CN1742574A - 器官保存液及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种器官保存液及其制法和用途，该保存液含有可溶性TNF受体及可溶性IL－1受体或者表达所述受体的载体。应用该保存液可以有效降低器官移植过程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反应，延长移植物的存活时间，提高移植物再宿主体内的存活率，因而可有效地应用于器官移植，包括肾、肝、心脏等重要脏器的移植。
Description
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种用于器官移植的器官保存液及其制备方法和用途。
背景技术
目前，器官移植手术仍然是救治某些疾病的重要手段。然而，在将器官从供体上取下，然后移植到受体，常常需要在一定温度下保存。因此为了延长移植物的存活时间，提高移植物再宿主体内的存活率，人们常常使用器官移植保存液来保存移植器官。由于移植过程中的排斥反应与免疫系统产生的多种因子有关，因此各细胞因子与免疫排斥之间的关系一直是研究重点。
TNF-α和IL-1是介导同种免疫应答的关键因子，在急、慢性同种排斥反应的各个阶段均有TNF-α的合成和释放并介导排斥反应的发生发展；可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)具有中和及拮抗TNF-α的作用，是体内自然存在的TNF-α拮抗剂。sTNFR可有效阻滞TNF-α介导的损伤，美国FDA已批准其(即p75-sTNFR：Ig融合蛋白，商品名Enbrel)作为治疗类风湿关节炎的一线药物而进入临床，但有关sTNFR在移植排斥反应中的作用和效能了解较少。可溶性IL-1受体(sIL-1R)是体内IL-1的天然拮抗剂。sIL-1R在自身免疫性疾病的动物模型，如EAE和自身免疫性糖尿病模型中表现出良好的治疗作用，揭示其在治疗人类自身免疫病方面也具有广阔的应用前景。
目前采用的器官移植保存液如目前常用的器官保存液UW液的成分是
乳糖钾盐 100mmol 胰岛素 100U
KH2PO4 25mmol 青霉素 40U
MgSO4 5mmol 地塞米松 8mg
棉糖 30mmol 别嘌呤醇 1mmol
腺苷 5mmol 羟乙基淀粉 50g
谷胱甘肽 3mmol
UW液的特点有：(a)不含葡萄糖，而用乳糖盐作为非渗透阴离子，加棉糖作为附加的渗透支持。(b)含羟乙基淀粉，作为有效胶体发挥其渗透压力，可以阻止有害的细胞间隙扩大。(c)以磷酸盐预防酸中毒。(d)用谷胱甘肽、别嘌呤醇对抗氧自由基。临床证实UW液可保存胰腺、肾达72小时，保存肝20～24小时。现在，UW液及其各种UW型改良液已在国际上日益广泛应用，有替代Collins类型溶液的明显趋势。
但是目前此类保存液仅是从如何保存组织中细胞的活性，并不能降低器官移植过程中的移植物抗宿主或宿主抗移植物的反应，从而提高器官移植后的存活率。
由于移植器官的保存对于移植手术的成功与否至关重要，因此，本领域迫切需要开发新的器官移植保存液，该保存液不仅可以有效降低器官移植过程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反应，延长移植物的存活时间，和/或可以提高移植物再宿主体内的存活率，从而可有效地应用于包括肾、肝、心脏等重要脏器的移植。
发明内容
本发明的目的就是提供一种器官移植保存液，该保存液不仅可以有效降低器官移植过程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反应，延长移植物的存活时间，和/或可以提高移植物再宿主体内的存活率。
在本发明的第一方面，提供了一种器官保存液，它含有以下组分：
(a)30-300ug/L的可溶性TNF受体或TNF拮抗剂，或者1×109-1014PFU/升表达可溶性TNF受体或TNF拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；
(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂，或者1×109-1014PFU/升表达可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；以及
(c)药学上可接受的稀释剂。
在另一优选例中，所述保存液含有：
(a)30-300ug/L的可溶性TNF受体或TNF拮抗剂，按保存液的总体积计和
(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂，按保存液的总体积计。
在另一优选例中，所述保存液含有以下组分：
(a)1×1010-1013PFU/升表达可溶性TNF受体或TNF拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；
