IL1β、iNOS、COX2预先设计的TaqMan基因表达测定的TaqMan化学仪(Applied Biosystems)来自Applied Biosystems(分别为Rn00579162_ml，Rn00562055_ml，Rn00580432_ml，Rn00561646_ml，Rn01483828_ml，)定量实时PCR扩增。定量实时PCR是根据“依照需求分析”引子(Applied Biosystems)的流程进行。所有三个技术重复进行的结果相对A-微管蛋白(Rn01532518.gl)和GAPDH(Rn01775763.gl)标准化，使用比较方法分别表示计算出的相对表达比(相对量，RQ)，并根据由ABI PRISM 7700序列检测系统(使用1.6版本软件)的数据创建。

亚硝酸盐定量：

对于NO的测量，1χ10⁵小胶质细胞/孔接种在24孔组织培养板。细胞用LPS刺激(4.5微克/毫升)，并伴随有蓍内酯A或参照药物治疗。在培养基中NO含量以Griess试剂估计。

在条件培养基中麸氨酸含量的测量：

麸氨酸测量，3.5×10⁴细胞/孔接种在24孔组织培养板。于DMEM含有10％FBS培养24小时后，将细胞用LPS(100微克/毫升)刺激及不同浓度的蓍内酯A处理，并与收集20小时后的条件培养基进行测试，根据制造商的说明使用比色酶麸氨酸含量测定试剂盒(麸氨酸测定试剂盒，BioVision的，CA，USA)。

在条件培养基IL-1β含量的测定：

对于IL-1β测量，3.5×10⁴细胞/孔接种在24孔组织培养板。在DMEM含有10％FBS培养24小时后，将细胞用LPS(100毫微克/毫升)刺激，并与不同浓度的蓍内酯A处理，收集24小时后条件培养基，根据制造商的说明用大鼠IL-1βELISA测试试剂盒(Novus公司生物；CO，USA)。

在小胶质细胞的条件培养基测定MMP的活性。

MMP-9的活性通过明胶酶谱定量。

细胞活性的测定：

使用商业比色测定法(罗氏应用科学，德国)，测量从损坏细胞的胞质溶胶释放到培养介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性测定细胞活性。吸亮度在酶标仪492nm测定。细胞毒性的百分比根据下列等式，其中来自未处理的细胞释放的LDH活性是自LDH释放来计算，并在细胞中的最大释放的LDH是：

在MMP-9的实验，细胞的抗氧化活性(CAA)测定，细胞存活率通过结晶紫测定法的变形来确定。

测定细胞的抗氧化活性(CAA)：

使用非荧光细胞渗透化合物2'7'-二氯二乙酸酯(DCF-DA)检测到细胞内的活性氧生产。DCF-DA由细胞内酯酶水解，然后通过活性氧氧化成荧光化合物2'-7'-DCF。过氧自由基在生理温度热分解产生2,2'-偶氮二(脒基丙烷)(ABAP)。ABAP在37℃分解约1.36x10^-6s^-1，至多产生1×10¹²自由基/毫升/秒。小神经胶质细胞(130,000细胞/孔)在含有2％FBS、8.4mM的HEPES、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM中接种24孔板。为了测量蓍内酯A进入细胞并防止DCF由ABAP产生过氧自由基形成的能力，细胞培养用蓍内酯A处理1小时，然后细胞与DCF-DA预装30分钟，用PBS洗涤两次(最终浓度0.6mM)，然后加入ABAP。荧光表示ROS含量，在波长485nm激发和在波长520nm辐射以进行一读板器测定。

DPPH分析测定清除自由基活性的能力：

抗氧化活性用2,2-二苯基-1-picryhydrazyl(DPPH)自由基清除测定法测量。蓍内酯A或槲皮素在不同稀释度用铝箔包裹的试管中加入1毫升的DPPH(3.9毫克/100毫升甲醇)。吸亮度(A)在最低517nm并于黑暗中培养八分钟后测量。样品的清除能力(％)计算为(A_控制组-A_样品组)/A_控制组X 100)。

数据分析：

用单向ANOVA从几个对比实验池重复的统计分析，然后通过使用微软适用的GraphPad InStat 3(GraphPad软件，圣地亚哥，CA，USA)多重比较检验进行。对于植物生长调节剂的实验-通过学生t检验进行统计分析。

根据本发明，蓍内酯A对培养的神经元细胞显示效果。

在一个实施例中，β-类淀粉蛋白_25-35(Aβ_25-35)诱导神经元细胞死亡。发明人检视蓍内酯A在以细胞毒性肽β类淀粉蛋白_25-35(Aβ_25-35)处理细胞后对神经元活性的效果。以Aβ_25-35处理神经元细胞引起的细胞毒性(如由LDH法(图27A)所测得以及结晶紫染色(图27B)测得)。如图27证明的，蓍内酯A在纳摩尔浓度防止的细胞毒性作用。

在另一个实施例中，本发明涉及Aβ_25-35诱导的活性氧(ROS)升高。

在另一个实施例中，蓍内酯A对于β-类淀粉蛋白_25-35诱导ROS含量具有作用。以β-类淀粉蛋白_25-35处理的神经细胞导致ROS含量升高，蓍内酯A的处理防止活性氧含量的升高(图27C)。

本发明进一步涉及β-类淀粉蛋白_25-35诱导SAPK/JNK磷酸化。蓍内酯A对β-类淀粉蛋白_25-35诱导讯号传递途径的有效果。以β-类淀粉蛋白_25-35处理的神经细胞引起应激活化蛋白激酶/Jim-氨基末端激酶(SAPK/JNK)的磷酸化。蓍内酯A显着降低β-类淀粉蛋白_25-35诱导中的N2a神经细胞的SAPK/JNK(图28)和ERK1/2(图29)的磷酸化，但不包括MEK1(图30)，而不会影响各个这些蛋白质的总量。因此，蓍内酯A对的N2a细胞的保护作用可能部分归因于SAPK/JNK和ERK1/2磷酸化的抑制。

本发明进一步涉及麸氨酸诱导的神经细胞死亡。发明人检视蓍内酯A对麸氨酸处理细胞下神经元的活性产生效果。以麸氨酸处理的神经元细胞导致细胞毒性是由LDH方法(图31-33)测定，蓍内酯A在纳摩尔浓度(图32，33)防止细胞毒性作用。

本发明进一步涉及麸氨酸诱导的活性氧(ROS)升高。接下来发明人检视蓍内酯A对麸氨酸诱导ROS含量的影响。麸氨酸处理的神经元细胞引起ROS含量升高，以蓍内酯A处理防止ROS含量的升高(图34，35)。

使用程序步骤：

程序1.在培养的星形胶质细胞中抑制活性抵抗过氧化氢诱导的SAPK/JNK激活

为了确定是否本发明的TTF或ACA获得在培养的星形胶质细胞中抑制活性抵抗过氧化氢诱导的SAPK/JNK激活的能力，本领域技术人员应遵循以下步骤：

1.根据在“丹参紫穗槐的精油及其对星形细胞易感性过氧化氢诱导的细胞死亡的成分的保护作用”中记载的方法制作大鼠脑的神经胶质细胞的原代培养。2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

2.按照“鼠尾草紫穗槐及其对星形细胞易感性过氧化氢诱导的细胞死亡成分的精油的保护作用”中记载的方法从培养的其它细胞类型分离的星形胶质细胞。2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

3.孵育培养星形胶质细胞(37℃，5％CO₂)2小时并以本发明新鲜稀释的TTF或ACA处理；

4.加入新鲜稀释175微摩尔的过氧化氢；

5.培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆和测量蛋白质含量。

7.使用PathScan整体SAPK/JNK夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)和PathScan phosoho-SAPK/JNK测量星形胶质细胞在细胞溶解产物(7-9微克蛋白质)中全部的和磷酸化的SAPK/JNK的量，分别根据制造商的说明通过ELISA(thrL基因83/Tyrl85)的夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序2.在培养的星形胶质细胞中抵抗过氧化氢诱导ERK 1/2活化的抑制活性

为了确定本发明的TTF或ACA是否获得培养星形胶质细胞对过氧化氢诱导的ERK1/2活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循下列步骤：

1.根据在“丹参紫穗槐的精油及其对星形细胞易感性过氧化氢诱导的细胞死亡的成分的保护作用”中记载的方法制作大鼠脑的神经胶质细胞的原代培养。2009年A.Elniann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

2.按照“鼠尾草紫穗槐及其对星形细胞易感性过氧化氢诱导的细胞死亡成分的精油的保护作用”中记载的方法从培养的其它细胞类型分离星形胶质细胞。2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

3.孵育培养的星形胶质细胞(37℃，5％CO₂)2小时，以本发明新鲜稀释的TTF或ACA处理；

4.加入新鲜稀释175微莫耳的过氧化氢；

5.孵育培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆和测量蛋白质含量。

7.使用PathScan整体的p44测量星形胶质细胞的细胞裂解物(9微克)中全部的和磷酸化的ERK 1/2的量，通过ELISA/42MAPK(ERK 1/2)的夹心ELISA试剂盒(Cell SignalingTechnology公司)或PathScan phosoho-P44/42MAPK(Thr202/Tyr204上)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序3.培养的星形胶质细胞抵抗过氧化氢诱导的MEK 1激活的抑制活性

