CN111812238A - 一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法 - Google Patents

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张枢
石海兵
李玉杰
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Abstract

本发明提供了一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法，主要步骤包括将生物样品在冰浴避光条件下融化后，涡旋混匀，吸取样品至离心管后在样品中加入氨水，涡旋，再加入特利加压素内标，涡旋均匀，活化96孔板，再转移前述样品至96孔板中，然后依次用氨水、甲醇和乙酸甲醇淋洗，最后用TFA甲醇洗脱两次，收集洗脱液于新的96孔板，将洗脱液吹干，再用甲醇水溶液复溶、涡旋后，进样分析。该方法处理速度快、成本低、方法简便、易于推广，能够有效解决加压素及其类似物检测过程中由于所含杂质过多降低色谱检测分析的准确度的问题。

Description

一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，更具体地涉及一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法。
背景技术
加压素(Vasopressin，AVP)属于神经垂体激素，又称后叶加压素或血管升压素，是由下丘脑的视上神经细胞产生的由九个氨基酸残基组成的环状肽类激素，其理论分子量为1084.24。加压素有两种受体V1和V2。V1主要分布在血管平滑肌细胞膜上，通过受体-G蛋白-第二信使途径发挥作用，使血管收缩，血压升高。V2在肾脏远端小管和集合管上皮细胞，生理剂量可以促进肾脏远端小管和集合管对水的重吸收，发挥抗利尿作用。鉴于上述功能，加压素在临床上主要用于尿崩症、食管静脉曲张出血的治疗，也用于中枢性尿崩症、肾性尿崩症和精神性烦渴的鉴别诊断。加压素类似物具有与加压素相似的结构和功能，目前，已经广泛应用的加压素类似物主要有醋酸去氨加压素、缩宫素、苯赖加压素、赖氨加压素、特利加压素等。
对于加压素及其类似物的检测，主要是通过利用化学分析的手段，测定经合成的加压素及其类似物中残留相应的中间体或杂质，以达到分离杂质、精准控制质量等方面的要求，从而避免药效的降低及可能存在的用药安全隐患。通常采用的检测方法为高效液相色谱法和超高效液相色谱法。但是现有技术往往忽视对加压素及其类似物生物样品的前处理过程，没有经过适当前处理的样品在进样分析后，会对色谱分析结果产生一定程度的影响，降低色谱检测分析的准确度。而现有技术中的样品即使经过前处理，也由于前处理方法过程过于复杂，延长了检测时间，同时仍然存在样品处理效果欠佳，影响检测准确度的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种处理速度快、成本低、方法简便、易于推广的加压素及其类似物的生物样品前处理方法，能够有效解决加压素及其类似物检测过程中由于所含杂质过多降低色谱检测分析的准确度的问题。
基于上述问题，发明人提供了一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将生物样品在冰浴避光条件下融化后，涡旋混匀；
(2)吸取500μL样品至1.5mL离心管；
(3)在样品中加入625μL浓度为0.1％的氨水，涡旋2min，再加入15μL特利加压素内标，涡旋均匀；
(4)按顺序依次用500μL浓度为100％的甲醇和500μL纯水活化96孔板，再转移前述样品至96孔板中，然后依次用1mL浓度为2.0％的氨水、1mL浓度为100％的甲醇和1ml浓度为0.1％的乙酸甲醇淋洗，最后用500μL浓度为5.0％的TFA甲醇洗脱两次，收集洗脱液于新的96孔板；
(5)将洗脱液吹干，再用100μL浓度为20％的甲醇水溶液复溶，涡旋5min后，进样分析。
在一个优选的实施例中，所述步骤(2)中的样品为校正标样、质控样品或待测样品。
在一个优选的实施例中，当所述步骤(3)中的样品为双空白样品时，用15μL浓度为50％的甲醇水溶液代替特利加压素内标。
在一个优选的实施例中，所述步骤(4)中，96孔板为WCX SPE 96-孔板。