(b)1×1010-1013PFU/升表达可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂的载体，按保存液的总体积计。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：真核表达载体和重组病毒载体。
在另一优选例中，所述的重组病毒载体是选自下组的载体：重组腺病毒、逆转录病毒、重组痘苗病毒、单纯疱疹病毒。
在另一优选例中，所述保存液还含有选自下组的一种或多种添加剂：
(d1)9±0.5克 NaCl；
(d2)20-200克 白蛋白；
(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素选自青霉素、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋霉素；
(d4)25mmol/L KH2PO4；
(d5)5mmol/L MgSO4；
(d6)30mmol/L棉糖；
(d7)3mmol/L谷胱甘肽；
(d8)1mmol/L别嘌呤醇；
(d9)50g/L羟乙基淀粉。
本发明还提供了上述保存液的冻干制剂，即将保存液冻干从而去除水分所形成的冻干制剂。
在本发明的第二方面，提供了本发明上述的器官保存液的用途，它被用于保存待移植的器官和组织。
在本发明的第三方面，提供了一种保存待移植用器官或组织的方法，包括步骤：将本发明所述器官保存液通过动脉灌注于待移植器官或组织，和/或将待移植器官或组织在该保存液中浸泡1小时-10天。
在本发明的第四方面，提供了一种本发明上述的器官保存液的制备方法，包括以下步骤：
混合以下各组分，按1升保存液计算：
(a)1×109-1014PFU表达可溶性TNF受体的重组腺病毒；
(b)1×109-1014PFU表达可溶性IL-1受体的重组腺病毒；
(c)药学上可接受的稀释剂；
从而制得保存液。
在另一优选例中，所述的组分还包括选自下组的一种或多种：
(d1)9±0.5克 NaCl；
(d2)20-200克 白蛋白；
(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素选自青霉素、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋霉素；
(d4)25mmol/L KH2PO4；
(d5)5mmol/L MgSO4；
(d6)30mmol/L棉糖；
(d7)3mmol/L谷胱甘肽；
(d8)1mmol/L别嘌呤醇；
(d9)50g/L羟乙基淀粉。
附图说明
图1显示了本发明一个实例中器官移植保存液对小鼠心脏移植存活期的延长作用。图中，“control”表示对照，“LacZ-heart”表示采用表达LacZ的重组腺病毒处理的小鼠心脏，“sTNFr-sIL-1r-heart”表示采用表达sTNFr的重组腺病毒以及表达sIL-1r的重组腺病毒处理的小鼠心脏。
图2显示了心脏移植后不同时间小鼠外周血sTNFr和sIL-1r的表达。
图3显示了本发明的器官移植保存液抑制移植物浸润细胞(GIC)的同种反应活性。
图4显示了本发明的器官移植保存液抑制移植物浸润细胞(GIC)的同种细胞杀伤活性(CTL)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对器官保存液的各成分进行了筛选，发现当添加适量的可溶性TNF受体或TNF拮抗剂和适量的可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂时，可以有效降低器官移植过程中的宿主抗移植物和移植物抗宿主反应，延长移植物的存活时间，提高移植物再宿主体内的存活率，因而可有效地应用于器官移植，包括肾、肝、心脏等重要脏器的移植。
用于配制本发明器官保存液的各组分都是现有技术中已知的，可用现有技术中常规的方法制备或直接购得。
如本文所用，术语“可溶性TNF受体或TNF拮抗剂”指可溶性肿瘤坏死因子受体p55以及可溶性肿瘤坏死因子受体p75以及抗TNF的单克隆抗体以及可以抑制TNF表达分泌的蛋白质或化合物，代表性的例子包括Genbank登录号为NP 001057.1或NP 001056.1的蛋白质，DNA序列可见登录号BC010140。