为了确定本发明的TTF或ACA是否获得活化培养星形胶质细胞针对过氧化氢诱导MEK1的抑制活性，一个本领域技术人员应遵循以下的步骤中：

1.按照“丹参紫穗槐的精油及其对星形细胞易感性过氧化氢诱导的细胞死亡的成分的保护作用”中描述的方法产生大鼠脑的原代培养神经胶质细胞。2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

4.加入新鲜稀释175微莫耳的过氧化氢；

5.孵育培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆和测量蛋白质含量。

7.分别使用PathScan整体的MEK1夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)或PathScan phosoho-MEK1(Ser217上/221)夹心ELISA试剂盒测量星形胶质细胞的细胞裂解物(8.3-11.7微克)中全部的和磷酸化的MEK1的量，通过ELISA试剂盒(CellSignaling Technology公司)。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序4.在培养的星形胶质细胞中抵抗过氧化氢诱导CREB活化的抑制活性

为了确定本发明的TTF或ACA是否获得培养星形胶质细胞对过氧化氢诱导的CREB活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循下列步骤：

4.加入新鲜稀释175微莫耳的过氧化氢；

5.孵育培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆和测量蛋白质含量。

7.测量星形胶质细胞的细胞裂解物(14微克)的全部的和磷酸化的CREB的量，分别通过使用PathScan总CREB夹心ELISA试剂盒ELISA(Cell Signaling Technology公司)或PathScan phosoho-CREB(Serl33)夹心试剂盒(Cell Signaling Technology公司)ELISA。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序5.在培养的星形胶质细胞中抵抗过氧化氢诱导的细胞死亡的保护活性

为了确定本发明的TTF或ACA是否获得培养星形胶质细胞中抵抗过氧化氢诱导的细胞死亡的保护活性，本领域技术人员应遵循下列步骤：

4.加入新鲜稀释175-200微莫耳的过氧化氢；

5.孵育培养20-24小时(37℃，5％CO₂)；

6.通过比色乳酸脱氢酶(LDH)测定(罗氏应用科学)以及根据制造商的说明，测量细胞的细胞毒性和存活率，以及结晶紫细胞染色如下：

7.轻轻从平板培养基拉出；

8.将板移转至化学罩；

9.注入150μl，5％甲醛(在PBS中)至每个孔，并在室温培养15分钟；

10.倒出甲醛为化学废物，轻轻于自来水下冲洗干净；

11.通过在纸巾敲击板去除多余的水分；

12.注入150μl结晶紫溶液(10克/升，在水中)到每个孔中；

13.在室温培养15分钟(在化学罩内)；

14.倒出结晶紫为化学废物，轻轻于自来水下冲洗干净，直到所有剩余的染料去除；

15.在纸巾上敲击板去除残留水分；

16.注入150μl，33％含水冰醋酸至每个孔；

17.使用微量盘检测仪在波长540nm及690纳米参考滤波器下测定吸亮度；

18.细胞毒性含量减少90％是在此测定中保护活性的指示。

程序6.减少细胞内ROS活性。

为了确定本发明的TTF或AcA减少星形胶质细胞中的过氧化氢诱导ROS量，本领域技术人员可采取以下步骤：

3.星形胶质细胞涂板(300,000细胞/0.5毫升/孔的24孔平板)并培养(37℃，5％CO2)24小时。描述于Elmann，A等人，2011，蓍提草提取物下调ROS产生并保护星形胶质细胞免受氧化压力诱导的细胞死亡，“神经退化性疾病-过程、预防、保护和监控”，ISBN 978-953-307-485-6，(雷蒙德,张川勇编)，InTech出版。

http://www.intechopeii.coin/articles/show/title/ext ract-of-achillea-fragrantissima-downregulates-ros-production-and-protects-astrocytes-from-oxidati；

4.更换一新鲜的生长培养基含有20微莫耳2'7'二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)；

5.培养30分钟(37℃，5％CO₂)；

6.用PBS洗涤两次；

7.用新鲜培养基更换；

8.读取荧光485nm“时间0”(消光)和528nm(发散)。

9.培养的细胞以本发明新鲜稀释TTF或ACA孵育2小时；

10.添加新鲜稀释过氧化氢(175微莫耳)；

11.在添加过氧化氢1、2、3、4小时后读取荧光(如485nm及发散：528nm)

12.ROS含量减少90％是在此测定中抗氧化剂活性的指示。

程序7.培养的星形胶质细胞中含过氧自由基生成分子ABAP的抗氧化活性：

为了确定TTF或ACA是否获得在培养的星形胶质细胞的细胞内含有过氧自由基产生分子的ABAP的抗氧化活性，本领域技术人员可采取以下步骤中：

1.细胞涂24孔板(300,000细胞/孔)。

2.一天后更换新鲜培养基培养基如所述的：Elmamr，A.，Telerman，A.，Mordechay，S.，Erlanlc，H.，Rindner，M.，Ofrr，R。和贝特-雅奈，大肠杆菌期刊(201 1)。蓍提草提取物下调ROS产生并保护星形胶质细胞免受氧化压力诱导的细胞死亡，“神经退化性疾病-过程、预防、保护和监控”，ISBN 978-953-307-485-6，(雷蒙德,张川勇编)，InTech出版。http://www.intechopen.com/articles/show/title/extract-of-achillea-fragiantissima-downregulates-ros-production-and-protects-astrocytes-from-oxidati；

3.以本发明的新鲜稀释TTF或AcA孵育细胞(1小时，5％CO₂，37℃)；

4.加入DCF-DA另外孵育30分钟(370℃，5％CO₂)；

5.用PBS洗涤两次；

6.照射荧光(例如：485nm和发散528nm)；

7.添加新鲜稀释2'2'偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(ABAP，产生过氧自由基)到细胞，最终浓度600微摩尔，除了“空白”的细胞(细胞的含有/不含有抗氧化剂和含有/不含有ABAP)；

8.读取3、6和24小时荧光Ex：485nm和Em：528nm；

9. 20小时后测量细胞生存力使用结晶紫细胞染色如上所述；

10. ROS含量的减少至少60％是细胞抗氧化剂测定抗氧化活性的指示(参见沃尔夫，KL，&Liu R.H.(2007)细胞的抗氧化活性(CAA)测定用于评估抗氧化剂，食品和膳食补充剂杂志，农业和食品化学，55卷，第22号，pp.8896-8907)。

程序8：LPS活化的小神经胶质细胞的抗炎活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA获得在LPS活化小神经胶质细胞的抗炎活性，本领域技术人员可采取以下步骤：

1.根据“天竺葵油在小神经胶质细胞的抗神经炎效果”2010A.Elmann，SMordechay，M Rindner，Ravid，功能性食品，2：17-22，中记载的方法制作小神经胶质细胞的原代培养；

2.小神经胶质细胞涂在(3.5×10⁴细胞/孔)24孔组织培养板，DMEM中含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素；

4.以本发明的新鲜稀释TTF或AcA处理细胞；

5.以脂多糖激活小神经胶质细胞(LPS，100微克/毫升)；

6.收集条件培养基24小时后测量IL-Ιβ和IL-6的含量；

7.通过ELISA测量细胞因子的含量；

8.诱导的IL-6抑制性高于45％和的诱导的IL-Ιβ抑制性高于85％为抗炎活性的指标。

程序9：小胶质细胞存活率

为了确定是否本发明的TTF或AcA对于LPS活化的小神经胶质细胞没有毒性，本领域技术人员可采取以下步骤：

4.以本发明的新鲜稀释TTF或AcA处理细胞；

5.以脂多糖激活小神经胶质细胞(LPS，100微克/毫升)；

6. 24小时后收集条件培养基用于不同的测定(例如细胞因子或麸氨酸含量)和结晶紫细胞染色测量细胞活力，如下所示：

7.将板转移至化学罩；

8.注入150μl，5％甲醛(在PBS中)至每个孔，并在室温培养15分钟；

9.倒出甲醛为化学废物，轻轻于自来水下冲洗干净；

10.通过在纸巾敲击板去除多余的水分；

11.注入150μl结晶紫溶液(10克/升，在水中)到每个孔中；

12.在室温培养15分钟(在化学罩内)；

13.倒出结晶紫为化学废物，轻轻于自来水下冲洗干净，直到所有剩余的染料去除；

14.在纸巾上敲击板去除残留水分；

15.分注150μl的33％含水冰醋酸至每个孔；

16.使用微量盘检测仪在波长540nm及690纳米参考滤波器下测定吸亮度；

17.存活率不低于未处理的细胞的存活率被认为是在此测定法没有毒性的。

程序10.培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导SAPK/JNK的活化的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA获得培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导SAPK/JNK的活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循以下步骤：

