CN1243020C - 促心激素在肝病中的应用 - Google Patents
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Abstract
促心激素在肝病中的应用。本发明描述了促心激素(CT-1)在肝再生过程表达量的增加，其与肝细胞的最大增殖一致，并描述了CT-1作为肝再生刺激物的作用。另外，描述了CT-1在各种类型的急性肝损伤中的肝保护作用。证实了CT-1用于制造在治疗肝病中使用的组合物过程中的重要性。本发明以各种形式和方法描述了该应用，包括重组蛋白和编码CT-1的基因序列的应用。
Description
发明领域
本发明涉及促心激素(cardiotrophin)(CT-1)在刺激肝再生和保护肝细胞抵抗编程性细胞死亡和坏死方面的应用。因此本发明涉及促心激素用于治疗急性、亚急性、爆发性和慢性肝炎及治疗肝硬化，以及用于促进肝切除术，肝移植后的肝再生及用于刺激培养中的肝细胞或肝细胞前体的增殖和营养的应用。
技术状态
人与动物的肝脏均具有调控其生长和重量的独特能力。如果某种有害试剂损害了部分肝实质，则存活的肝细胞能够进行复制，从而替代损伤的实质。如果病毒性、毒性、免疫原性或代谢来源的肝切除术或肝细胞损伤影响了实质的绝大部分，以至于超过残留肝组织的再生能力，则将发展为致命性的肝功能不全。目前，没有任何具有肝保护和刺激再生作用的药物可用于治疗急性或慢性肝功能不全。因此迫切需要并且这点很重要，即肝脏学所用的陈列的药物应包括这些指示性的治疗产物。肝保护试剂是一种能够保护肝细胞抵抗各种可对肝细胞造成毒性和/或损害并最终导致坏死或编程性细胞死亡的刺激的产物或活性成分。因此，无论何时诱导肝损害，给药合适剂量的肝保护试剂将提高肝细胞存活，其利于肝再生、有助于肝功能正常化，而且在极端情况下可挽救患者的生命。肝损伤由毒性试剂(包括醇)、病毒、自免疫疾病、局部缺血、局部缺血/再灌注(如肝移植中移植肝中诱导的损伤)及一般由任何炎症所诱导。一种好的肝保护试剂将排除或降低那些情况中肝损伤的发展和肝细胞的死亡。
通过肝再生，我们知道通过正常肝细胞的增殖直到肝脏质量恢复，肝脏的反应以补偿其功能部分(functional mass)的下降(或者组织减少或者细胞丢失)。肝再生在几种临床应用，包括外科手术中的肝切除术(部分肝切除术和通过肝脏供体的肝脏移植)或如上所述的肝损伤情况(毒性试剂、病毒、局部缺血、局部缺血/再灌注等)中起重要作用，刺激肝再生的试剂是一种能够诱导这种肝细胞增殖，辅助降低与功能部分下降有关的死亡率的试剂。
本发明提出促心激素在肝病中的应用。
促心激素(也称为CHF或心脏肥大因子)先前已用于治疗心脏病和神经变性及神经疾病(WO 95/29237)，作为与LIFRβ受体连接的局部炎症调节物(WO 97/30146)，诊断和治疗肿瘤(WO 00/43790)，及治疗肌萎缩性侧索硬化症和帕金森氏症(WO 97/39629)。
本发明并不涉及这些应用的任何一种应用，而是集中在CT-1在可用于治疗肝细胞的治疗药物中的应用，特别是通常作为保护后者抵抗编程性细胞死亡和坏死过程的试剂，及作为刺激肝再生的试剂。
CT-1是一种所谓促神经细胞因子(neuropoietic cytokines)，属于IL-6家族(1)。该家族细胞因子受体由不同亚单位组成，但它们均包括gp130亚单位(2)。家族的某些成员(IL-6和IL-11)可诱导gp130的同型二聚体化(3)，而其他成员，例如白血病抑制因子(LIF)、制瘤素和睫状神经营养因子(CNTF)则诱导gp130亚单位与190kDa的LIF受体的异型二聚体化(4)。CT-1受体包括gp130链、LIF受体的β亚基(LIFRβ)和第三种已知为CT-1受体α亚基的成分(5、6)。后者参与形成三元复合体，赋予CT-1高灵敏度和特异性。CT-1受体的激活诱导产生一系列胞内信号，包括JAK家族的酪氨酸激酶(JAK-1、JAK-2和Tyk2)的早期激活。JAKs的主要效应器是细胞转录因子STATs组(STAT-1和STAT-3；转录的信号转导激活物)。JAKs的激活也通过Ras-MAP激酶途径传导信号，并参与PI3-K(磷脂酰肌醇3-激酶)途径的激活(2)。
由于CT-1在刺激心肌细胞的胚胎发育及保护心肌细胞抵抗由低氧、局部缺氧及局部缺血—再灌注导致的损伤和(8，9，10，11，12)中的作用，因此最初它被鉴定为心肌细胞中的肥大因子(7、8)。而且也描述了它在心力衰竭情况下对心肌层的保护作用(10)。CT-1的其他作用包括促进运动神经元和多巴胺能神经元的存活(13、14)。
参考书目
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发明描述
为了本发明的目的：