在众多文献中也公开了可溶性TNF受体(sTNFR)的序列，表达方法以及相应的载体和宿主细胞。例如US6306820给出了I型和II型sTNFR的氨基酸序列和编码序列。此外，以下文献中也给出了适用于本发明的各种TNF受体(sTNFR)的序列和表达方法：US 6,667,390“Human tumor necrosis factor receptor TR9”；US6,623,941“Nucleic acids encoding human tumor necrosis factor TR20”；US6,607,726“Human tumor necrosis factor receptor TR10”；US6,534,061“Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acidsencoding the same”；US6,509,170“Polynucleotides encoding human tumornecrosis factor delta”；US6,506,882“Antibodies that bind tumor necrosisfactor delta”；US6,506,569“Antibodies to human tumor necrosis factorreceptor TR10”；US6,503,184“Human tumor necrosis factor receptor-likeproteins TR11，TR11SV1 and TR11SV2”；US6,455,040“Tumor necrosis factorreceptor 5”；US6,300,349“Inhibition of tumor necrosis factor alpha”；US6,261,801“Nucleic acids encoding tumor necrosis factor receptor 5”；US6,214,580“Human tumor necrosis factor receptor tr10”；US5,962,478“Inhibition of tumor necrosis factor.alpha.”；US5,945,397“Purified p75(type II)tumor necrosis factor receptorpolypeptides”。这些文献的公开内容全部纳入本文作为参考。
如本文所用，术语“可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂”指白细胞介素1的II型受体或者白细胞介素1的单克隆抗体，以及抑制白细胞介素1表达分泌的蛋白质或化合物，代表性的例子包括Genbank登录号为NP_775465的蛋白质，相应的DNA序列登录号为AY124010。
众多文献中也公开了可溶性IL1受体(sIL-1R)的序列，表达方法以及相应的载体和宿主细胞。例如以下文献中也给出了适用于本发明的各种可溶性IL1受体的序列和生产方法：US5,488,032“Method of using soluble humaninterleukin-1 receptors to suppress inflammation”；US5,464,937“Type IIInterleukin-1 receptors”；US5,350,683“DNA encoding type II interleukin-1receptors”；US5,319,071“Soluble interleukin-1 receptors”；US5,296,592“Process for purifying interleukin-1 receptors”；US5,180,812“Soluble humaninterleukin-1 receptors，compositions and method of use”；US5,081,228“Interleukin-1 receptors”；US4,968,607“Interleukin-1 receptors”。这些文献的公开内容全部纳入本文作为参考。
US可溶性TNF受体或TNF拮抗剂以及可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂可以直接以蛋白形式使用。可溶性TNF受体或TNF拮抗剂的用量通常为30-300ug/L保存液，当含量低于30ug时，保存器官的存活率下降，当含量大于300ug时，保存器官存活时间无明显延长。可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂的用量通常为30-600ug/L保存液，当含量低于0ug时，保存器官的存活率下降，当含量大于600ug时，保存器官存活时间无明显延长。
除了直接使用可溶性TNF受体或TNF拮抗剂以及可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂，也可以使用表达上述受体或拮抗剂的载体(尤其是病毒载体)。优选的病毒载体的例子包括(但并不限于)：重组腺病毒.逆转录病毒.重组痘苗病毒、单纯疱疹病毒。通常，以载体形式使用时，其用量通常为1×109-1014PFU/升保存液。当含量低于1×109PFU/升时，保存器官的存活率下降，当含量大于1014PFU/升保存液，保存器官存活时间无明显延长.