1.溶解Aβ_25-35于无菌双蒸水至2微莫耳的最终浓度，并在水浴中于37℃培养24小时。

2.使N2a细胞成长在DMEM(高葡萄糖，225毫升)，含有OPTI-MEM(250毫升)、5％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素。

3.以本发明的新鲜稀释TTF或AcA培养N2a细胞(37℃，5％CO₂)2小时：

4.加入25微莫耳新鲜稀释β-类淀粉蛋白_25-35；

5.培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆并测量蛋白质含量。

7.分别根据制造商的说明从N2a细胞细胞裂解物中测量全部的及磷酸化的SAPK/JNK的量)，使用PathScan总SAPK JNK夹心ELISA试剂盒进行ELISA(Cell SignalingTechnology公司)和PathScan phosoho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)的夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)进行ELISA。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序11.培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导ERK 1/2活化的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA获得培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导ERK 1/2的活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循以下步骤：

4.加入25微莫耳新鲜稀释Aβ_25-35；

5.培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆并测量蛋白质含量。

7.使用PathScanP44/42MAPK(ERK 1/2)夹心ELISA试剂盒(Cell SignalingTechnology公司)或PathScanphosoho-P44/42MAPK(Thr202/Tyr204上)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)测量整体的星形胶质细胞的细胞裂解物(9微克)中全部的和磷酸化的ERK 1/2的量。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序12.培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导激活的MEK1的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA在培养的N2a细胞获得针对Aβ_25-35诱导MEK1活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循以下步骤：

4.加入25微莫耳新鲜稀释Aβ_25-35；

5.培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆并测量蛋白质含量。

7.通过ELISA测量N2a细胞的细胞裂解物中全部的和磷酸化的MEK1的量的，分别使用PathScan全数MEK1夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)或PathScanphosoho MEK1(Ser217上/221)夹心ELISA试剂盒，(Cell Signaling Technology公司)。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序13：培养的N2a细胞抵抗Aβ_25-35诱导激活的CREB的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA在培养的N2a细胞获得针对Aβ_25-35诱导CREB活化的抑制活性，本领域技术人员应遵循以下步骤：

4.加入25微莫耳新鲜稀释Aβ_25-35；

5.培养40分钟(37℃，5％CO₂)；

6.准备细胞匀浆并测量蛋白质含量。

7.通过ELISA测量N2a细胞的细胞裂解物中全部的和磷酸化的CREB的量的，分别使用PathScan全数MEK1夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology公司)或PathScanphosoho CREB(Ser133)夹心ELISA试剂盒，(Cell Signaling Technology公司)。

8.使用微量盘检测仪在光学密度450nm确认。

程序14：抗麸氨酸诱导的神经细胞死亡的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA针对在培养的神经元细胞中获得麸氨酸诱导的细胞死亡的抑制活性，本领域的技术人员应遵循以下的步骤：

使N2a细胞成长在DMEM(高葡萄糖，225毫升)，含有OPTI-MEM(250毫升)、1％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素。

以AcA或TTF处理N2a神经元细胞。

两个以后再添加100微莫耳新鲜稀释麸氨酸；

孵育培养20小时(37℃，5％CO₂)；

由LDH法测定细胞毒性

由结晶紫染色测量存活率。

程序15：细胞内Aβ_25-35诱导ROS降低活性：

为了确定本发明的TTF或ACA是否降低N2a细胞中Aβ_25-35诱导的ROS含量，本领域技术人员可采取以下步骤：

2.N2a细胞涂板于(10,000个细胞/0.2毫升/孔的96孔平板)的DMEM(225毫升高葡萄糖)中，OPTI-MEM(250毫升)含有1％胎牛血清、2毫升L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素培养24小时(37℃，5％CO₂)。

3.更换一新鲜的生长培养基含有20微莫耳2'7'二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)；

4.培养30分钟(37℃，5％CO₂)；

5.用PBS洗涤两次；

6.用新鲜培养基更换；

7.读取荧光485nm“时间0”(消光)和528nm(发散)。

8.培养的细胞以本发明新鲜稀释TTF或ACA孵育2小时；

9.添加新鲜稀释Aβ_25-35(25微莫耳)；

10.添加Aβ_25-35 20小时后读取荧光(如485nm及发散：528nm)。

11.ROS含量减少70％是在此测定中抗氧化剂活性的指标。

程序16：细胞内麸氨酸诱导的ROS降低活性

为了确定是否TTF或本发明的ACA降低的N2a细胞麸氨酸诱导ROS含量，一个本领域技术人员可采取以下步骤：

1.N2a细胞涂板于(10,000个细胞/0.2毫升/孔的96孔平板)的DMEM(225毫升高葡萄糖)中，OPTI-MEM(250毫升)含有1％胎牛血清、2毫升L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素培养24小时(37℃，5％CO₂)。

2.更换一新鲜的生长培养基含有20微莫耳2'7'二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)；

3.培养30分钟(37℃，5％CO₂)；

4.用PBS洗涤两次；

5.用新鲜培养基更换；

6.读取荧光485nm“时间0”(消光)和528nm(发散)。

7.培养的细胞以本发明新鲜稀释TTF或ACA孵育2小时；

8.加入新鲜稀释麸氨酸(100微莫耳)；

9.添加麸氨酸20小时后读取荧光(如485nm及发散：528nm)。

10.ROS含量减少55％是在此测定中抗氧化剂活性的指标。

程序17：抗Aβ_25-35诱导的神经细胞死亡的抑制活性

为了确定是否本发明的TTF或AcA针对在培养的神经元细胞中获得抗Aβ_25-35诱导的细胞死亡的抑制活性，本领域的技术人员应遵循以下的步骤：

溶解Aβ_25-35于无菌双蒸水至2微莫耳的最终浓度，并在水浴中于37℃培养24小时。

以25微莫耳新鲜稀释的β-类淀粉蛋白_25-35处理N2a神经元细胞，在AcA或TTF存在或不存在时。

孵育培养20小时(37℃，5％CO₂)；由LDH方法测量细胞毒性

由结晶紫染色测量存活率。

程序18：在LPS活化小神经胶质细胞中测量NO含量

为了确定本发明的AcA是否抑制从LPS活化小神经胶质细胞中分泌NO，本领域技术人员可采取以下步骤：

1.根据“天竺葵油在小神经胶质细胞的抗神经炎效果”2010A.Elmann，SMordechay，M Rindner，Ravid，功能性食品，2：17-22，中记载的方法制作小神经胶质细胞和板细胞的原代培养。

2.以本发明新鲜稀释的AcA处理细胞；

3.以脂多醣激活小神经胶质细胞(LPS，4.5纳克/毫升)；

4. 20小时后收集100微升条件培养基测量NO含量；

5.通过100微升Griess混合试剂测量NO的含量；

6.在室温下孵育10分钟。

7.读取微量盘检测仪在550nm处的吸亮度。

8.使用培养基为空白对照组。

9.在此模式中抑制的诱导的NO抑制率高于66％为抗炎活性指标。

程序19：在条件培养基中测定LPS激活小神经胶质细胞的麸氨酸含量：

为了确认本发明的AcA是否可以从LPS活化小神经胶质细胞中减少麸氨酸分泌，本领域技术人员可采取以下步骤：

1.根据“天竺葵油在小神经胶质细胞的抗神经炎效果”2010A.Elmann，SMordechay，M Rindner，Ravid，功能性食品，2：17-22，中记载的方法制作小神经胶质细胞的原代培养。

2.小神经胶质细胞涂板(3.5χ10⁴细胞/孔)在24孔组织培养板，在DMEM含有10％FBS、2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素；

4.以本发明新鲜稀释的AcA处理细胞；

5.以脂多醣激活小神经胶质细胞(LPS，100纳克/毫升)；

6. 20小时后收集100微升条件培养基测量NO含量；

7.使用根据制造商的说明的比色酶分析试剂盒(麸氨酸测定试剂盒，BioVision的，CA，USA)测量麸氨酸的含量。

9.在此模式中对诱导的麸氨酸抑制率高于80％为抗炎活性指标。

程序20：在LPS活化小神经胶质细胞测定MMP-9的活性

为了确定本发明的AcA是否抑制活性MMP-9从LPS活化小神经胶质细胞的分泌的含量，本领域技术人员可采取以下步骤：

1.根据“郁香忍冬蓍提取物的抗神经炎性影响”2011A.Elmann，S Mordechay，HErlank，A Telemian，M Rindner R.奥菲尔，BMC补充和替代医学，11：98中所述准备小神经胶质细胞和板细胞的原代培养物。

2.以本发明新鲜稀释的AcA处理细胞；

3.以脂多醣激活小神经胶质细胞(LPS，4.5纳克/毫升)；

4.根据“郁香忍冬蓍提取物的抗神经炎性影响”2011A.Elmann，S Mordechay，HErlank，A Telemian，M Rindner R.奥菲尔，BMC补充和替代医学，11：98中所述通过凝胶酶谱测量MMP-9的含量；