i)CT-1的活性部分是指维持本发明所要求的完整蛋白的生理作用的任何CT-1的部分多肽序列。
ii)具有CT-1活性的多肽衍生物是指与天然CT-1同源性大于80％且维持本发明所要求的完整蛋白的生理作用的任何多肽序列。
iii)而且应理解编码i)和ii)中所述的CT-1所述活性部分序列或CT-1的多肽衍生物的多核苷酸序列也包括在本发明中。
iv)促心激素-1或CT-1是指该蛋白的天然形式、任何重组蛋白形式(简单或延迟释放制剂)、任何编码或表达CT-1完整蛋白的多核苷酸形式、或i)、ii)和iii)中所述的任何形式的延伸。
本发明是基于发现CT-1基因在肝实质部分外科肝切除术后的肝再生过程中过量表达，在肝切除48小时后达到最高表达，并与肝细胞达到最大增殖的时间一致。根据该发现，调查了CT-1在肝再生过程中的作用，发现在部分肝切除后用编码CT-1的基因序列转导肝实质显著刺激肝再生，而且在几乎全部肝切除后可以抑制动物死亡。同样，已表明用编码CT-1的序列转导肝脏提供了高度有效的保护肝细胞以抵抗各种肝毒性试剂、显著降低肝细胞编程性细胞死亡/坏死现象。最后，这些发现表明CT-1是一种有效的保护试剂，可使肝细胞抵抗造成细胞死亡的试剂，而且还具有刺激肝再生过程的性质。
因此，本发明提出并要求保护CT-1、或CT-1活性片段、或具有CT-1活性的多肽衍生物、或编码并表达CT-1、CT-1活性片段或具有CT-1活性的多肽衍生物的多核苷酸序列，在制造可用于在部分肝脏外科肝切除后或由化学试剂、生物试剂、炎症或免疫调节物引起的肝损伤后刺激肝再生和另外作为毒性、病毒性、免疫或代谢病因的各种形式急性、亚急性、爆发性或慢性肝炎中酐保护性药物，和用于刺激再生，保护肝细胞并提高在醇性、病毒性、代谢或免疫病因性肝硬化及肝移植中的肝功能的应用。
实施例
1.包含编码CT-1基因序列的腺病毒载体(AdCT-1)
构建包含促心激素-1基因的缺陷型腺病毒(缺失E1和E3)(AdCT-1)，其过程如下详述。以相应于鼠cDNA序列(GenBank登录号为U18366)的核苷酸20-639为PCR探针，从鼠肌肉cDNA文库中筛选得到鼠CT-1的cDNA。将其克隆到pGEM-T/CT-1载体中，并通过测序进行验证。然后，将CT-1的cDNA克隆到pKS载体中，得到pKS-CT-1，它包含一个由劳斯肉瘤病毒启动子(GenBank M83237的RSV核苷酸4526-5108)、神经生长因子信号肽(GenBank V00836的NGF核苷酸298-378)、鼠CT-1的cDNA(GenBank U18366的核苷酸20-639)及SV40聚腺苷酸化信号(GenBank NC0016691的核苷酸2546-2775)组成的表达盒。该表达盒通过BamHI/SalI从pKS-CT-1质粒中切除，并在HinfI位点连接到pGy63腺病毒穿梭质粒中，得到pGy63-CT-1质粒。该质粒pGY63-CT-1包含腺病毒左臂ITR(反向末端重复)、包装信号(ps)及部分pIX基因，在后二者之间是CT-1表达盒。该质粒pGY63-CT-1与包含用于同源整合的腺病毒基因组的pXL2689一起共转化电感受态大肠杆菌SF800细胞。正确的重组子用PacI进行消化，并转染293细胞(用腺病毒5的DNA转化的人胚胎肾细胞，ATCC参考号为CRL-1573)，以生产腺病毒。AdCT-1的结构如图1所示。大肠杆菌转化株于2001年9月12日保存在巴伦西亚大学(Burjasot，巴伦西亚，西班牙)的西班牙典型培养物保藏中心(CECT)(大肠杆菌PKSCT1，CECT号为5980)。
使用细胞293，并用含有重组腺病毒的上清感染来用于生产腺病毒储液。首先将大约80％汇合的293细胞接种在6孔板中，以2％DMEM为培养基。几小时后，除去培养基，用0.5μl包含稀释在3ml DEMEM中的重组腺病毒上清感染细胞。37温育1小时后，除去接种物，加入4ml琼脂。细胞在37培养5到7天。用巴斯德移液管，从单层细胞中形成的病毒斑中收集病毒样品；将琼脂柱在500μl含有2％胎牛血清的DMEM中重悬，并贮存在-80。为了鉴定重组腺病毒，将293细胞接种到12孔板中，然后用250μl先前分离的病毒进行感染。当开始观察到致细胞病变效应时，再次从各孔中独立收集细胞。随后，细胞反复冻融3次，使它们裂解并释放最大量的病毒颗粒。来自每个系列的细胞裂解物在1500rpm离心10分钟。包含病毒的上清再次用于感染培养在6孔板中的293细胞。当细胞开始表现为圆形时，立即收集上清，并通过检测所述上清中的病毒DNA和RNA来确定病毒的存在。筛选表现出高水平病毒表达的上清用于扩增，目的在于构建重组腺病毒的储液。
