CN111728967A

CN111728967A - 穿心莲内酯在抑制破骨细胞形成及其活化中的应用

Info

Publication number: CN111728967A
Application number: CN201910228568.1A
Authority: CN
Inventors: 管敏; 黄童龄
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2020-10-02
Also published as: WO2020192232A1

Abstract

本发明为穿心莲内酯在抑制破骨细胞形成及其活化中的应用，公开了一种作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂和药物中的应用。同时公开了一种含有有效剂量的穿心莲内酯的药物以及一种抑制破骨细胞形成的方法、抑制ERRa/PGC1‑β诱导的GLS启动子活性的方法。本发明披露了穿心莲内酯能够抑制破骨细胞形成和其活化，能改善骨量丢失情况，最终起到防治骨质疏松等骨丢失疾病的作用。另外，由于穿心莲内酯是天然物质，疗效好、毒副作用小。

Description

穿心莲内酯在抑制破骨细胞形成及其活化中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体的是涉及一种穿心莲内酯在抑制破骨细胞形成及其活化中的应用。

背景技术

骨支持人体的肌肉或器官并通过包围内脏保护它们免受外来的冲击。骨是人体的重要部分，其不仅储存体内的钙，而且还储存必要的无机物质诸如磷或镁。成年人的老的骨基质被去除并替换为新的骨基质。通过重复的再吸收和破坏过程也即是骨重新塑造来保持骨产生的平衡。

经现有文献记载，有两种类型的细胞与骨重新塑造有关。一种是负责构建骨的成骨细胞，另一种是负责破坏骨的破骨细胞。也即是在正常情况下，骨骼稳态的形成和维持依赖于由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡。在个体的生命过程中，这种动态平衡在整体水平上受遗传、免疫、内分泌、代谢和营养的影响；组织细胞水平上，受干细胞、成骨细胞、破骨细胞以及骨细胞等细胞的功能状态的调控；在分子水平，受到关键信号分子通路的调节。生理状态下，各个层次、各个环节相互联系、相互调节，共同维持骨骼稳态，其中任何一个环节出现问题均有可能引起骨骼失稳、骨密度降低，最终引起骨质疏松。

目前临床上治疗骨质疏松的药物主要分为促进骨形成药和抑制骨吸收药两种类型。促进骨形成药主要包括甲状旁腺激素及其类似化合物、维生素D及其衍生物、锶盐等；抑制骨吸收药物包括雌激素类、降钙素以及双磷酸盐类等。但是经临床研究发现，当前的临床治疗骨质疏松的药物效果都不是特别理想，而且副作用比较多，目前发现的主要副作用包括静脉血栓、低血钙、甲状腺功能亢进，食道及消化道副作用，在治疗的同时给病人身心都带来了巨大痛苦。由于中药具有整体调治、疗效好、毒副作用小等优点，目前，研究人员正在探索如何利用现代技术来筛选高效低毒的中药来治疗骨质疏松疾病。常用的中药主要有淫羊藿、补骨脂、当归、骨碎补等。

穿心莲为爵床科植物[Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees]干燥的地上部分，为常用中药，具有清热解毒、凉血消肿的功效，临床上多用于上呼吸道感染，急性痢疾、胃肠炎、感冒发热等的治疗。穿心莲内酯是穿心莲的主要化学成分之一。然而，至今没有发现穿心莲内酯用于防治骨缺失疾病中应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种穿心莲内酯作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂和制备预防/治疗骨性疾病药物中的应用穿心莲内酯的应用，以解决当前穿心莲常用于清热解毒、凉血消肿和现有治疗骨质疏松的药物效果都不是特别理想，而且副作用比较多的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了穿心莲内酯的一种应用方法。所述穿心莲内酯作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂的应用。

本发明的另一方面，提供了穿心莲内酯在制备预防/治疗骨性疾病药物中的应用。

本发明的再一方面，提供了一种预防/治疗骨性疾病的药物。所述预防/治疗骨性疾病的药物包括有效计量的穿心莲内酯。

本发明的又一方面，提供了一种抑制破骨细胞形成的方法。所述抑制破骨细胞形成的方法包括将有效计量的穿心莲内酯或本发明预防/治疗骨性疾病的药物与破骨细胞前体细胞接触的步骤。