5.在此模式中对诱导的MMP-9活性抑制率高于80％为抗炎活性指标。

程序21：LPS激活脾细胞的抗炎活性

为了确定本发明的ACA是否获得LPS活化脾细胞的抗炎活性，本领域技术人员可采取以下步骤：

1.通过断头牺牲Balb/c小鼠。

2.从小鼠取出脾脏，并挤单细胞悬浮液

3.用裂解缓冲液裂解红血球细胞，洗细胞数次。

4.脾细胞涂板(5×10<6>细胞/孔)于24孔组织培养板，在DMEM含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素；

5.以本发明新鲜稀释的AcA处理细胞；

6.以脂多醣激活小神经胶质细胞(LPS，5纳克/毫升)；

7.收集条件培养基测量细胞因子的含量；24小时后收集IL-2，48小时后收集IFNγ，TNF-α，IL-10，IL-12和IL-6。

8.通过ELISA测量的细胞因子的含量；

9.诱导因子TNF-α、IFNγ、IL-10、IL-12和IL-6的抑制率高于50％以上是在上述模式中为抗炎活性指标。

程序22：星形胶质细胞GDNF含量升高

为了确定是否本发明的AcA获得一培养星形胶质细胞的GDNF诱导活性，本领域技术人员应遵循以下步骤：

1.根据“丹参紫穗槐精油及其成分对星形细胞易感性过氧化氢诱导细胞死亡的保护作用”中记载的方法制作大鼠脑的神经胶质细胞的原代培养。2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid。农业与食品化学。57(15)：6636-41；

2.按照“鼠尾草紫穗槐精油及其成分对星形细胞易感性过氧化氢诱导细胞死亡的的保护作用”2009年A.Elmann，S.Mordechay，M.Rindner，O.Larkov，M.Elkabetz，U.Ravid，农业与食品化学，57(15)：6636-41中记载的方法从培养的其它类型细胞分离星形胶质细胞；

3.星形胶质细胞涂板在6孔PDL-涂覆塑料板，以2×10⁶细胞/孔的密度，DMEM/F12中含有5％FBS，2毫摩尔谷酰胺，100U/ml青霉素和100微克的/ml链霉素。

4.孵育培养24小时(37℃，5％CO₂)；

5.吸取培养基和添加新鲜培养基到细胞中。

6.以本发明的新鲜稀释AcA孵育培养的星形胶质细胞24小时(37℃，5％CO₂)；

7.使用含1％β-巯基乙醇的RLT缓冲液裂解细胞(Qiagen公司，德国希尔登)。

8.按照“从蚤草属因奇萨脑星形胶质细胞查尔酮的保护和抗氧化作用”A.，Erlank，PL，Mordechay，S.，Rindner，M.，奥菲尔河和Kashman，Y.(2013年)，氧化医学和细胞寿命：2013年，文章编号694398，中记载的方法提取RNA并进行实时PCR分析。

9.在此测定中两倍诱导的GDNF含量为GDNF诱导活性的指标。

程序23：通过定量实时PCR分析测量IL-Ιβ、TNFα、iNOS、COX-2及MMP-9在脂多醣体激活的小胶质细胞中的转录：

1.根据“天竺葵油在小神经胶质细胞的抗神经炎效果”2010A.Elmann，SMordechay，M Rindner，Ravid，功能性食品，2：17-22，中记载的方法制作主要的小神经胶质细胞的原代培养。

2.小胶质细胞涂板在RPMI-1640，其含有2％FBS，2mM谷氨酰胺、100U/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、1mM丙酮酸钠、和50μΜβ-巯基乙醇。

3.处理之前培养细胞36小时。

4.以蓍内酯A处理小神经胶质细胞。

5.以LPS(4.5纳克/毫升)刺激5小时。

6.根据制造商的说明由RNeasy试剂加Mini试剂盒(Qiagen公司，德国希尔登)提取RNA。

7.通过使用50个单位不含RNA酶的DNasel的在37℃下1小时从RNA样品除去基因组DNA。

8.使用Thermo ScientificVerso的cDNA试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，按照制造商的方案转化RNA(20克)为cDNA。

9.使用大鼠MMP9、TNFα、IL-Ιβ、iNOS、COX-2和分别来自Applied Biosystems(Rn00579162_ml，Rn00562055_ml，Rn00580432_ml，Rn00561646_ml，RnOl483828_ml)预先设计的TaqMan基因表现分析并利用cDNA进行基因与荧光定量化学实时定量PGR扩增(AppliedBiosystems)。

10.定量实时PCR是根据“依照需求分析”引子(Applied Biosystems)的流程进行。

11.所有三个技术重复进行的结果相对A-微管蛋白(Rn01532518.gl)和GAPDH(Rn01775763.gl)标准化，使用比较方法分别表示计算出的相对表达比(相对量，RQ)，并根据由ABI PRISM 7700序列检测系统(使用1.6版本软件)的数据创建。

神经退化性疾病的可测试判定准则：

关于几个因素提供了可测试标准，以便协助本领域技术人员在评估是否这些因素影响的神经退化性疾病条件确实涉及由TTF或AcA得到改善或防止。

为了表示神经退化性状况改进的情况下，这种改进被连接到由蓍内酯A减少的iNOS，COX-2，IL-1β，IL-2和肿瘤坏死因子α含量，从媒介物或脂多醣体注射小鼠大脑的分析应该以蓍内酯A处理后的小鼠以及不会以蓍内酯A处理的小鼠进行。给小鼠腹腔注射脂多醣体之后小鼠大脑中的iNOS、COX-2、IL-1βIL-2和肿瘤坏死因子α的蛋白质含量显着增加，并与媒介物对照组的小鼠进行比较。注射脂多醣体、以蓍内酯A处理、牺牲小鼠、取出大脑、准备脑匀浆、以西方墨点法分析测试iNOS和COX-2，IL-1β，IL-2和肿瘤坏死因子α含量，描述于神经生物学学会纪念刊，2011；96(2)：156-65，“以蓍内酯A处理使小鼠的脑匀浆中iNOS，COX-2，IL-L-β，IL-2和肿瘤坏死因子α含量减少指出施用蓍内酯A是用于减少iNOS，COX-2，IL-L-β，IL-2和肿瘤坏死因子α含量的原因”。

为了表明在神经变性条件的改善的情况下，这种改进被连接到通过TTF减少IL-1β和IL-6的含量，从媒介物或脂多醣体注射小鼠大脑的分析应该以TTF处理后的小鼠以及不会以TTF处理的小鼠进行。给小鼠腹腔注射脂多醣体之后小鼠大脑中的IL-1β的蛋白质含量显着增加，并与媒介物对照组的小鼠进行比较。注射脂多醣体、以TTF处理、牺牲小鼠、取出大脑、准备脑匀浆、以西方墨点法分析测试IL-1β和IL-6含量，描述于神经生物学学会纪念刊，2011；96(2)：156-65，“以TTF处理减少小鼠的脑匀浆中IL-1β和IL-6含量指出施用TTF是用于减少IL-1β和IL-6含量的原因”。

为了表示神经退化性状况改进的情况下，这种改进被连接到通过TTF/蓍内酯A减少ERK1/2、MEK1、CREB和SAPK/JNK的磷酸化。从媒介物或脂多醣体注射小鼠大脑的分析应该以TTF/蓍内酯A处理后的小鼠以及不会以TTF/蓍内酯A处理的小鼠进行。给小鼠腹腔注射脂多醣体之后小鼠大脑中磷酸化的ERK和JNK显着增加，并与媒介物对照组的小鼠进行比较。注射脂多醣体、以TTF/蓍内酯A处理、牺牲小鼠、取出大脑、准备脑匀浆、以西方墨点法分析测试未磷酸化与磷酸化ERK1/2、MEK1、CREB和SAPK/JNK的含量，描述于“通过熊果酸抑制P38/NF-kB调节炎症传递减弱小鼠大脑脂多醣诱导的认知缺陷，王、李、江、吴、张、张、王、阮、孙、单、张等人，神经生物学学会纪念刊，2011；96(2)：156-65”与。以TTF/蓍内酯A处理减少小鼠的脑匀浆中ERK1/2、MEK1、CREB和SAPK/JNK磷酸化的含量指出施用TTF/蓍内酯A是用于减少ERK1/2、MEK1、CREB和SAPK/JNK磷酸化含量的原因。

为了表示神经退化性状况改进的情况下，这种改进被连接到通过蓍内酯A减少亚硝酸盐(NO)含量。从媒介物或脂多醣体注射C57BL/6小鼠大脑的分析应该以蓍内酯A处理后的小鼠以及不以蓍内酯A处理的小鼠大脑进行。给小鼠腹腔注射脂多醣体之后小鼠大脑中一氧化氮显着增加，并与媒介物对照组的小鼠进行比较。以蓍内酯A处理、断头牺牲小鼠、取出大脑、用冰冷的生理盐水冲洗、称重、均质化并由格里斯试剂量测亚硝酸盐(NO代谢物)，描述于阿卜杜勒-萨拉姆等人，Neurotox期刊，2012；21(3)：245～55。减少亚硝酸盐(NO)与蓍内酯A一个治疗的小鼠的脑匀浆含量表明蓍内酯A一个政府对减少亚硝酸盐(NO)含量的原因。以蓍内酯A处理减少小鼠的脑匀浆中亚硝酸盐(NO)含量指出施用蓍内酯A是用于减少亚硝酸盐(NO)含量的原因。