将293细胞在150-mm培养皿中进行培养(50到100个培养皿)，并用来源于储液的M.O.I.为10(10个蚀斑形成单位，-pfu-/细胞)腺病毒进行感染。当细胞表现出细胞致病变效应时进行收集，1500rpm离心10分钟，重悬在0.1M Tris(pH8)中，并在-80冻存至下一步纯化。
重组腺病毒通过氯化铯梯度进行纯化。为了这个目的，将贮存在-80的细胞重悬在0.01M Tris中，用5％氧脱胆酸钠以1/10比例(v/v)处理30分钟。然后，用预冷的手动玻璃匀浆器破碎细胞，直到获得半液体溶液为止。随后，将细胞提取物加到饱和的氯化铯溶液中，维持每10ml细胞提取物加5.8ml氯化铯溶液的比例。该混合物在特定的热封polyhalomer管(Quick-seal，Beckman Instruments，CA，美国)中制备。用Beckman50Ti固定角转子以35,000rpm在4离心16-20小时。用无菌针头和注射器收集对应于病毒的条带，然后在相同条件下进行第二次离心。当条带被萃取后，用0.01M Tris pH8在4进行透析，共透析两次，每次1.5小时。将等分试样的病毒制剂放在含10％(v/v)无菌甘油(ICN，美国)的瓶中，冻存在液氮中备用。
为了测定纯化的重组腺病毒的感染滴度，在96孔板中进行有限稀释测试。该测试是基于研究病毒施加给293细胞的细胞致病变效应，其测定能够感染并在293细胞中增殖的病毒悬液的最大十进制稀释度。293细胞以每孔104个细胞预先接种到96-孔板中。然后，从培养孔中除去培养基，并用渐进稀释的腺病毒以每孔50μl体积感染细胞，实验进行两个重复，6小时后，加入150μl新鲜DMEM培养基，最后，细胞在37培养最多7天。这段时间后，估测病毒对细胞的致细胞病变效应的存在。在将具有细胞致病变效应的细胞数与可以观察到该效应的最大稀释度相乘，并将结果除以评估的总体积(0.05ml)后确定滴度，从而确定每ml蚀斑形成单位(pfu)的数目。对每个样品的测定至少重复三次。
2.CT-1，重组蛋白
通过用EcoRI消化pGEM-T/CT-1质粒而获得编码CT-1的cDNA，并克隆到pET28b载体(Novagen)中(pET28b/CT-1)。该载体提供一个编码一系列组氨酸残基(1kDa)的序列，它与克隆的cDNA同相翻译而产生一个融合蛋白，其氨基末端是1kDa的组氨酸尾，之后是CT-1，二者之间是凝血酶切割位点。
为了生产该蛋白，由于菌株BL21(DE3)(Novagen，德国，Cat.No.70235)包含一个T7RNA聚合酶可诱导的基因，我们使用其的感受态细菌，它在随后的蛋白生产中是必须的。感受态细菌用先前制备的载体进行转化：即具有克隆的CT-1cDNA的pET14b(pET-14b载体来源于Novagen，Cat.No.69660-3)。由于载体含有对氨苄青霉素抗性的基因，因此转化的细菌在含有氨苄青霉素的LB培养基生长中进行筛选。
为了生产重组CT-1，将转化的细菌在含氨苄青霉素的LB培养基中37培养至600nm处的光密度为0.4。然后用终浓度为0.5mM的IPTG诱导重组蛋白的表达。这样，lac启动子被诱导，结果包含该载体并控制克隆的cDNA表达的T7RNA聚合酶启动子。培养物在相同条件下进一步培养4小时。
为了获得萃取物，一旦细菌已生长，将其在4离心。将沉淀的细菌重悬在10mM Tris/HCl、10％蔗糖、2mM 2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂的缓冲液中。加入溶菌酶，4温育30分钟后，通过超声进行匀浆。这样可能破坏细胞壁而提高提取过程的产量。通过将匀浆100,000g离心90分钟获得胞质提取物。通过对胞质部分进行SDS-PAGE分析来测定蛋白产量。
通过在2ml镍柱上对胞质提取物进行层析而对His-CT-1融合蛋白进行纯化。柱洗涤后，蛋白用1M咪唑进行洗脱。纯蛋白用凝血酶加工并回收CT-1。
3.检测CT-1体内表达的RNA印迹
从鼠肝脏中提取mRNA后，用RNA印迹技术分析肝再生过程中各种细胞因子(肝细胞生长因子HGF；LIF；制瘤素；CNTF；CT-1)的基因表达。通过硫氰酸胍-酚氯仿法提取RNA。RNA印迹分析如我们以前所述进行(15)，用28S的表达作为上样对照，使用对每个待分析基因特异的探针。
4.来源于肝细胞的细胞系的培养
为了体外研究，我们使用一种来源于鼠肝癌的肝细胞系-H35细胞。将细胞在补加10％牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml链霉素及100mg/ml青霉素的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中进行培养。细胞培养物在37在5％CO2气氛中进行培养。
5.从细胞周期和膜联蛋白的表达分析细胞编程性死亡的技术