可用于本发明的抗菌素没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：青霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋霉素。
本发明的器官保存液还可含有其他额外的添加剂，例如羟乙基淀粉、白蛋白、谷胱甘肽、别嘌呤醇、棉糖。
可用于本发明的药学上可接受的稀释剂没有特别限制。一种优选的稀释剂是生理盐水，即氯化钠含量为9克/升的无菌水。另一种优选的稀释剂是现有的器官保存液如UW液。
本发明的器官保存液除了可以单独使用，也可与其他器官保存液联用。
本发明的主要优点在于：
(1)可以明显的延长移植器官的存活时间。
(2)提高移植物再宿主体内的存活率，特别适合肾、肝、心脏等重要脏器的移植。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
制备实施例1～5
按表1中所示的配方，将表达可溶性TNF受体的重组腺病毒以及表达可溶性IL-1受体的重组腺病毒按表1的剂量，在4℃条件下加入含2％白蛋白及40U/L青霉素的无菌生理盐水中，分别制得器官移植保存液a、b、c、d和e。
表1 器官移植保存液的配方(按1升保存液计算)
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 表达可溶性TNF受体I型的重组腺病毒(PFU)* | 1.0×109 | 1.0×1010 | 1.0×1011 | 1.0×1012 | 1.0×1014 |
| 表达可溶性IL-1受体II型的重组腺病毒(PFU)** | 1.0×109 | 1.0×1010 | 1.0×1011 | 1.0×1012 | 1.0×1014 |
| 白蛋白(克) | 20 | 50 | 100 | 200 | 50 |
| NaCl(克) | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| 青霉素(克) | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
*表达II型可溶性TNF受体的重组腺病毒用中国专利98126748.3和98126747.5中所述的相同方法制备，不同点仅在于用II型可溶性TNF受体编码序列替换原专利文献方法中的IL12或IL18的编码序列。
**表达可溶性IL-1受体的重组腺病毒用用中国专利98126748.3和98126747.5中所述的相同方法制备，不同点仅在于用IL-1受体(II型)编码序列(AY124010)替换原专利文献方法中的IL12或IL18的编码序列。
测试例
在以下测试例1-4中，首先测试了实施例2中的器官移植保存液b。
测试例1
器官移植保存液对小鼠心脏移植存活期的延长作用
选取雄性，8-12周龄体重在20-25g C57BL/10(H-2B)与BALB/C(H-2K)小鼠作为心脏移植模型，以C57BL/10小鼠为供者，整个手术操作在清洁环境下进行，操作时显微镜放大倍数为10倍。小鼠麻醉后固定在简易手术台，正中切口开腹，显露下腔静脉，注入50U/ml 4℃肝素生理盐水1ml进行全身肝素化及降温，立即沿双侧腋前线整块切除胸前壁，将心脏连同肺部完整切除后，迅速置于4℃乳酸林格氏冰水混合物中，心脏完全停跳后，游离、结扎下腔静脉、上腔静脉及肺静脉(尽量靠近心脏)并于离心端切断。游离左肺动脉至左侧肺门处，切断左肺动脉供装Cuff用，右肺动脉结扎。完全游离主动脉，在无名动脉水平予以切除修整。切除肺叶和多余的组织。为左肺动脉安装0.8mm内径的Cuff，用10-0的缝线固定，将0～4℃新型器官移植用器官保存液0.5ml经动脉缓慢灌注，孵育1小时后，移植给受者。以BALB/C小鼠为受者，受者小鼠麻醉后固定在简易手术台上，采用纵行切口，上至下颌骨下至锁骨，暴露右侧颈部。切除下颌腺体及部分切除胸锁乳突肌，游离右侧颈外静脉，结扎后，近心端用血管夹封闭血流，近结扎端切断，50U/ml肝素生理盐水冲洗。