为了表示神经退化性状况改进的情况下，这种改进被连接到通过蓍内酯A/TTF减少氧化压力程度。从媒介物或以1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)注射雄性瑞士白化小鼠大脑的分析应该以蓍内酯A/TTF处理后的小鼠以及不会以蓍内酯A/TTF处理的小鼠进行。给小鼠腹腔注射MPTP之后小鼠大脑脑黑质纹状体组织的丙二醛含量(MDA)显着增加，并与媒介物对照组的小鼠进行比较。腹膜内注入MPTP、以蓍内酯A/TTF处理、牺牲小鼠、取出大脑、准备脑黑质纹状体组织的脑匀浆，并测试脑黑质纹状体组织脂质过氧化的含量作为氧化压力的指标，描述于如下所述方法“比较油麻藤与刺毛黧豆籽提取物与在雌激素中1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型的神经保护潜力，神经化学期刊，2014；65：L-13，亚达夫、普拉卡、周函、威斯佛、威尔马、辛格、辛格”。以蓍内酯A/TTF处理使小鼠脑匀浆中MDA含量的减少指出施用蓍内酯A/TTF是用于减少氧化压力程度的原因。

在帕金森病的动物模型中，实验结果一直表现出使用GDNF的能对多巴胺神经元产生保护作用。

为了证实神经退化性状况的改善连接到通过蓍内酯A升高GDNF含量，从1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)-注射雌性SD(SD)大鼠的大脑分析GDNF含量，在以蓍内酯A处理后以及不会以蓍内酯A处理后的大鼠大脑。MPP+单侧注射入大鼠的右位前脑束处理之后的GDNF使大鼠脑的黑质含量显着下降，与载体对照进行比较。单侧注射MPP+并以ACA处理、牺牲大鼠、取出大脑、准备匀浆或脑组织切片，西方墨点法及/或通过免疫荧光分析，分别测试GDNF含量，描述于J NUTR生化期刊，2014年；25(7)：801-6，MPP+注射大鼠大脑中脑匀浆/分布处理后GDNF含量升高以蓍内酯A处理相较于载体处理注射MPP+证实蓍内酯A的施用使GDNF含量升高的原因。

为了表明在神经退化性条件的改善的情况下，这种改善是连接到通过蓍内酯A减少MMP-9含量，从6-羟基多巴胺(6-OHDA)-注射大鼠，蓍内酯A处理后以及不会以蓍内酯A处理后的大鼠大脑。注射6-羟基多巴胺到前脑内侧束导致MMP-9的阳性细胞在大脑的损伤侧黑质卵透明致密部的数目显著增加，相较于未病变侧施用6-羟基多巴胺的第九天。注射6-羟基多巴胺到SD大鼠、以蓍内酯A处理、牺牲大鼠、取出大脑、从脑部制备自由浮动部分并以免疫化学法检测MMP-9的含量，描述于“Marinova-Mutafchieva L、Sadeghian、戴维斯JB，麦都思AD，德克斯特DT，拉迪奇生物学医学2011；50(5)：633-40通过选择性的iNOS抑制剂帕金森病模型神经保护“。减少MMP-9阳性细胞与蓍内酯A处理相比，载体处理的6-羟基多巴胺损毁大鼠表明蓍内酯A的施用是减少MMP-9含量的原因。

为了表明在神经退化性条件改善的情况下，这种改善是通过蓍内酯A/TTF保护神经元细胞免于麸氨酸毒性。在视网膜神经节细胞(RGC)由载体或或麸氨酸注射的小鼠在以蓍内酯A/TTF处理以及未以蓍内酯A/TTF处理进行分析。小鼠眼注射麸氨酸之后，RGC显着下降，与对照载体进行比较。注入荧光金到小鼠上丘，麸氨酸注射入眼睛，用蓍内酯A/TTF处理，1周后牺牲小鼠，眼睛去核，视网膜脱离准备微观评估。计算视网膜神经节细胞的在每个视网膜平均数量，描述于和肖里、基普尼斯、优雷斯、伍德穆西、鲁伊斯、惠勒、施瓦茨，(2001)“接种疫苗保护视网膜神经节细胞免于谷氨酸的细胞毒性死亡和高眼压症：对青光眼“，3398-3403：美国国家科学院学报。以蓍内酯A/TTF处理的小鼠眼中RGC存活升高代表蓍内酯A/TTF的使用是RGC存活含量升高的原因。

小鼠的脑中观察到β类淀粉蛋白和较少的神经元细胞在TG-AD(阿兹海默症双转基因(APP/PS 1)，相对于非Tg同窝小鼠的大脑。

为了表明在神经退化性条件的改善的情况下，这种改善是通过蓍内酯A/TTF保护神经元细胞避免β类淀粉蛋白的毒性。从Tg-AD小鼠和非Tg的同窝小鼠的大脑冷冻切片分析应该在小鼠以蓍内酯A/TTF处理后以及未以蓍内酯A/TTF处理的小鼠进行，相较于非Tg同窝小鼠。注射TTF/AcA到Tg-AD小鼠，小鼠牺牲，准备大脑冰冻切片和染色之后和显微镜观察，计算神经元的数目，描述于柏托夫斯基、科罗尼、哈马欧、库尼斯、阿斐、兰达、科恩、施瓦茨男，(2006)，对阿尔茨海默氏病通过诱导的树突状胶质细胞表达胰岛素样生长因子1。美国国家科学院学报架：11784-11789。Tg-AD小鼠的大脑中神经元的数量升高表明蓍内酯A/TTF的使用是使神经元数目升高的原因。

为了表明在神经退化性条件的改善的情况下，这种改善是连接到通过AcA减少麸氨酸含量。从载体或LPS注射小鼠的分析应该在小鼠以蓍内酯A/TTF处理后以及未以蓍内酯A/TTF处理的小鼠进行。给小鼠腹腔注射LPS之后在小鼠的大脑中神经发炎显着增加，与载体对照进行比较。植入麸氨酸传感器到小鼠大脑测量麸氨酸含量，注入LPS，用蓍内酯A处理，监控麸氨酸含量，描述于分子期刊，2014年，19(6)，7341-7355；制作植入的装置，制造酶固定化谷氨酸传感器在体内外谷氨酸浓度变化的监测，曾、张、陈等人。以AcA处理使小鼠脑内氨酸含量减少的表明AcA的使用是降低麸氨酸含量的原因。

实施例：

为了说明本发明，下面的实施例都包括在内。然而，可以理解的是，这些实施例不限制本发明并且仅意在建议实施本发明的方法。

实施例1、3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮对于小神经胶质细胞没有细胞毒性。

小神经胶质细胞以LPS激活，在存在或不存在不同浓度的3,5,4'三羟基6,7,3'-三甲氧基黄酮中，20小时以后测定细胞存活力(用MTT)。结果表明，3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮对于小神经胶质细胞没有细胞毒性

实施例2、TTF保护星形胶质细胞免于过氧化氢诱导的细胞死亡。

TTF(8μΜ)加入星形胶质细胞之前(前2小时，前1小时)、伴随(0时间差)或之后(后1小时，后2小时)加入过氧化氢(175μΜ)。20小时后通过LDH中的条件培养基的含量测定细胞毒性。“W/O”是指不含。结果是平均值±两个实验(n＝8)的标准误差。图2A中示出。**P<0.01，***P<0.001，相比于只用过氧化氢处理的细胞。

星形细胞用不同浓度的TTF、槲皮素(作为对照黄酮)或美金刚胺的处理(作为对照药物)。加入化合物2小时后加入过氧化氢，20小时后以乳酸脱氢酶方法测定细胞死亡。结果示于图2B，是平均值±两个实验(n＝7)的标准误差。*P<0.05，***p<0.001，相比于只用过氧化氢处理的细胞。

星形细胞用不同浓度的TTF处理，20小时后通过LDH法测定细胞死亡。结果是平均值±两个实验(n＝10)的标准误差，于图2C中示出。***Ρ<0.001，相对于未经处理的细胞。结果表明，TTF保护星形胶质细胞免于过氧化氢诱导的细胞死亡。

实施例3、TTF抑制星形胶质细胞中的过氧化氢诱导SAPK/JNK、ERK1/2及MEK1磷酸化。

星形胶质细胞以175μΜ过氧化氢处理30分钟，后与TTF预培养2小时。磷酸化SAPK/JNK含量和全部的SAPK/JNK的含量(图3A)、MEK1(图3B)和ERK 1/2(图3C)，通过ELISA测定。每个磷酸化水解蛋白的含量标准化为在相关的蛋白质的总量的含量，并表示为平均值±标准误差在重复执行的两个实验(n＝4)。**P<0.01，***<0.001，相对于仅用过氧化氢处理的细胞，结果表明TTF抑制星形胶质细胞中的过氧化氢诱导SAPK/JNK、ERK1/2及MEK1磷酸化。