通过碘化丙锭进行DNA染色的方法分析细胞周期。用0.5μl 50μg/ml碘化丙锭和4KU/ml RNAse(DNA-Prep Coulter试剂盒，Coulter)进行染色前，用50μl 0-1％NP40溶液浸透细胞(0.5×106)。将细胞在37温育20分钟，然后在FACS流式细胞分析仪(FACScalibur cytofluorometer)上进行测定。将碘化丙锭阳性的细胞在排除双连体并使用FL3参数的流式细胞仪(FACScalibur，Becton-Dickinson，美国)的“双连体辨别模式”DDM中进行分析。亚二倍体细胞的频率定义处于编程性细胞死亡的细胞的比例。
定向于细胞外部的磷脂酰丝氨酸的存在是将细胞定义为编程性细胞死亡的参数之一。当细胞被定义为正在进行编程性细胞死亡时，膜联蛋白V通过其能够与存在的朝向细胞膜外部的磷脂酰丝氨酸分子结合而检测凋亡的细胞。细胞(0.5×106)在温育缓冲液中洗涤一次，所述缓冲液包括：140mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgCl2、10mM CaCl2及Hepes。将细胞在100μl温育缓冲液和5μl偶联膜联蛋白V(膜联蛋白-FITC)的荧光素异硫氰酸盐结合物(fluorescein isothiocyanate conjugate)中室温下温育15分钟。随后，细胞用FACS流式细胞仪以FL1参数进行测定。从对膜联蛋白-FITC阳性的细胞比例确定编程性细胞死亡指数。
6.蛋白分析方法
电泳。为了进行蛋白分析，将细胞在裂解缓冲液(20mM Tris pH7.5；150mM NaCl，1mM EGTA，1mM EDTA，1％Triton x-100，2.5mM焦磷酸钠，1mM Na3VO4，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，胃酶抑制剂，10μg/ml胰蛋白酶抑制剂，1mM PMSF)中进行裂解。0.5×106细胞裂解物重悬v/v在迁移缓冲液(125mM Tris-HCl(pH6.8)，10％十二烷基硫酸钠，20％甘油，100mM二硫苏糖醇，0.2％溴酚蓝)中。将蛋白提取样品在100加热5分钟，然后在10％聚丙烯酰氨凝胶中进行电泳。
通过蛋白印迹免疫检测。电泳后，将蛋白在转移缓冲液(25mM Tris，0.2M甘氨酸，20％甲醇，pH8.5)中在电流300mA下转移1小时，使其转移到硝酸纤维素膜上。转移的蛋白用丽春红溶液进行染色以确定转移成功。然后，对膜进行特异蛋白的免疫检测。为此，膜用含2％BSA(白蛋白部分V)的TBS-T温育缓冲液(20mM Tris，137mM NaCl，pH7.6及0.5％Tween 20)封闭1小时。膜用直接抗待测蛋白的特异抗体温育2小时。随后，膜用TBS-T缓冲液洗涤1小时，并再次与蛋白G-HRPO(BIORAD)温育1小时。在TBS-T缓冲液中洗涤几次后，用化学发光试剂(NEN Life Science产品)对膜进行显色，并立刻在预定时间下在超敏胶片(Amersham)上进行曝光。
免疫沉淀。为了免疫沉淀特定蛋白，106细胞裂解物在存在特异抗体和20μl蛋白G-琼脂糖条件下4温育18小时。通过离心分离免疫复合物，在裂解缓冲液中洗涤2次，然后溶解在迁移缓冲液中。随后，样品加热到100，并在10％凝胶中进行电泳迁移。通过蛋白印迹对特定蛋白进行免疫检测。
7.测定DNA合成：检测增殖
将H-35细胞接种到96-孔板中。无血清培养24小时后，用稀释在无血清DMEN中的CT-1(50ng/ml)刺激细胞。与CT-1温育24小时后，用10-μCi/ml[甲基-3H]-胸苷(ICN，Amersham)标记12小时。除去放射性培养基，细胞用100μl胰蛋白酶在37进行分离，并收集到25μl闪烁混合物(scintillation cocktail)(Ecolite；ICN)中。用tri Carb 2900TR闪烁计数器(Packard，Meriden，CT)分析[3H]-胸苷的结合。
8.部分肝切除(75％外科切除)后体内检测肝再生
在Fisher鼠(雄性，重180g)中进行肝再生研究。外科切除75％肝脏，在不同时间(1小时、3小时、6小时、10小时、24小时、48小时、3天、6天和9天)处死鼠。然后取出肝脏样品并分为三部分：组织学检查(固定在甲醛中)，免疫组化检查(固定在OCT)及进行RNA分析(冻存在液氮中)。每次分析最少需4只鼠。分析的肝再生参数是肝脏重量和通过免疫组化测定的细胞增殖的核抗原表达的比例。
8.1.肝再生中CT-1的基因表达