同时，还提供了一种抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的方法。所述抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的方法包括将有效计量的穿心莲内酯或本发明预防/治疗骨性疾病的药物与细胞接触的步骤。

与现有技术相比，本发明穿心莲内酯的应用具有以下有益效果：

经实验证明，所述穿心莲内酯具有相对较强的抑制破骨细胞形成和活化等至少一种的功能，因此，将所述穿心莲内酯作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂后，能够有效实现抑制破骨细胞分化、形成及其活化等作用。

本发明穿心莲内酯用于在制备预防/治疗骨性疾病药物中的应用后以及基于其应用制备的预防/治疗骨性疾病的药物能够用于抑制破骨细胞的分化和成熟，并能够显著降低破骨细胞分化相关基因的表达，而且能改善骨量丢失情况，最终起到防治骨质疏松等骨丢失疾病的作用。另外，由于穿心莲内酯是天然物质，疗效好、毒副作用小。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为不同浓度的穿心莲内酯抑制小鼠骨髓单核细胞破骨分化后的染色照片和破骨细胞数量柱状图，其中，图1-A为诱导第5天时采用TRAP染色后的阴性对照组(Control组)、阳性对照组(RANKL组)、穿心莲内酯0.5μM、1μM、 2μM和5μM组照片；图1-B为诱导第5天时破骨细胞数量柱状图；且图1-B 中的***P<0.001vs Control，##P<0.01vs RANKL；

图2为穿心莲内酯抑制破骨细胞分化相关基因表达的水平图，其中，图2-A 为阴性对照组、阳性对照组和0.2μm穿心莲内酯组对破骨细胞ERRa基因表达水平的柱状图；图2-B为阴性对照组、阳性对照组和0.2μm穿心莲内酯组对破骨细胞PGC-1β基因表达水平的柱状图；图2-C为阴性对照组、阳性对照组和 0.2μm穿心莲内酯组对破骨细胞GLS基因表达水平的柱状图；图2-D为阴性对照组、阳性对照组和0.2μm穿心莲内酯组对破骨细胞TRAP基因表达水平的柱状图；图E为阴性对照组、阳性对照组和0.2μm穿心莲内酯组对破骨细胞CTSK基因表达水平的柱状图；且图2-A-E中的*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs Con， #P<0.05,##P<0.01vs RANKL；

图3为穿心莲内酯抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的柱状图，其中，图3中的***P<0.001vs Con，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vs DMSO；

图4为穿心莲内酯对于高脂肪饮食诱导的雄性小鼠骨质疏松骨量丢失、骨密度、血清内1型胶原羧基末端肽的酶活力图；其中，图4-A为普通组(CD)、高脂组(HFD)和高脂加穿心莲内酯组(HFD+AP)小鼠骨照片；图4-B为普通组(CD)、高脂组(HFD)和高脂加穿心莲内酯组(HFD+AP)小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁的分离度图；图4-C为普通组(CD)、高脂组(HFD)和高脂加穿心莲内酯组(HFD+AP)小鼠血清内1型胶原羧基末端肽的酶活力图；且图4-A-C中的(*P<0.05,**P<0.01vs CD，#P<0.05vs HFD)

图5为穿心莲内酯对于卵巢摘除诱导的雄性小鼠骨质疏松骨量丢失、骨密度、血清内1型胶原羧基末端肽的酶活力图；其中，图5-A为假手术组(sham)、卵巢摘除组(OVX)和卵巢摘除加穿心莲内酯组(OVX+AP)小鼠骨照片；图 5-B为假手术组(sham)、卵巢摘除组(OVX)和卵巢摘除加穿心莲内酯组 (OVX+AP)小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁的分离度图；图 5-C为假手术组(sham)、卵巢摘除组(OVX)和卵巢摘除加穿心莲内酯组(OVX+AP)小鼠血清内1型胶原羧基末端肽的酶活力图；且图5-A-C中的 (**P<0.01,***P<0.001vs sham，#P<0.05vsOVX)。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附表，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

专用名称的解释：

破骨细胞(osteoclast，亦称bone-resorbing cells，OC)：是骨组织成分的一种，来源于单核巨噬细胞谱系，是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞，是人体惟一的骨吸收细胞，行使骨吸收(bone resorption)的功能。其数量和活性的不足或增加分别会导致骨硬化症和骨质疏松及其他溶骨性疾病。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistantacid phosphatase)和组织蛋白酶K(cathepsin K)是破骨细胞主要标志。