尽可能游离颈内动脉，远心端结扎后，近心端用血管夹阻断血流，于结扎点的近心端切断，50U/ml肝素生理盐水冲洗，安装0.4mm内径的Cuff，用11-0的缝线固定。将供心的装好Cuff的左肺动脉套入受者右侧颈外静脉，10-0的缝线固定，将受者的装好Cuff的颈内动脉套入供心的主动脉，10-0的缝线固定。在热盐水迅速复温的同时，开放血流。开放血流后，大约30秒至1分钟，心脏开始纤颤，并迅速恢复窦性心率。7-0的缝线缝合关闭切口。采用心电图检测移植心脏的存活时间，。如图1所示，灌注保存液组移植心脏的存活明显延长，平均存活天数从对照组和灌注含有表达LacZ重组腺病毒的对照组的9.6±1.4天延长至80.1±29.3天，大约40％的心脏移植物(每组10例)的存活能够超过100天。
测试例2
器官移植保存液灌注小鼠心脏移植后sTNFr以及sIL-1r的表达
在心脏移植后不同时间抽取小鼠静脉血，采用sTNFr和sIL1r ELISA检测试剂盒(购自BioSource Europe S.A公司)检测检测sTNFr和sIL1r的表达。
结果如图2所示，表明在小鼠心脏移植后近2周的时间，可以检测到sTNFr和sIL1r在外周血的表达。
测试例3
器官保存液抑制移植物浸润细胞(GIC)的同种反应活性(MLR)
于移植后第7天，处死各组小鼠，获取移植心脏，浸于浓度为100μg/ml的IV型胶原酶(购于Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)中，37℃消化30分钟。收集细胞，用PBS洗两遍，接着用Percoll细胞分离液进行梯度离心(2000转/分钟×30min)，收集悬于顶层(含消化的间充质细胞和残余心肌细胞)和界面的细胞。洗两遍，用RPMI-1640完全培养基将收获的细胞浓度调至2×106/ml，将收获的移植物浸润细胞(GIC)以不同的比例(分别为2∶1，5∶1，10∶1，20∶1)与γ射线(20Gy)灭活的C57BL/6脾T淋巴细胞作72小时混合培养。混合培养在圆底96孔板内进行，每个比例设为三复孔。在培养的最后的12小时，每孔加入1μCi of[3H]-TdR。用夜闪计数仪(购于Wallac公司)测定[3H]-TdR掺入。结果表示为cpm平均值±SD。
结果发现，移植各组的GIC的数目存在明显差别，保存液组单位移植心脏的GIC数目为5×105±1.2×105，明显低于对照组和LacZ组的5×106±2.2×106，其比例约为1∶10～20左右。LacZ组和未转染组的GIC以T淋巴细胞为主，CD4 +T细胞与CD8 +T细胞的比例为4～5∶1，保存液组的移植物浸润细胞(GIC)T细胞在浸润细胞中的比例明显下降。将不同组的移植物浸润细胞(GIC)与γ射线(20Gy)灭活的供者来源的T淋巴细胞作72小时MLR，结果如图3所示，保存液组的移植物浸润细胞(GIC)增殖受到了明显的抑制，AdmLacZ组和未转染组的GIC显示较强的对同种刺激的增殖活性。
测试例4
保存液抑制移植物浸润细胞(GIC)的同种细胞杀伤活性(CTL)
将新鲜分离的移植物浸润细胞(GIC)用作CTL效应细胞，小鼠EL-4淋巴瘤细胞(H-2b)用作同种抗原特异性靶细胞，小鼠P815乳腺瘤细胞(H-2d)用作同质对照靶细胞。靶细胞用100μCi的51Cr标记30分钟后，作标准的4小时杀伤实验。
结果如图4所示，LacZ组和对照组的移植物浸润细胞(GIC)对同种供者特异性细胞EL-4细胞有明显杀伤活性，保存液组对EL-4表现轻度杀伤性能。
测试例5
在本测试例中，按测试例1-4相同的方法，测试测试了实施例1、3-5中制备的器官移植保存液a、c、d、和e。
结果表明，器官移植保存液a、c、d、和e也具有明显延长移植小鼠心脏存活时间的作用。
讨论：
肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)是多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性。大量的研究证明，TNF-α几乎参与炎症反应的每一个阶段，其效应者功能和机制是多方面的。TNF-α可以提高抗原提呈细胞(APCs)和血管内皮细胞表面的MHC分子及粘附分子的表达，TNF-α可以活化趋化因子，从而进一步活化单核细胞和巨嗜细胞及T细胞，引起淋巴细胞向炎性组织内迁移和浸润。TNF-α对白细胞炎性组织组织内迁移和在正常次级淋巴组织器官内归巢具有不可替代的作用。正常白细胞在所有组织内迁移必须有血液来源的TNF-α的作用，随后组织内的趋化因子的产生依赖于组织细胞表达的TNFR-p55的信号传导。近来的证据表明，TNF-α敲除动物的中枢系统炎症模型中，MCP-1和MIP-1γ的产生是TNF-α存在的结果，使用抗TNF制剂治疗肺炎，可以降低肺内MCP-1、MIP-2和MIP-1α的产生。新近的证据揭示TNF-α和TNFR-p55在外周免疫系统正常发育的优化中扮演重要的角色。TNF-α可视为T细胞自分泌的生长因子，可引起T细胞克隆扩增，同时也是树突状细胞活化和成熟因子。脾DC、T细胞和B细胞在脾脏内的发育正常也需要TNF-α/TNFR-p55通路的调节。
TNF-α是多能的前炎症细胞因子，其生物学功能由存在于所有有核细胞膜表面的两种TNF受体(TNFR1、2)所介导，即TNFR1(TNFR-p55)和TNFR2(TNFR-p75)。TNF-α可通过TNFR-p55的信号传导诱导细胞毒活性。TNF-α/TNFR-p55通路已被证明在T细胞的同种反应活性方面具有重要的调控作用。在TNF-α基因敲除的同种小鼠间进行骨髓移植的研究中，发现缺少TNFR-p55的T细胞可以抑制和降低GVHD的发生。对TNF-α阻滞的体内精确机制的明晰有助于成功的开展TNF-α的拮抗治疗。
与膜表面TNFR相对应，可溶性TNF受体(soluble TNF receptor，sTNFr)也存在两种：p55-sTNFr和p75-sTNFr，可溶性TNF-α受体(sTNFr-p55和sTNFr-p75)是体内TNF-α的天然抑制剂，可中和和阻滞TNF-α的作用，减轻TNF-α引起的进一步损伤。它们与多种疾病，如肿瘤、感染、自身免疫性疾病、移植排斥反应等的诊断和治疗密切相关。
可溶性TNF受体(sTNFr)通过与TNF竞争结合，阻止TNF与细胞表面的TNFR结合，影响TNF与它们的膜结合受体的平衡，，从而竞争抑制TNF的多种生物学功能，参与机体的生理和病理过程。
sTNFr可阻止TNF与细胞表面的TNFR结合，拮抗、阻断TNF的多种生物学活性。sTNFr对TNF的抑制作用可表现在多个方面：在体外，能抑制TNF对肿瘤细胞株L929和WHEI164的细胞毒作用，显著降低TNF诱导产生的PGE2和IL-1的水平；sTNFr对TNF的体内抗肿瘤作用也有抑制作用，例如给荷有Meth肉瘤的小鼠体内注射TNF的同时注射sTNFR，结果使TNF的抗肿瘤效果显著降低。sTNFr的作用有剂量依赖性，高剂量时能显著抑制TNF体外细胞毒作用。两种类型的sTNFr对于TNF-α和TNF-β的拮抗效力存在差别，天然的和重组sTNFr对TNF-α的抑制作用显著强于对TNF-β的作用。另外，两种类型的sTNFr的作用存在差别。据观察发现粒细胞缺乏小鼠经LPS诱导后，3小时左右血清中p75-sTNF水平明显低于正常小鼠，但p55-sTNFr水平却没有变化；同时发现TNF的生物学活性增高，致死剂量的LPS引起的小鼠死亡率随之显著增高。这些结果提示，LPS诱导后小鼠血清中的p75-sTNFr主要来于中性粒细胞，在调节TNF的活性方面p75-sTNFr比p55-sTNFr似乎具有更重要的作用。在体内中性粒细胞是通过产生p75-sTNFr来调节TNF的生物学活性的。