在一个优选的实施例中，所述步骤(5)中，用氮气将洗脱液吹干。
本发明提供的加压素及其类似物的生物样品前处理方法的技术优势在于：
(1)本发明的方法能够有效解决加压素及其类似物检测过程中由于所含杂质过多降低检测分析的准确度的问题。
(2)本发明的方法节省溶剂，降低成本，操作安全简易。
(3)本发明的方法处理速度快，处理条件温和，有效保护了样品中待测物加压素及其类似物的生物活性，处理后的样品可大通量用于液相、液质联用等检测方法。
附图说明
图1为加压素类似物的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不限于本发明的保护范围。
实施例1生物样品前处理
(1)将含特利加压素的生物样品在冰浴避光条件下融化后，涡旋混匀；
(2)吸取500μL样品至1.5mL离心管，所述样品为校正标样、质控样品或待测样品；
(3)在样品中加入625μL浓度为0.1％的氨水，涡旋2min，再加入15μL特利加压素内标，涡旋均匀，当样品为双空白样品时，用15μL浓度为50％的甲醇水溶液代替特利加压素内标；
(4)按顺序依次用500μL浓度为100％的甲醇和500μL纯水活化WCX SPE 96-孔板，再转移前述样品至WCX SPE 96-孔板中，然后依次用1mL浓度为2.0％的氨水、1mL浓度为100％的甲醇和1ml浓度为0.1％的乙酸甲醇淋洗，最后用500μL浓度为5.0％的TFA甲醇洗脱两次，收集洗脱液于新的WCX SPE96-孔板；
(5)用氮气将洗脱液吹干，再用100μL浓度为20％的甲醇水溶液复溶，涡旋5min后，进样分析。
(6)液质联用检测
仪器及耗材：超高效液相色谱仪、6500QTRAP质谱仪；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq(150mm×4.6mm,5μm)；试剂：甲醇、氨水、甲酸铵均购于Thermo Fisher。
流速：0.35mL/min；柱温：45℃；进样体积：10μL；
流动相A：5mM甲酸铵-0.1％氨水溶液；
流动相B：甲醇。
利用本发明的加压素及其类似物的生物样品前处理方法对生物样品进行前处理，再结合UPLC或液质联用检测，可有效去除生物样品中各类杂质成分，进一步提高了检测的精确性和检测速度。
虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作出了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以作出的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种加压素及其类似物的生物样品前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将生物样品在冰浴避光条件下融化后，涡旋混匀；
(2)吸取500μL样品至1.5mL离心管；
(3)在样品中加入625μL浓度为0.1％的氨水，涡旋2min，再加入15μL特利加压素内标，涡旋均匀；
(4)按顺序依次用500μL浓度为100％的甲醇和500μL纯水活化96孔板，再转移前述样品至96孔板中，然后依次用1mL浓度为2.0％的氨水、1mL浓度为100％的甲醇和1ml浓度为0.1％的乙酸甲醇淋洗，最后用500μL浓度为5.0％的TFA甲醇洗脱两次，收集洗脱液于新的96孔板；
(5)将洗脱液吹干，再用100μL浓度为20％的甲醇水溶液复溶，涡旋5min后，进样分析。
2.根据权利要求1所述的加压素及其类似物的生物样品前处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中的样品为校正标样、质控样品或待测样品。
3.根据权利要求1所述的加压素及其类似物的生物样品前处理方法，其特征在于：当所述步骤(3)中的样品为双空白样品时，用15μL浓度为50％的甲醇水溶液代替特利加压素内标。
4.根据权利要求1所述的加压素及其类似物的生物样品前处理方法，其特征在于：所述步骤(4)中，96孔板为WCX SPE 96-孔板。
5.根据权利要求1所述的加压素及其类似物的生物样品前处理方法，其特征在于：所述步骤(5)中，用氮气将洗脱液吹干。
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