ERRα：属于雌激素相关受体，是一类具有持续活化转录活性的孤儿核激素受体。

谷氨酰胺酶(GLS)：位于胞浆、线粒体基质和线粒体膜上，是谷氨酰胺主要代谢途径中的第一个催化酶，需要无机磷酸盐和铵离子作为激活剂，催化谷氨酰胺水解成为谷氨酸和氨，随后转化为α-酮戊二酸进入三羧酸循环,彻底氧化生成大量ATP，并成为TCA循环中其他所需底物和脂肪的碳源。

本发明的发明人基于大量研究发现，穿心莲内酯具有抑制破骨细胞形成及其活化等相关能力，基于此，本发明实施例提供了穿心莲内酯在下文相关方面的应用。

一方面，本发明实施例提供了穿心莲内酯作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂的应用。经发明人构建的相关实验得知，所述穿心莲内酯作为活性成分，能够有效抑制破骨细胞形成及其活化。

如在一实施例中，所述穿心莲内酯具有抑制破骨细胞破骨细胞的分化和成熟的功能，因此，所述穿心莲内酯可以被用于破骨细胞形成抑制剂，以及进一步可以用于制备抑制破骨细胞形成的相关药物。从而有效抑制破骨细胞的分化、成熟，从而平衡破骨细胞与骨细胞，从而改善相应的骨性疾病。

在另一实施例中，所述穿心莲内酯具有抑制破骨细胞分化相关基因表达的功能，因此，所述穿心莲内酯可以被用于破骨细胞分化基因TRAP、CTSK、 ERRa、PGC-1β、Gls的表达抑制剂，以及进一步可以用于制备抑制破骨细胞分化基因TRAP、CTSK、ERRa、PGC-1β、Gls表达的药物。从而有效抑制破骨细胞的分化，从而平衡破骨细胞与骨细胞，从而改善相应的骨性疾病。

在又一实施例中，所述穿心莲内酯具有抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的功能。其中，目前ERRα被认为主要通过与过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α、1β(PGC-1α、PGC-1β)相互作用，共同调控氧化磷酸化通路上的基因的转录，从而调控能量代谢的平衡。近期研究还显示ERRα在破骨细胞的形成和骨吸收功能发挥过程中可能具有重要的调控作用。谷氨酰胺酶 (GLS)除了能催化谷氨酰胺水解成为谷氨酸和氨，随后转化为α-酮戊二酸进入三羧酸循环，彻底氧化生成大量ATP，并成为TCA循环中其他所需底物和脂肪的碳源的同时，在谷氨酰胺代谢的过程中产生的代谢产物，都可以作为细胞增殖的分化的重要物质基础，目前已有报道发现ERRa可以通过调控GLS的表达来调控骨的形成，但是截止目前不清楚GLS在破骨细胞分化过程中的作用。因此，发明人通过构建的相应实验，有效证实了如上述的穿心莲内酯具有抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性信号的功能，具体的如下文实施例 3中构建的临床实验模型，有效证实了穿心莲内酯可以有效抑制由 ERRa/PGC-1β共同介导的GLS启动子活性，同时证实了说明ERRa/PGC-1β共同介导的GLS信号通路参与了破骨分化的过程，因此，进一步证实了穿心莲内酯具有抑制破骨分化的功能。由此，所述穿心莲内酯可以被用于作为 ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性信号路径抑制剂，以及进一步可以用于制备抑制破骨细胞形成的相关药物。从而有效抑制破骨细胞的分化、成熟，从而平衡破骨细胞与骨细胞，从而改善相应的骨性疾病。

在再一实施例中，所述穿心莲内酯具有抑制破骨细胞活化的功能。因此，所述穿心莲内酯可以被用于抑制破骨细胞活化抑制剂，以及进一步可以用于制备抑制破骨细胞活化的相关药物。从而有效抑制破骨细胞的活化，从而抑制破骨细胞的吸骨作用，从而改善相应的骨性疾病。

基于上文所述穿心莲内酯在抑制破骨细胞这一领域中的功能和作用，因此，穿心莲内酯可以被用于制备预防/治疗骨性疾病药物中。这样，在制备的预防/ 治疗骨性疾病药物中，所述穿心莲内酯是作为抑制破骨细胞形成或/和活化的有效成分，其可以抑制破骨细胞的形成，包括分化和成熟，从而实现平衡骨细胞和破骨细胞之间，从而改善相应的骨性疾病；或者直接抑制破骨细胞的活化，从而抑制破骨细胞的骨吸收作用，从而改善相应的骨性疾病。