有关sTNFr在移植排斥反应中的作用目前知之甚少，在同种异体移植中的效能尚未证明。但TNF与移植排斥反应的发生及进程密切相关。以往的动物实验和临床研究证明移植排斥发生时TNF水平显著增高，并且参与排斥反应的发生发展。当排斥反应发生时，血清中sTNFr-p55、p75的血清水平明显升高。研究表明，TNF-α在同种免疫应答反应中，可引起T淋巴细胞增殖，Th1型细胞因子生成，对宿主的组织细胞产生细胞毒(CTL)作用并加重系统损伤。TNF-α对TNFR-p55基因敲除小鼠的骨髓移植的研究表明，宿主体内缺乏TNFR-p55(TNFR-p55-/-)的T细胞的存在可以显著减少GVHD的发病率和GVHD引起的宿主死亡。当排斥反应发生时，血清中sTNFr-p55、p75的血清水平明显升高。因此，有人用sTNFr作为观测指标用于移植排斥反应的监测及判断预后。OKT3可应用于肾移植后的急性排斥反应治疗，但可引发严重的毒副作用，部分与TNF的诱生有关。Drge SE等对发生急性排斥反应的肾移植患者应用OKT3治疗时的sTNFr-p55、p75的血清水平进行了检测，发现sTNFr-p55、p75的血清水平与OKT3的治疗有相关性，但不影响患者毒副作用的发生。而Wee S则发现血清sTNFr的升高可降低肾移植患者接受OKT3治疗时细胞因子释放引起的综合症。TNF-α是引起同种排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)的组织损伤的重要因子之一，但TNF-α在T淋巴细胞针对同种抗原的免疫反应中的作用机制尚待阐明。骨髓移植的患者发生并发症时，可见患者血清sTNFr水平明显升高，与并发症有明显的相关性，提示其可作为骨髓移植并发症发生时的监测指标。
在体外的混合淋巴细胞培养(MLR)时，加入TNFR融合蛋白(sTNFR：Fc)可抑制T淋巴细胞的增生及Th1型细胞因子的产生。在存在TNF-α抑制剂的情况下，可以抑制T细胞增生和IFN-γ的产生。中和TNF-α的作用可抑制移同种骨髓移植后的移植物抗白血病(GVL)效应。因此，可以认为阻断TNF-α的作用可以潜在的抑制同种器官移植所引起的同种免疫应答反应中同种反应性T细胞的作用。sTNFr与移植排斥反应的关系尚须进一步加以研究。
细胞介素1(IL-1)是重要的前炎症细胞因子，在激活免疫反应中具有重要作用。IL-1既是树突状细胞(DC)活化的危险信号，又是APC细胞递呈抗原后活化T细胞的关键因子。可溶性IL-1受体(sIL-1R)是IL-1家族成员之一，是体内天然IL-1的拮抗剂。移植物抗宿主病为异源骨髓移植主要并发症，有研究支持移植物抗宿主病是IL-1介导的，通过使用IL-1r拮抗剂抑制IL-1活性可能达到控制移植物抗宿主病的效果。McCarthy等研究表明患移植物抗宿主病的小鼠皮肤表达IL-1 alpha增强，通过使用IL-1r拮抗剂能不影响造血干细胞移植的情况下抑制免疫，降低死亡率。Antin等在I/II期临床试验中，对有类固醇抗性的、急性移植物抗宿主病的17例患者，使用重组的人IL-1r拮抗剂，患者病情随用药逐渐改善，唯一发现的毒性反应是2位患者转氨酶发生可逆升高。
McCarthy等在I/II期临床试验中，对有糖(肾上腺)皮质激素抗性的、患(恶化或顽固)急性移植物抗宿主病的14例患者，使用rhuIL-1R(重组的人IL-1受体)，57％的患者(8位)经过治疗后病情改善，没有患者产生毒性反应。
器官离体后，随着氧供的停止可以引发由超氧离子、自由基和一氧化氮分子和一系列前凋亡事件介导的细胞和组织的降解。在器官保存液(例如UW液或EuroCollins液)的环境下，器官对损伤仍然敏感，初发损伤是引起急慢性排斥反应的重要因素之一。器官再灌注可以引起进一步的损伤，趋化炎性细胞浸润至损伤位点。内皮细胞是缺血再灌注的极其敏感的早期靶目标。缺血再灌注(IRI)的机制包括前炎性细胞因子在炎性位点的释放和中性粒细胞的浸润。前炎症细胞因子TNF-α，IL-1β和激活的补体可趋化中性粒细胞，重组IL-1和TNF-α可模拟内毒素刺激的肝损伤，TNF-α抗体可防止小鼠肝内白细胞浸润。这一现象也可见于人小肠的再灌注时或大鼠肾移植的慢性排斥反应。IL-1受体拮抗蛋白IRAP可阻滞IL-1和其受体的结合，可显著降低内毒素释放、白细胞与内皮的粘附及组织损伤。因此，基因修饰供者器官应用于器官的保存和抗移植排斥将是器官移植领域中另一重要的研究方向。