在部分肝切除模型中分析了各种细胞因子(HGF、LIF、制瘤素、CNTF、CT-1)的基因表达，从而研究它们在肝再生中的作用。在该研究中，我们分析了部分肝切除后不同时间(1小时、3小时、6小时、10小时、24小时、48小时、3天、6天和9天)获得的鼠肝脏样品。每组最少包括4只动物。另外，分析了未进行肝切除的健康鼠的肝脏(对照)。通过RNA印迹确定每种细胞因子相应的mRNA水平。这些实验使我们得到一个全新的发现，即CT-1的mRNA水平在肝切除后24和48小时后显著增加(图2和3)，这与如来自实验动物的肝组织样品的免疫组化检测中PCNA表达和肝细胞的5-溴脱氧尿苷(BrdU)整合所证实的肝细胞的最大增殖是一致的。另外，我们发现肝切除10小时后，HGF表达峰超过CT-1转录表达的增加。
8.2.CT-1在部分肝切除后对肝再生的作用
为了研究CT-1在肝再生中的作用，静脉注射剂量为108pfu的腺病毒CT-1(AdCT-1)，或以同样剂量的具有LacZ报告基因的腺病毒(AdLac-Z)作为对照。在48小时后进行75％肝脏外科切除术。按前述相同时间处死鼠。每次分析所用的鼠最少为4只，最多为8只。
给药AdCT-1诱导用AdCT-1处理的鼠中肝脏重量的增加，给药48小时后，与那些用AdLac-Z处理的鼠相比较，二组的肝细胞最大增殖时间(如肝切除后从这些鼠中获得的肝脏样品中通过对PCNA进行免疫染色来证实)有显著差异。肝切除3天和6天后，用AdCT-1处理的鼠其肝脏重量比来自对照鼠的大，虽然在这些时间二组的差异不是统计学上显著的差异(图4)。这些结果表明用CT-1处理的肝脏表现为促进肝再生，因而在肝切除后最初阶段比对照组有更大的重量。但由于自我平衡机制调控肝脏的最终大小，因此最终将与对照组达到类似数值。
9.扩展肝切除后体内检测肝再生(外科切除＞85％)
为了估测CT-1是否能够抑制接受了几乎全部肝切除手术的动物的死亡，在Fischer鼠中进行实验，对其进行超过85％的外科肝切除手术。该实验部分使用两组，每组30只鼠进行实验。一组用AdLac-Z进行静脉处理，而另一组用AdCT-1静脉处理，剂量如前所述。在给药腺病毒48小时之后，进行这种类型的外科肝切除。外科切除存活鼠的数量在AdLac-Z组中降为14只鼠，而那些注射AdCT-1的为13只鼠。这些鼠在扩展外科肝切除后继续检测其长期存活率。
在肝切除1小时后观察到，AdLac-Z组的死亡率为77％，而AdCT-1组不到20％。在肝切除24小时后，用AdLac-Z处理的鼠仅有7％存活，而用AdCT-1处理的鼠存活率为61％；这些差异在统计学上是显著的。在手术4天后这些比例维持在相同的数值(图5)。我们的数据表明CT-1可以抵抗扩展肝切除的死亡率。
10.CT-1抵抗肝细胞的编程性细胞死亡/坏死的体内保护作用。爆发性肝
损伤检测
为了估测CT-1在调控由各种有害试剂引起的肝损伤中的作用，用Balb/c鼠(雄性，重30g)，在三种肝细胞损伤模式中估测肝损伤：i)通过静脉给药100mg/kg伴刀豆球蛋白A-Con-A(Sigma，St，Louis，MO.，美国)引起的损伤；ii)通过结合静脉给药TNFα(Peprotech)(0.5μg/鼠)和腹膜内给药25mg D-半乳糖胺-TNFα/D-Gal(Sigma)引起的损伤；iii)通过静脉给药1.5μg/鼠抗-Fas(Jo2，Pharmingen)引起的损伤。给药Con-A或TNFα/D-Gal或抗-Fas 6小时后，从鼠中采血并将它们处死。
为了测定CT-1对肝损伤的作用，“A”组鼠用盐水溶液处理，“B”组用AdLac-Z(107pfu)处理，“C”组用AdCT-1(107pfu)处理。48小时后，每组以前述3种模式诱导肝损伤。包括一组用盐水血清代替肝炎诱导物处理的鼠作为实验的阴性对照(NC)。每组动物包括5只鼠。6小时后，根据两个参数测定肝损伤程度：通过自动比色检测(Technicon RA-1000，Bayer)测定血清中转氨酶(GPT)，用“原位死细胞检测试剂盒”(RocheDiagnostics GmbH，Indianapolis，IN，美国)通过TUNEL技术在固定在OCT中的肝脏样品中测量编程性细胞死亡。
从每只鼠中取血样，测定转氨酶，然后立即处死动物，将肝脏进行组织学检查(固定在甲醛中)，并通过TUNEL技术进行编程性细胞死亡检查(冻存在OCT中)。
在第一种由给药Con-A诱导的急性肝损伤模式中发现，对照组中的鼠(给药盐水或AdLac-Z的动物)表现出很高的GPT值，而用AdCT-1处理的动物其转氨酶变化很小，它们与对照组的鼠之间的差异非常显著(图6A)。当对肝组织进行TUNEL技术时，我们观察到用AdCT-1处理的鼠的肝样品中不存在编程性细胞死亡，比较而言，在给药Con-A前用盐水血清或AdLac-Z处理的动物有大范围区域的坏死和编程性细胞死亡(图7)。