另外，一实施例中，上文所述的骨性疾病包括原发性骨质疏松、继发性骨质疏松、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失中的至少一种。

其次，上文各实施例中的所述穿心莲内酯可以按照现有常规方法从而穿心莲原药材中提取，当然也可以设计新的提取方法从而穿心莲原药材中提取。

另一方面，基于上文所述穿心莲内酯所具有在抑制破骨细胞方面的功能，本发明实施例还提供了一种预防/治疗骨性疾病的药物。所述药物包括有效计量的具有预防/治疗骨性疾病的活性成分。其中，所述活性成分包括穿心莲内酯，当然，所述活性成分还可以包括能够有效抑制破骨细胞相关性能的其他活性成分，此处所述的“有效”是单独预防或治疗骨性疾病有临床效果的成分，也可以是与穿心莲内酯进行复合后能够提高穿心莲内酯预防或治疗骨性疾病有临床效果的成分。所述“有效剂量”是指能够预防或治疗骨性疾病的有效量，是指足以对个体显示益处或临床意义的穿心莲内酯的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被预防或治疗的疾病的性质和严重性、被预防或治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。如在一实施例中，所述穿心莲内酯的有效计量为30mg/kg-100mg/kg，具体如对小鼠临床实验的有效计量为30mg/kg-100mg/kg。

另外，所述预防/治疗骨性疾病的药物还可以进一步包括药学上可接受的穿心莲内酯的载体成分。所述药学上可接受的穿心莲内酯的载体成分可以根据所述治疗肿瘤的药物给药方式制备的相应剂型的相应载体。如在一实施例中，所述载体包括但不仅仅是玉米油。只要是能够负载所述穿心莲内酯，并有利于其稳定和被吸收的符合医药要求的载体均在本发明公开的范围。因此，依据所述载体的选择，所述药物的剂型可以是口服剂型、注射剂型和外用剂型中的至少一种。

因此，所述预防/治疗骨性疾病的药物由于含有上文的穿心莲内酯，由此，所述药物能够有效抑制破骨细胞形成和活化。具体的如上文所述的，所述穿心莲内酯可以显著抑制破骨细胞的分化和成熟；抑制破骨细胞分化基因TRAP、 CTSK、ERRa、PGC-1β、Gls的表达；抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性；另外可以直接抑制破骨细胞的活化，从而抑制破骨细胞骨吸收作用，能改善骨量丢失情况，最终起到防止骨质疏松的作用。另外，由于穿心莲内酯是天然物质，疗效好、毒副作用小，安全。

又一方面，基于上文所述穿心莲内酯的应用和含有所述穿心莲内酯的药物，一实施例中，本发明实施例提供了一种抑制破骨细胞形成的方法。所述方法包括将有效计量的所述穿心莲内酯或上文所述预防/治疗骨性疾病的药物与破骨细胞前体细胞接触接触的步骤。通过所述方法能够有效抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化、成熟。其中，所述破骨细胞前体细胞可以但不仅仅是单核细胞。

另一实施例中，本发明实施例提供了一种抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS 启动子活性的方法。所述方法包括将有效计量的穿心莲内酯或上文所述预防/ 治疗骨性疾病的药物与细胞接触的步骤。通过所述方法能够有效抑制破骨细胞分化相关基因的表达，从而抑制破骨细胞的形成。

现结合具体实例，对穿心莲内酯用于抑制破骨细胞形成和活化功能等应用进行进一步详细说明。

实施例1：穿心莲内酯对小鼠骨髓单核细胞破骨分化的影响

实验方法如下：

1)取C57BL\6小鼠，脱颈处死，75％酒精浸泡5min；

2)无菌条件下分离两后肢长骨和前肢肱骨；

3)超净台内去除干骺端，用无菌注射器抽取a-MEM培养基反复轻轻冲洗骨髓腔，直到骨髓腔发白；

4)100um细胞过滤器过滤后1200r/min离心5min；

5)弃上清，加入10倍体积的无菌红细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解5min， 1000r/min离心5min，弃红色上清以除去红细胞；