实施例4、TTF对于星形胶质细胞中过氧化氢提升的CREB磷酸化的影响

星形胶质细胞以175μΜ过氧化氢处理30分钟，后与TTF预培养2小时。全部的CREB含量和磷酸化CREB的含量通过ELISA测量。pCREB的含量标准化为CREB的总含量，并表示为装置的一式两份进行两个实验±标准误差(n＝4)。结果示于图4.**P<0.01，*P<0.05，相比于用过氧化氢处理的细胞。结果表明，TTF抑制星形胶质细胞的过氧化氢诱导的CREB磷酸化。

实施例5、TTF降低星形胶质细胞过氧化氢引起ROS含量。

星形细胞以预先加载的DCF-DA处理30分钟并洗涤。图5A示出已用175μΜ过氧化氢处理的ROS含量(荧光单位，FU)，细胞在指定的时间点进行测量。图5B结果显示，TTF(2μΜ)在添加过氧化氢到星形胶质细胞之前(前两小时，前一小时)，伴随(0时间差)或后(后1小时，后2小时)加入到细胞中。施用过氧化氢后1小时及4小时在星形胶质细胞测定ROS含量，。结果代表平均值±两个实验±标准误差(n＝4)。图5C结果显示星形胶质细胞已预温育不同浓度的TTF，槲皮素或美金刚胺2小时后。1小时后过氧化氢加入到所述培养，测定表示ROS含量的荧光强度。结果是平均值±三个实验中的一个典型实验的标准误差。*P<0.05。**P<0.01，***P<0.001，相对于零时间(A)，或者相对于只用过氧化氢处理细胞(B、C)时，结果表明，TTF降低星形胶质细胞过氧化氢引起ROS含量。

实施例6、过氧化氢清除。

对于过氧化氢的清除能力的评估，1mM的过氧化氢和不同浓度的TTF，槲皮素或美金刚胺在PBS共同孵育。10分钟后进行光学密度测定。结果示于图6，并且装置±在重复进行了两个实验的标准误差(n＝4)。**P<0.01，***P<0.001，相较于没有TTF的过氧化氢。结果表明，相比于美金刚胺和槲皮素，TTF有过氧化氢的清除活性能力。TTF有过氧化氢的清除活性。

实施例7、DPPH自由基清除活性。

TTF、美金刚胺和槲皮素的DPPH自由基清除能力，八分钟进行比较。结果示于图7，并且是平均值±在重复进行了两个实验的标准误差(n＝4)。结果表明，相比于美金刚胺和槲皮素，TTF的DPPH自由基清除能力。

实施例8、TTF降低星形胶质细胞中由2,2'-偶氮二(脒基丙烷)产生的过氧自由基的含量。

星形胶质细胞以TTF或槲皮素孵育2小時。然后，星形细胞以预先加载DCF-DA處理30分钟並洗涤。ABAP(0.6毫摩尔)加入到所述培养，和代表ROS含量荧光强度进行测定。图8A示出已被32μΜTTF预温育在指定的时间点测量细胞的荧光含量。图8B示出3小时后加成ABAP的已经用各种浓度的TTF或槲皮素被预孵育测定的细胞的荧光含量。图8C示出在加入ABAP由结晶紫测定法后测定20小时的细胞的生存力。结果是平均值±两个实验(n＝8)±标准误差。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001相对于只用ABAP处理的细胞。结果表明，TTF降低星形胶质细胞中由2,2'-偶氮二(脒基丙烷)产生的过氧自由基的含量。

实施例9、TTF减弱LPS刺激的小神经胶质细胞中的IL-Ιβ和IL-6分泌。

小神经胶质细胞用不同浓度的TTF处理，接着LPS刺激(100微克/毫升)处理。24小时后，收集条件培养基，并通过ELISA细胞因子含量进行测试。结果对IL-Ιβ和IL-6分别示于图9A和图9B。使用结晶紫测定法(图9C)测定细胞存活率。数值表示平均值±标准误差(n＝4每个处理)。结果表明，TTF减弱LPS刺激的小神经胶质细胞中的IL-Ιβ和IL-6分泌。

实施例10、TTF防止β-类淀粉蛋白_25-35诱导的神经元细胞死亡。

N2a神经元细胞用β-类淀粉蛋白_25-35(25μΜ)和TTF处理。通过LDH法和结晶紫染色分别得到的细胞毒性(图10A)和存活率(图10B)，并20小时后测定。结果是平均值±两个不同的实验(n＝15)的标准误差。结果表明，TTF防止β-类淀粉蛋白_25-35诱发神经细胞死亡。

实施例11、TTF防止Aβ_25-35诱发活性氧(ROS)的升高。

N2a神经元细胞用Aβ_25-35和TTF处理。20小时后测量ROS含量。结果示于图11，并且是平均值±两个不同的实验(n＝15)±标准误差。结果表明，TTF防止Aβ_25-35诱发活性氧(ROS)的升高。

实施例12、TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的MEK1磷酸化，而不会影响MEK1的总含量。

N2a细胞用Aβ_25-35和TTF伴随处理30分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的和磷酸化的MEK1的含量。两个不同磷酸化的MEK1实验的结果显示于图12A，为平均值±一个实验的标准误差(n＝4)以及一个全部的磷酸化MEK1实验的结果显示于图12B，为平均值±一个实验的标准误差(n＝2)。结果表明，TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的MEK1磷酸化，而不会影响MEK1的总含量。

实施例13、TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的SAPK/JNK磷酸化，而不会影响SAPK/JNK的总含量。

N2a细胞用Aβ_25-35和TTF伴随处理30分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的和磷酸化的SAPK/JNK的含量。结果显示于图13，平均值±一个实验的标准误差(n＝6)。结果表明，TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的SAPK/JNK磷酸化，而不会影响SAPK/JNK的总含量。

实施例14、TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的ERK1/2磷酸化，而不会影响ERK1/2的总含量。

N2a细胞用Aβ_25-35和TTF伴随处理30分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的和磷酸化的ERK1/2的含量。结果显示于图14，是平均值±一个实验的标准误差(n＝4)。结果表明，TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的ERK1/2磷酸化，而不会影响ERK1/2的总含量。

实施例15、TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的CREB磷酸化，而不会影响CREB的总含量。

N2a细胞用Aβ_25-35和TTF伴随处理30分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的和磷酸化的CREB的含量。结果显示于图15，是平均值±一个实验的标准误差(n＝2)。结果表明，TTF下调N2a神经元细胞中的Aβ_25-35诱导的CREB磷酸化，而不会影响CREB的总含量。

实施例16、TTF防止麸氨酸诱导的神经细胞死亡。

N2a神经元细胞以麸氨酸(100μΜ)和TTF处理。20小时后测量细胞毒性。结果示于图16，平均值±一个实验(n＝8)的标准误差。结果表明，TTF防止麸氨酸诱导的神经元细胞死亡。

实施例17、TTF防止麸氨酸诱导的活性氧(ROS)的升高。

N2A神经细胞以麸氨酸(100μΜ)和TTF处理。20小时后测量ROS含量。结果示于图17，平均值±两个不同实验(n＝16)的标准误差。结果表明，TTF防止麸氨酸诱导的活性氧(ROS)升高。

实施例18、TTF防止SNP诱导活性氧(ROS)的升高。

N2a神经元细胞预先加载DCF-DA 30分钟并洗涤。TTF(2μΜ)在添加SNP(250μΜ)之前(前两小时，前一小时)，伴随(0时间差)或后(后1小时，后2小时)加入到细胞中。神经细胞中的ROS含量在添加SNP20小时之后被测量。结果示于图18，平均值±两个不同的实验(n＝15)的标准误差。结果表明，TTF防止N2a细胞中的SNP诱发活性氧(ROS)的升高。

实施例19、TTF下调N2a神经元细胞中的SNP诱导的ERK 1/2磷酸化，而不会影响ERK1/2的总含量。

N2a细胞用SNP和TTF伴随处理40分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的和磷酸化的ERK1/2的含量。结果示于图19，并且实验结果是平均值±之一的标准误差，下调N2a神经元细胞中的SNP诱导的ERK 1/2磷酸化，而不会影响ERK1/2的总含量。

实施例20、TTF下调N2a神经元细胞中的SNP诱导的MEK1磷酸化，而不会影响MEK1的总含量。

N2a细胞用SNP和TTF伴随处理40分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的MEK1和磷酸化MEK1的含量。结果示于图20，数值是平均值±两个不同的实验(n＝4)的标准误差。结果表明，TTF下调N2a神经元细胞中的SNP诱导的MEK1磷酸化，而不会影响MEK1的总含量。