在第二种由给药抗-Fas单克隆抗体诱导的急性肝损伤模式中，我们再次发现，用AdCT-1处理可抑制肝细胞死亡(图6B)。给药抗-Fas 6小时后，给药AdCT-1的动物中的转氨酶数(figure)在那些用AdCT-1处理的动物中比那些给药盐水血清或AdLac-Z的动物较低(具有统计学上显著差异)。另外，我们通过TUNEL技术和组织学检查发现在肝组织样品中，用AdCT-1处理的鼠与对照组动物相比较，凋亡个体大幅度降低。
CT-1的肝保护作用也在第三种由联合给药TNFα和D-半乳糖胺(TNFα/D-Gal)引起的肝损伤模式中进行估测。肝损伤6小时后，与对照组中的鼠相比较，转氨酶水平和组织学观察表明，用AdCT-1处理的鼠其转氨酶数显著下降，通过TUNEL技术测定的凋亡肝细胞数目也显著下降(图6C)。
这些数据均表明CT-1可以保护肝细胞抵制各种引起肝细胞编程性细胞死亡或坏死的刺激。
11.分析CT-1在细胞周期和来源于细胞系的肝细胞存活方面的作用
利用H35鼠肝脏细胞系，我们调查了重组CT-1作为肝细胞编程性细胞死亡的细胞因子调节物的生物作用。为了检测CT-1刺激，细胞预先无血清培养18小时。CT-1刺激检测在无血清情况下进行。
首先，我们分析了CT-1对这种肝细胞系的细胞周期的作用。细胞周期通过用碘化丙锭对DNA进行染色，然后进行流式细胞分析进行测定。通过去除细胞培养基中的血清4天诱导编程性细胞死亡。结果表明，在这些条件下培养4天，86％H35细胞进入编程性细胞死亡状态。而且发现当CT-1以50ng/ml剂量存在而不存在其他任何共刺激物时，CT-1也能造成H35细胞的编程性细胞死亡起始的显著延迟，表现为约52％细胞中发生编程性细胞死亡(图7)。
将H35细胞培养物在无血清下培养3天后进行类似的实验，然后测定细胞结合偶联其表面FITC(荧光素异硫氰酸盐)的纯化的膜联蛋白的能力。通过流式细胞分析研究膜联蛋白-FITC与H35细胞表面的结合。该实验证明在不存在CT-1时培养的细胞表现为约21％膜联蛋白阳性，那些已用50ng/ml CT-1处理的细胞表现约为12％(图8)。因此这些实验证实在所用剂量下CT-1能够表现出抗编程性细胞死亡作用。
12.分析CT-1对细胞增殖的作用
用H-35细胞系，我们调查了CT-1在肝细胞DNA合成中可能具有的作用。为此，在96-孔板中每孔接种20,000个细胞。为了分析可能的刺激，细胞预先在无血清中培养24小时。CT-1刺激检验在无血清、剂量为50ng/ml下进行24小时。结果表明，在有CT-1时培养的细胞比不使用CT-1的对照细胞表现出更高的DNA合成比例(图9)。因此这些实验证实在所用剂量CT-1能够诱导DNA合成。
13.在来源于肝细胞的细胞系中研究和分析由CT-1诱导的信号途径
CT-1在体内和体外均可以对肝细胞表现出抗凋亡作用的发现使我们研究肝细胞中CT-1受体的刺激中涉及的信号途径。IL-6/LIF细胞因子家族受体的刺激导致属于JAK-1家族的信号递质的立即磷酸化。在不同时间用CT-1刺激H35后，我们对这些细胞全部裂解物用特异抗体(CellSignaling Technology)进行JAK-1的免疫沉淀。使用磷酸化酪氨酸的特异抗体(4G10，Upstate Biotechnology)和蛋白印迹，证实CT-1在5分钟诱导JAK-1分子的酪氨酸磷酸化，信号在60分钟后消失(图10A)。
STAT-3的磷酸化是其中一个所述的经JAK参与的IL-6家族细胞因子信号中涉及的激活途径。其磷酸化的激活在某些情况下与诱导细胞分化有关，而在其他情况下与肥大有关(心肌细胞)。我们用蛋白印迹分析体外用50ng/ml CT-1在不同时间处理的H35裂解物。用磷酸化STAT-3特异抗体(Santa Cruz Biotechnology)表明，CT-1在刺激后5分钟能够开始诱导STAT-3磷酸化，在30分钟达到最大值(图10B)。
其中一个显然参与抑制凋亡信号抑制的途径是PI-3/AKT途径(磷脂酰肌糖(phosphatidinositol)-3激酶/AKT激酶)。PI-3K的激活诱导在丝氨酸475和苏氨酸308通过AKT磷酸化的活化。AKT的激活反过来引起在丝氨酸112和136的BAD的磷酸化。BAD是Bcl-2家族成员，是存活信号的重要调节物。无活性BAD与Bcl-x或Bcl-2蛋白二聚体化，从而中和其抗凋亡活性。BAD的磷酸化导致释放Bcl-2或Bcl-x，其将抑制凋亡途径。因此推测BAD的磷酸化抑制凋亡途径。在本发明中，我们检测了CT-1是否能够在H35中激活该存活途径。在不同时间用50ng/ml CT-1处理细胞后，我们随后获得胞质部分，随后用抗-AKT单克隆抗体(CellSignaling Technology)对AKT进行免疫沉淀。然后，用对在丝氨酸475磷酸化的AKT形式特异的多克隆抗体(Cell Signaling Technology)通过蛋白印迹分析磷酸化AKT的存在。证实CT-1在15和30分钟诱导在丝氨酸475的稳态AKT磷酸化，然后在60分钟消失。因此CT-1在肝细胞系中诱导存活信号(图10C)。