6)用无血清a-MEM培养液重悬沉淀洗涤2次；

7)用含10％FBS、1％PS的a-MEM培养基重悬细胞，接种于25cm²的培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养过夜；

8)收集上清，用无血清a-MEM培养基清洗培养瓶2次，1200r/min离心5min，用含10％FBS、1％PS、30ng/mL M-CSF的a-MEM培养基重悬细胞后按照 3×10⁴/mL接种在96孔板中。

9)实验分为阴性对照组(Control组)只加入40ng/mL M-CSF，阳性对照组 (RANKL组)和药物组均加入40ng/mL M-CSF和100ng/mL RANKL，药物组同时加入穿心莲内酯0.5μM、1μM、2μM和5μM，每组2个复孔，每隔3天换液，诱导第5天时行TRAP染色，在显微镜下观察拍照，并按TRAP阳性且细胞核大于3 个进行计。

结果如图1所示，其中，图1-A为诱导第5天时采用TRAP染色后的阴性对照组(Control组)、阳性对照组(RANKL组)、穿心莲内酯0.5μM、1μM、 2μM和5μM组显微照片；图1-B为诱导第5天时破骨细胞数量柱状图。由图1 可知，有效剂量浓度内，穿心莲内酯浓度依赖性抑制单核细胞向破骨细胞分化。

实施例2：穿心莲内酯对破骨细胞分化相关基因表达的影响

实验方法如下：

按照实例1中的操作提取小鼠原代单核细胞进行破骨分化，将细胞按照 4×10⁵/mL接种在24孔板中，实验按照如下分组：阴性对照组(Control组)只加入40ng/mL M-CSF，阳性对照组(RANKL组)和药物组均加入40ng/mL M-CSF 和100ng/mL RANKL，药物组同时加入2μM的穿心莲内酯，每组3个复孔，诱导 3d后，弃去培养基，用PBS清洗，加入Trizol裂解细胞，提取细胞内总RNA，逆转录制备cDNA，体系如下表示1所示：

表1

反转录PCR条件：

a.反转录反应： 42℃ 60min

b.反转录酶失活： 70℃ 5min

4℃

Realtime PCR采用20μl反应体系，按下列表2中组分配制PCR反应液(反应液在冰上配制)，引物序列如下表3所示：

表2

表3

Real time PCR反应条件如下：

结果如图2所示，由图2可知，2μM的穿心莲内酯可以明显抑制破骨分化相关基因TRAP、CTSK、ERRa、PGC-1β的表达。

实施例3.检测穿心莲内酯对于ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的影响

实验方法如下：

将293T细胞按2×10⁵个/mL接种到96孔板中，待细胞贴壁后，将含有GLS基因启动子的pGL3报告质粒与ERRa，PGC-1β过表达质粒共同转染入细胞，同时转染phRL-TK质粒作为内参质粒，在转染6h后加入不同药物浓度的穿心莲內酯， 18h后进行检测，检测方法如下：

1)弃除培养液，向96孔板中接种细胞的孔中加入100μl PBS清洗一次，操作轻柔，并尽量完全吸出PBS；

2)清洗后加入50μl 1×PLB，室温，摇床上晃动裂解20min，显微镜下观察，确保细胞完全裂解；

3)打开平台电脑和GloMax 96微孔板发光检测仪，打开软件，设置好程序；

4)细胞孔中每孔吸出20μl裂解液到96孔检测白板中，按照检测的顺序向白板孔中滴加30μl萤光素酶底物，将白板放入GloMax 96微孔板发光检测仪中测出萤光素酶活性；

5)检测后，取出白板，再按顺序滴加30μl的1×Stop&Glo底物，放回仪器测出内参phRL-TK海肾萤光素酶活性。

结果如图3所示，由图3可知，穿心莲内酯可以有效抑制由ERRa/PGC-1β共同介导的GLS启动子活性，说明该信号通路参与了破骨分化的过程。

实施例4.检测穿心莲内酯对于高脂肪饮食诱导的雄性小鼠骨质疏松模型的影响

实验方法如下：

将6周龄雄性C57BL/6小鼠分为3组，普通组(CD)、高脂组(HFD) 和高脂加穿心莲内酯组(HFD+AP)。普通组给予普通喂食，高脂组和高脂药组给予高脂饮食。7周后高脂加药组给予高脂饮食的同时每天灌胃给药穿心莲内酯50mg/kg，18周后将小鼠处死，收集血液和骨头样本进行检测。通过 MicroCT分析小鼠的影像学特征，结果如图4所示。由图4可知，穿心莲内酯能够逆转高脂饮食诱导的骨质疏松骨量丢失，如图4-A所示。通过对骨相关参数进行分析，穿心莲内酯对于骨丢失的保护作用主要体现在升高小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量并降低骨小梁的分离度，如图4-B所示。穿心莲内酯还可以显著降低血清内1型胶原羧基末端肽的酶活力，降低破骨吸收能力，如图4-C。