实施例21、蓍内酯A从激活小神经胶质细胞下调麸氨酸分泌。

小胶质细胞以指定浓度的蓍内酯A处理，其次由LPS刺激(100毫微克/毫升)处理。20小时后，收集条件培养基，并通过商业试剂盒测试麸氨酸含量。数值表示平均值±标准误差(n＝4时为每个处理)。**P<0.01；***P<0.00/，相比于仅用LPS刺激的细胞。结果表明，蓍内酯A从激活小神经胶质细胞下调麸氨酸分泌。

实施例22、抑制NO产生和减少由活化小神经胶质细胞响应于不同浓度的蓍内酯A的细胞毒性

在图21A，小胶质细胞分别用不同浓度蓍内酯A、地塞米松或美金刚胺(参考药物)处理，然后伴随脂多醣体激活(4.5纳克/毫升)20小时。收集细胞培养上清液，并且使用格里斯反应测定NO的含量。细胞毒性使用乳酸脱氢酶方法(图21B)进行测定。数值表示平均值±标准误差(每个处理n＝12)。**P<0.01；***P<0.001相对于只经LPS处理的细胞。结果表示响应于不同浓度的蓍内酯A，抑制激活小神经胶质细胞的NO产生率增加。

实施例23、蓍内酯A下调的MMP-9活性和转录。

以指定浓度的蓍内酯A处理小胶质细胞，之后由LPS刺激(4.5毫微克/毫升)处理。收集条件培养基24小时后和用凝胶酶谱为MMP-9的活性进行测试，如图23。酶谱表示两个独立的实验。MMP-9转录的含量的通过定量实时PGR测量。三个技术性重复实验的结果归一化到β-肌动蛋白，并表示为如图23B中MMP-9转录的相对量。结果是平均值±三个实验中的一个典型实验的标准误差。24小时后通过结晶紫测定法测定细胞存活率。数值表示平均值±标准误差(每个处理时n＝4)。结果示于图23C。结果表明AcA下调活化的小胶质细胞MMP-9的活性和转录。

实施例24、蓍内酯A从LPS刺激的小神经胶质细胞降低COX-2、iNOS、IL-Ιβ和TNF-α的转录和IL-Ιβ的分泌。

小神经胶质细胞用20微克/毫升蓍内酯A处理，接着通过用LPS刺激(4.5纳克毫升)。5小时后，通过定量实时PGR测定指定转录物的含量与不同转录物的相对量(RQ)进行了测定。定量实时PCR是根据“依照需求分析”引子(Applied Biosystems)的流程进行。三个技术重复进行的结果相对A-微管蛋白(Rn01532518.gl)被标准化。其结果表示为相对于LPS-刺激细胞的百分比。结果是平均值±一个实验选自三个相同实验的标准误差和示于图24A-D。以指定浓度的蓍内酯A处理小胶质细胞，之后由LPS刺激(100微克/毫升)处理。24小时后，收集条件培养基并通过ELISA的细胞因子含量进行测试。在活化细胞(指定为100％)，IL-Ιβ含量128皮克/毫升。数值表示平均值±标准误差(每个处理时n＝4)。*P<0.05；**P<0.0/；***P<0.001，相对于LPS活化小胶质细胞。结果示于图24E。结果表明，蓍内酯A降低IL-Ιβ从LPS刺激小胶质细胞的分泌。

实施例25、蓍内酯A抑制过氧自由基在小胶质细胞诱导DCFH氧化。

细胞依不同浓度的蓍内酯A培养1小时。然后，将细胞置于预加载的DCF-DA 30分钟并洗涤。加入ABAP(0.6毫摩尔)到所述培养，并在指定的时间点进行ROS含量测定。小胶质细胞以不同浓度的蓍内酯A或地塞米松处理。数值表示平均值±标准误差(每个处理的n＝8)。**P<0.0/；***P<0.001，相对于20小时不含化合物的ROS含量。结果示于图25。结果表明，蓍内酯A抑制过氧自由基在小胶质细胞诱导DCFH氧化。

实施例26、蓍内酯A的DPPH自由基清除活性

蓍内酯A和槲皮素的DPPH自由基清除能力，八分钟进行了测试。数值表示平均值±标准误差(n＝4时每个浓度)。**P<0.01；***P<0.001，相对于没有蓍内酯A或槲皮素的混合物。结果示于图26，结果表明，AcA具有DPPH自由基清除能力。

实施例27、蓍内酯A(AcA)防止β-类淀粉蛋白_25-35诱导的神经元细胞死亡和活性氧(ROS)的升高。

N2A神经元细胞用β-类淀粉蛋白_25-35(25μΜ)和蓍内酯A处理。20小时后测定细胞毒性(图27A)和存活率(图27B)和ROS含量(图27C)。结果是平均值±两个不同的实验(n＝16)的标准误差。结果表明，蓍内酯A(AcA)防止β-类淀粉蛋白_25-35诱导的神经元细胞死亡和活性氧(ROS)的升高。

实施例28、蓍内酯A(AcA)下调N2a神经元细胞中β-类淀粉蛋白_25-3诱导的SAPK/JNK的磷酸化，而不影响总SAPK/JNK全部的含量。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和蓍内酯A伴随处理40分钟。提取细胞，通过特定的ELISA试剂盒确定全部的或磷酸化的SAPK/JNK的含量。结果是平均值±两个不同实验的标准误差(n＝4)，对于磷酸化的SAPK/JNK以及对于全部的SAPK/JNK三种不同的实验。结果示于图28，结果表明，蓍内酯A(AcA)下调N2a神经元细胞中β-类淀粉蛋白_25-3诱导的SAPK/JNK的磷酸化，而不影响总SAPK/JNK全部的含量。

实施例29、蓍内酯A(AcA)下调N2a神经元细胞中的β-类淀粉蛋白_25-35诱导的ERK 1/2磷酸化而不影响ERK 1/2总量。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和蓍内酯A伴随处理40分钟。提取细胞，通过特定的ELISA试剂盒确定全部的或磷酸化的ERK1/2的含量。结果两个不同实验的平均值±标准误差(n＝4)。结果示于图29。结果表明蓍内酯A(AcA)下调N2a神经元细胞中的β-类淀粉蛋白_25-35诱导ERK 1/2的磷酸化，而不影响总ERK 1/2的含量。

实施例30、AcA对N2a神经元细胞中MEK1的Aβ_25-35诱导磷酸化的效果。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和AcA伴随处理40分钟。提取细胞通过特定的ELISA试剂盒确定全部的MEK1或磷酸化MEK1的含量。结果是平均值±一个实验的标准误差(n＝2)。结果示于图30。结果表明，AcA没有影响N2a神经元细胞中MEK1的Aβ_25-35诱导磷酸化。

实施例31、蓍内酯A保护N2a神经细胞免于麸氨酸诱导的细胞死亡。

蓍内酯A加入N2a细胞之前(前2小时，前l小时)、伴随(0时间差)或之后(后1小时，后2小时)加入麸氨酸。20小时后通过LDH中的条件培养基测定细胞毒性的含量。结果是平均值±两个实验(n＝16)标准误差。**P<0.01，***p<0.001，相对于仅用麸氨酸处理细胞的结果，显示在图31。结果表明蓍内酯A保护N2a神经细胞免于麸氨酸诱导的细胞死亡。

实施例32、蓍内酯A防止麸氨酸诱导的神经元细胞死亡。

N2a神经元细胞用β-类淀粉蛋白_25-35(25μΜ)与蓍内酯A处理，20小时后测定细胞毒性。结果是平均值±两个不同的实验(N＝16)的标准误差。结果示于图32。结果表明，蓍内酯A(AcA)防止麸氨酸诱导的神经元细胞死亡。

实施例33、蓍内酯A防止麸氨酸诱导的神经元细胞死亡。

N2a神经元细胞以β-类淀粉蛋白_25-35(25μΜ)和蓍内酯A或美金刚胺处理。20小时后测量细胞毒性。结果为平均值±两个不同实验(n＝16)的标准误差，以及AcA和美金刚胺的一个实验(n＝8)。结果示于图33。结果表明，AcA防止麸氨酸诱导的神经元细胞死亡。

实施例34、蓍内酯A防止N2a细胞中麸氨酸盐诱导的活性氧(ROS)升高。

N2a神经元细胞用麸氨酸(100μΜ)和蓍内酯A处理。20小时后测定ROS含量。结果是平均值±三个不同的实验(<<＝＝24)的标准误差。结果示于图34。结果表明蓍内酯A防止N2a细胞中麸氨酸盐诱导的活性氧(ROS)升高。

实施例35、蓍内酯A保护N2a神经细胞免于麸氨酸诱导的活性氧

蓍内酯A加入N2a细胞的前(前2小时，前l小时)、伴随(0时间差)或之后(后1小时，后2小时)加入麸氨酸。20小时后测量ROS含量。结果是平均值±两个实验(n＝16)标准误差。**P<0.01，***p<0.001，相对仅用麸氨酸处理细胞的结果显示在图35。结果表明，蓍内酯A保护N2a神经细胞避免麸氨酸诱导的活性氧。