总而言之，CT-能够诱导JAK/STAT信号途径和PI-3K/AKT存活途径。因此由CT-1在肝细胞中诱导的信号级联解释了CT-1如何作为细胞因子经PI-3k/AKT途径发挥抗凋亡作用，而且可能在肝细胞中经JAK/STAT-3途径作为增殖和分化的诱导物。
14.研究和分析AdCT-1在急性肝衰竭的体内模型中诱导的信号途径
为了分析在鼠和鼠中在急性肝损伤的体内模型中观察到的AdCT-1保护作用，已在体外观察到的信号途径似乎参与刺激肝细胞中CT-1受体，这些也在体内模型中进行研究。
如先前已在体外实验中所述，CT-1可以诱导参与存活或抗凋亡的三个基本途径的活化：STAT-3(信号传导物和转录激活物)、PI-3K(磷脂酰肌糖3-OH激酶)/AKT及Erk1/2(胞外调控的激酶)。
a.扩展的肝切除的鼠模型
如实施例9所述的实验(肝切除＞85％)中所证实，在外科切除1小时后观察到最高死亡率(参见图5)。因此，所述实验用3个处理组(AdCT-1、AdLac-Z和盐水)进行重复，但这次在外科切除1小时后处死鼠以得到肝脏样品。
收集的肝脏样品分为3部分用于组织学检验(固定在甲醛中)、免疫组化研究(固定在OCT中)和用于蛋白分析(冻存在液氮中)。从在液氮中冻存的样品，在裂解缓冲液(20mM Tris pH7.5；150mM NaCl；1mM EGTA；1mM EDTA；1％Triton x-100；2.5mM焦磷酸钠；1mMNa3VO4及抗蛋白酶混合物)中获得肝匀浆。通过从Cell SignalingTechnology(Beverly，Massachussetts)获得的特异抗体进行蛋白印迹，在3组鼠中研究信号：用AdCT-1、AdLac-Z及盐水(S)处理。所用抗体是抗-Stat-3、抗-磷酸化的-Stat-3(Stat-3-Y-705)、抗-AKT、抗-磷酸化的AKT(Akt-Ser-473)、抗-Erk1/2、抗-磷酸化的Erk1/2，其同时检测Erk1(Erk1-Thr-202)和Erk2(Erk2-Y-204)的磷酸化形式。这样观察到用AdCT-1处理的鼠肝脏表现出STAT-3、ERK1/2和AKT的磷酸化，相反那些用AdLac-Z和盐水处理的鼠不表现出这一点(图12A)。
另一方面，caspasa-3参与应答很多刺激而进行的编程性细胞死亡，所述刺激包括扩展肝切除(＞85％)。由于这个原因，根据公司提供的检测方案对液氮中收集的部分样品进行caspasa-3活性检测(CaspACE，Promega，Madison，Wisconsin)。观察到，与用AdLac-Z和盐水处理的鼠肝脏相比较，先用AdCT-1处理的鼠肝脏表现出较低的caspasa-3活性(图12B)，因此表面前者中较低的凋亡指数。
前述表明，由AdCT-1在鼠肝损伤中产生的保护作用是由CT-1诱导的抗凋亡信号的级联起始所提供的，从而降低凋亡，如由低caspasa-3活性遭遇所证实。
b.伴刀豆球蛋白A诱导的急性肝损伤的鼠模型
为了研究该模型中的信号，用Con-A(见实施例10)对3个处理组(AdCT-1、AdLac-Z和盐水)重复诱导实验，但这次在给药Con-A 1小时后处死鼠。处死时获得的肝脏样品如上述实施例14a一样进行加工。以相同方式并用相同抗体进行蛋白印迹。
如在图13中所见，用AdCT-1处理诱导AKT和ERK1/2的磷酸化，二者是由CT-1诱导的主要抗凋亡和存活途径。因此，这些结果表明AdCT-1通过激活这些主要的抗凋亡途径而保护鼠抵抗由Con-A诱导的肝损伤。
附图描述
图1是包含编码CT-1序列的AdCT-1腺病毒载体的结构示意图。RSV：劳氏肉瘤病毒启动子；NGF：神经生长因子的肽信号；CT-1：鼠CT-1的cDNA；SV40：SV40病毒聚腺苷酸化信号。被抑制的E1和E3区域显示为黑色。
图2是部分肝切除后，在不同时间获得的鼠肝脏样品中通过RNA印迹检测编码CT-1的mRNA(h＝小时；d＝天)。28S：rRNA，作为上样对照。
图3是图2的RNA印迹中CT-1随时间表达的示意图(h＝小时；d＝天)。纵坐标：光密度的任意单位(CT-1/28S)。
图4是指部分肝切除后，给药AdCT-1或AdLac-Z前及实施部分肝切除后，在不同时间(横坐标；h＝小时，d＝天)鼠肝脏重量比例(纵坐标)。
图5是用AdCT-1或AdLac-Z处理，并在处理48小时后进行肝脏切除的(＞85％)鼠的存活比例(纵坐标)。横坐标：肝切除后的时间(小时)。