实施例5.检测穿心莲内酯对于双侧卵巢摘除诱导的雌性小鼠骨质疏松模型的影响

实验方法如下：

将7周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为3组，假手术组(sham)、卵巢摘除组(OVX)和卵巢摘除加穿心莲内酯组(OVX+AP)。经小鼠背部做双侧切口后，卵巢摘除组和卵巢摘除加药组切除卵巢，假手术组仅做双侧切口。术后2 周，卵巢摘除加药组每天灌胃给药穿心莲内酯30mg/kg。3周后将小鼠处死，收集血液和骨头样本进行检测。通过MicroCT分析小鼠的影像学特征，结果如图 5所示。由图5可知，可见穿心莲内酯降低卵巢摘除诱导的小鼠骨量丢失，如图5-A。通过对骨相关参数进行分析，穿心莲内酯对于骨丢失的保护作用主要体现在升高小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量并降低骨小梁的分离度，如图5-B。穿心莲内酯还可以显著降低骨吸收标志酶1型胶原羧基末端肽的酶活力，如图5-C。

以上所述的实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳先进技术研究院

<120>穿心莲内酯在抑制破骨细胞形成及其活化中的应用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3 .3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到TRAP基因的编码序列的正向引物

<400> 1

CACTCCCACC CTGAGATTTGT 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到TRAP基因的编码序列的反向引物

<400> 2

CATCGTCTGC ACGGTTCTG 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到CTSK基因的编码序列的正向引物

<400> 3

CTTCCAATAC GTGCAGCAGA 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到CTSK基因的编码序列的反向引物

<400> 4

TCTTCAGGGC TTTCTCGTTC 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到ERRa基因的编码序列的正向引物

<400> 5

CTCAGCTCTC TACCCAAACG C 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到ERRa基因的编码序列的反向引物

<400> 6

CCGCTTGGTG ATCTCACACT C 21

<210> 7

<211>21

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到PGC-1β基因的编码序列的正向引物

<400> 7

TCCTGTAAAA GCCCGGAGTA T 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到PGC-1β基因的编码序列的反向引物

<400> 8

GCTCTGGTAG GGGCAGTGA 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到Gls基因的编码序列的正向引物

<400> 9

GACAACGTCA GATGGTGTCA T 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到Gls基因的编码序列的反引物

<400> 10

TGCTTGTGTC AACAAAACAA TGT- 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到Actin基因的编码序列的正向引物

<400> 11

GGCTGTATTC CCCTCCATCG 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<220>

<223> 人工合成，以用作得到Actin基因的编码序列的反引物

<400> 12

CCAGTTGGTA ACAATGCCAT GT 22

Claims

1.穿心莲内酯作为破骨细胞形成和/或活化抑制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述穿心莲内酯作为破骨细胞的分化和成熟抑制剂的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述穿心莲内酯作为破骨细胞分化基因TRAP、CTSK、ERRa、PGC-1β、Gls表达的抑制剂的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述穿心莲内酯作为ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性抑制剂的应用。

5.穿心莲内酯在制备预防/治疗骨性疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述骨性疾病包括原发性骨质疏松、继发性骨质疏松、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失中的至少一种。

7.一种预防/治疗骨性疾病的药物，其特征在于：包括有效计量的穿心莲内酯。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为口服剂型、注射剂型和外用剂型中的至少一种。

9.一种抑制破骨细胞形成的方法，其特征在于：包括将有效计量的穿心莲内酯或权利要求7-8任一所述的药物与破骨细胞前体细胞接触的步骤。

10.一种抑制ERRa/PGC1-β诱导的GLS启动子活性的方法，其特征在于：包括将有效计量的穿心莲内酯或权利要求7-8任一所述的药物与细胞接触的步骤。