实施例36、AcA下调N2a神经细胞的β-类淀粉蛋白_25-35诱导的CREB磷酸化。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和AcA伴随处理30分钟。提取细胞和磷酸化CREB的含量由特定ELISA试剂盒确定。结果是平均值±一个实验的标准误差(N＝2)。结果示于图36。结果表明，ACA下调N2a细胞神经元细胞在Aβ_25-35诱导的CREB磷酸化。

实施例37、蓍内酯A保护星形胶质细胞的避免过氧化氢诱导的细胞死亡。

蓍内酯A(80μΜ)加入到星形胶质细胞，加入过氧化氢前(前2小时，前1小时)、伴随(0时间差)、或之后(后1小时，后两小时)。20小时后细胞毒性通过LDH中的条件培养基的含量测定。“W/O”是指不含。结果是平均值±两个实验(n＝8)±标准误差。**P<0.01，***p<0.001，相对于仅用过氧化氢处理的细胞。结果示于图37A。

星形细胞用不同浓度的蓍内酯A或美金刚胺(作为对照药物)或载体处理。加入化合物后2小时加入过氧化氢(200μΜ)，20小时后由LDH法测定溶液中的细胞死亡。结果是装置±两个实验(n＝8)的标准误差。***P<0.001，相比于仅用过氧化氢处理的细胞，结果示于图37B。结果表示，蓍内酯A避免星形胶质细胞的过氧化氢诱导的细胞死亡。

实施例38、过氧化氢清除

对于过氧化氢的清除活性，1mM过氧化氢和不同浓度的蓍内酯A，槲皮素或美金刚胺共培养在PBS中。10分钟后进行光学密度测定。结果是平均值±在重复进行了两个实验的标准误差(n＝4)。**p<0.01，***p<0.001，相对于过氧化氢不存在的化合物，结果示于图38，结果表示AcA的过氧化氢的清除能力。

实施例39、蓍内酯降低星形胶质细胞中过氧化氢诱导ROS产生。

星形胶质细胞用DCF-DA预装30分钟，洗涤。加入过氧化氢(175μΜ)，并在指定的时间点测定ROS含量的荧光强度。**P<0.01，***p<0.001，相对比较于在不存在过氧化氢的星形胶质细胞的ROS含量。结果示于图39A。

预装星形胶质细胞，然后用不同浓度的蓍内酯A或美金刚胺预培养2小时。20小时后测定过氧化氢(175μΜ)溶液和荧光密度。结果代表平均值±两个不同的实验(W＝8)标准误差。***P<0.001。结果示于图39B。结果表明，蓍内酯A降低星形胶质细胞过氧化氢诱导ROS产生。

实施例40、星形胶质细胞中过氧化氢诱导ERK1/2、MEK1、SAPK/JNK和p38的磷酸化

星形胶质细胞用过氧化氢175μΜ处理40分钟之后，蓍内酯A预孵育2小时。通过ELISA测定全部的和磷酸化的MEK1(图40A)，全部的和磷酸化的ERK1/2(图40B)，磷酸化SAPK/JNK(图40C)和磷酸化p38的含量(图40D)。结果是平均值±MEK1和ERK1/2两个实验的标准误差(N＝4)，一个实验的SAPK/JNK和p38(n＝2)。p<0.001。结果表示，蓍内酯A对星形胶质细胞的过氧化氢诱导的ERK1/2、MEK1、SAPK/JNK和p38磷酸化的抑制作用。

实施例41、星形胶质细胞以蓍内酯A处理增加GDNF的转录含量。

星形胶质细胞以蓍内酯A处理24小时。然后提取总RNA。GDNF转录采用实时定量PCR检测。三种技术重复的结果进行归一化到甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，并表示为GDNF转录物的相对量。定量实时PCR是根据“依照需求分析”引子(Applied Biosystems)的流程进行。结果是平均值±实验的中间值三取一(24小时)或两取一(6小时)相同生物学实验的标准偏差。结果示于图41。结果表示，蓍内酯A的处理增加了星形胶质GDNF的转录含量。

实施例42、蓍内酯A下调LPS-初代小鼠脾淋巴细胞的细胞因子分泌激活。

十只初代小鼠通过断头处死。从小鼠中移除脾脏取出脾脏，合并并挤压到单细胞悬浮液。用裂解缓冲液裂解红血球细胞，将细胞洗涤几次，并涂板(5×10⁶细胞/孔/ml)在24孔组织培养板。然后在细胞中的条件培养基将细胞用LPS刺激(5微克/毫升)，当蓍内酯A的存在或不存在时，24小时后收集IL-2，48小时后收集IFNγ，TNF-α，IL-10，IL-12和IL-6用于分析。细胞因子含量通过ELISA在指定的时间点收集的上清液测定。数据代表来自一式两份进行的两个不同实验的平均值±中间值。100％的每个细胞因子：IL-2：210皮克/毫升，IFNγ：1505pg/mL和IL-10：297皮克/毫升。

实施例43、美金刚胺抑制ERK 1/2在星形胶质细胞的过氧化氢诱导磷酸化作用。

星形胶质细胞用175μΜ过氧化氢处理，与美金刚胺2小时40分钟之后预培养。磷酸化的p44/42MAPK的含量用ELISA法测定。结果是平均值±实验(N＝2)的中间值。结果示于图43。结果表明，美金刚胺对星形胶质细胞的ERK1/2的诱导磷酸化的抑制效果。

实施例44、美金刚胺抑制星形胶质细胞过氧化氢诱导的MEK1的磷酸化。

星形细胞用过氧化氢175μΜ处理40分钟，美金刚胺预培养2小时。磷酸化的和全部的MEK1的含量通过ELISA测量。结果是平均值±实验的中间值(N＝2)。结果示于图44。结果表示，美金刚胺抑制星形胶质细胞的MEK1诱导磷酸化。

实施例45、美金刚胺不影响β-类淀粉蛋白_25-35诱导的ERK1/2在N2a神经元细胞的磷酸化。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和美金刚胺共同处理30分钟。提取细胞和磷酸化的ERK1含量/通过特异性ELISA试剂盒测定2。结果是平均值±一个实验(N＝2)的中间值。结果示于图45。结果表明，美金刚胺在不影响的N2a神经元细胞的ERK1/2的β-类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化。

实施例46、美金刚胺下调SAPK/JNK在N2a神经元细胞中β-类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和美金刚共同处理30分钟。提取细胞和磷酸SAPK/JNK的含量通过特异性ELISA试剂盒。结果是平均值±实验的中间值(N＝2)。结果示于图46。结果表明，美金刚胺下调SAPK/JNK在N2a神经元细胞的β-类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化。

实施例47、美金刚胺下调β-类淀粉蛋白_25-35MEK1在N2a神经元细胞诱导的磷酸化，而不影响全部的MEK1的含量。

N2a细胞用β-类淀粉蛋白_25-35和美金刚胺共同处理30分钟。通过特定ELISA试剂盒提取细胞和确定总MEK1磷酸化的含量。结果是平均值±实验的中间值(N＝2)。结果示于图47，结果表明，美金刚胺下调MEK1中的N2a神经元细胞的β-类淀粉蛋白_25-35诱导的磷酸化，而不会影响全部的MEK1的含量。

在本申请中引用的所有专利，专利出版物和非专利出版物都通过引用并入本文。

Claims

1.一种化合物在制备用于治疗患有或易感染一神经退化性病症或一神经炎病症的一哺乳动物的一药物中的应用，其特征在于，所述化合物为3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经退化性病症或神经炎病症为神经元死亡、神经元细胞氧化压力、星形胶质细胞氧化压力或小胶质细胞活化。

3.一种化合物在制备用于治疗患有或易感染一神经退化性病症或一神经炎病症的一哺乳动物的一药物中的应用，其特征在于，所述化合物为3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)，并通过减少免疫细胞分泌一细胞因子的水平来改善或预防所述神经炎病症。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细胞因子选自于由细胞因子IL-6及细胞因子IL-Ιβ组成的群组。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细胞因子IL-6是在下述一种疾病期间分泌的：肾小球肾炎、多发性骨髓瘤，或类风湿。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化合物用于治疗患有或易受一疾病影响的一哺乳动物，所述化合物通过影响所述神经退化性病症或所述神经炎病症以改善或预防所述疾病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述影响包括抑制一选自于由细胞外讯息调节激酶1/2(ERK 1/2)、促分裂原活化蛋白激酶(MEK1)、应力活化蛋白激酶/c-Jun N端蛋白质激酶(SAPK/JNK)以及环磷酸腺苷反应组件结合蛋白(CREB)组成的群组的因子的磷酸化。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述作用为减少活性氧簇(ROS)的含量。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述活性氧簇为β-类淀粉蛋白诱发的或为麸胺酸诱发的活性氧簇。

10.一种组合物，用于制备用于治疗患有或易感染一神经退化性病症或一神经炎病症的一哺乳动物的一药物，其特征在于，包括：具有3,5,4'-三羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(TTF)的化合物，以及包括蓍内酯A。