图6是来自在鼠中诱导爆发性肝炎的3个模型中，转氨酶GPT的血清水平(纵坐标，SF单位/ml)的示意图，及肝组织的组织学图片(通过TUNEL技术可视凋亡)，所述3个模型：给药伴刀豆球蛋白A，Con-A(图6A)；给药抗-Fas抗体(图6B)；及联合给药TNFα和D-半乳糖胺，TNFα/D-Gal(图6C)。在诱导肝炎前48小时，动物用腺病毒载体(AdCT-1或AdLac-Z)或盐水血清(S)进行处理。阴性对照(NC)相应于给药盐水来代替诱导肝炎试剂的鼠组。
图7是在无CT-1(C＝对照)及存在CT-1(CT-1)时，去除血清后培养1天(顶部)和4天(底部)后，H-35细胞的细胞周期分析。从左到右选择的区域是：DNA少于2n的细胞(凋亡细胞，Apo)；G0-G1期细胞(静息细胞)和S及M期细胞(增殖细胞)。纵坐标：细胞数目。横坐标：DNA含量。
图8是在无CT-1(C＝对照)及存在CT-1(CT-1)时，去除血清3天后，通过流式细胞仪分析膜联蛋白V在H-35细胞中的表达。与不存在CT-1时凋亡细胞为21％相比，用CT-1培养的细胞表现为约12％凋亡细胞。
图9是从结合[3H]胸苷测定的CT-1对细胞增殖作用的分析。结果表明，相对于无处理的对照细胞(C＝对照)来说，用CT-1处理的细胞(CT-1)其增殖比例增加(纵坐标)。
图10是用CT-1培养与细胞温育后，在不同时间取样的H35细胞裂解物中磷酸化信号蛋白(Jak-1-Y、Stat-3-Y-705及AKT-Ser-475)的免疫检测。
A)细胞裂解物与Jak-1特异抗体的免疫沉淀。随后通过与磷酸化酪氨酸特异的抗体进行蛋白印迹，在5分钟观察到Jak-1分子的磷酸化。
B)与磷酸化Stat-3(Stat-3-Y-705)特异的抗体进行蛋白印迹，在处理5分钟观察到阳性。
C)胞质部分与抗-AKT抗体的免疫沉淀，随后与在丝氨酸475磷酸化的AKT形式(AKT-Ser-475)的特异抗体进行蛋白印迹，在15到30分钟观察到诱导反应。
图11是pET-14b载体结构。
图12A是用AdCT-1、AdLac-Z或盐水(S)处理的鼠肝脏中信号蛋白的蛋白印迹，随后进行大于85％的肝切除，在切除1小时后处死。
1a)用磷酸化Stat-3(Stat-3-Y-705)特异抗体进行蛋白印迹
1b)用Stat-3特异抗体进行蛋白印迹以定量总Stat-3
在用AdCT-1处理的鼠中观察到Stat-3的磷酸化。
2a)用磷酸化Erk1和Erk2(Erk1-Thr-202和Erk2-Tyr-204)特异抗体进行蛋白印迹
2b)用Erk1和Erk2特异抗体进行蛋白印迹以定量总Erk1和Erk2
在用AdCT-1处理的鼠中观察到ERK1/2的磷酸化
5)用磷酸化Akt(Akt-Ser473)特异抗体进行蛋白印迹
6)用Akt特异抗体进行蛋白印迹以定量总Akt
在用AdCT-1处理的鼠中观察到Akt的磷酸化。
图12B是已进行扩展肝切除(＞85％)的鼠肝脏中caspase-3活性。样品来自图12A所述试验中使用的肝切除鼠的相同组。图表显示的是相对于健康肝脏，caspasa-3活性增加的倍数。
图13是在给药Con-A诱导肝损伤之前，分别用AdCT-1、AdLac-Z或盐水(S)处理的鼠肝脏中信号蛋白的蛋白印迹。样品在用Con-A诱导1小时后，在处死时进行取样
1a)用磷酸化的Akt(Akt-Ser473)特异抗体进行蛋白印迹
1b)用Akt特异抗体进行蛋白印迹以定量总Akt
在用AdCT-1处理的鼠中观察到Akt的磷酸化。
2a)用磷酸化的Erk1和Erk2(Erk1-Thr-202和Erk2-Tyr-204)特异抗体进行蛋白印迹
2b)用Erk1和Erk2特异抗体进行蛋白印迹以定量总Erk1和Erk2
在用AdCT-1处理的鼠中观察到ERK1/2的磷酸化。
Claims (8)
1.促心激素-1(CT-1)或编码CT-1的多核苷酸序列在制备用于刺激肝再生的组合物中的应用。
2.促心激素-1(CT-1)或编码CT-1的多核苷酸序列在制备用作一种肝保护剂的组合物中的应用。
3.权利要求1的应用，其用于制备用于在外科肝切除术后刺激肝再生的组合物。
4.权利要求1或2任一项的应用，其用于制备用于治疗病毒性的、代谢性的或毒性病原学的急性、亚急性、爆发性或慢性肝炎的组合物。
5.权利要求1或2任一项的应用，其用于制备用于治疗移植肝的肝功能的组合物。
6.权利要求1或2任一项的应用，其用于制备包括具有编码CT-1的多核苷酸序列的病毒载体的组合物。
7.权利要求6的应用，其特征在于所述病毒载体是腺病毒。
8.一种培养肝细胞的方法，其特征在于向培养基中加入CT-1或含有编码CT-1的多核苷酸序列的病毒载体。
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