本发明的上述实验结果证明了，采用携带sIL-1R和sTNFR基因腺病毒作为活性成分的器官移植保存液，具有延长移植物存活时间、减轻宿主抗移植物和移植物抗宿主反应的显著作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种器官保存液，其特征在于，它含有以下组分：
(a)30-300ug/L的可溶性TNF受体或TNF拮抗剂，或者1×109-1014PFU/升表达可溶性TNF受体或TNF拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；
(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂，或者1×109-1014PFU/升表达可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；以及
(c)药学上可接受的稀释剂。
2.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述保存液含有：
(a)30-300ug/L的可溶性TNF受体或TNF拮抗剂，按保存液的总体积计和
(b)30-600ug/L的可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂，按保存液的总体积计。
3.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，它含有以下组分：
(a)1×1010-1013PFU/升表达可溶性TNF受体或TNF拮抗剂的载体，按保存液的总体积计；
(b)1×1010-1013PFU/升表达可溶性IL-1受体或IL-1拮抗剂的载体，按保存液的总体积计。
4.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的载体选自下组：真核表达载体和重组病毒载体。
5.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的重组病毒载体是选自下组的载体：重组腺病毒、逆转录病毒、重组痘苗病毒、单纯疱疹病毒。
6.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，它还含有选自下组的一种或多种添加剂：
(d1)9±0.5克 NaCl；
(d2)20-200克 白蛋白；
(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素选自青霉素、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋霉素；
(d4)25mmol/LKH2PO4；
(d5)5mmol/LMgSO4；
(d6)30mmol/L棉糖；
(d7)3mmol/L谷胱甘肽；
(d8)1mmol/L别嘌呤醇；
(d9)50g/L羟乙基淀粉。
7.如权利要求1所述的器官保存液的用途，其特征在于，用于保存待移植的器官和组织。
8.一种保存待移植用器官或组织的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1所述器官保存液通过动脉灌注于待移植器官或组织，和/或将待移植器官或组织在该保存液中浸泡1小时-10天。
9.一种权利要求1所述的器官保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
混合以下各组分，按1升保存液计算：
(a)1×109-1014PFU表达可溶性TNF受体的重组腺病毒；
(b)1×109-1014PFU表达可溶性IL-1受体的重组腺病毒；
(c)药学上可接受的稀释剂；
从而制得保存液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的组分还包括选自下组的一种或多种：
(d1)9±0.5克 NaCl；
(d2)20-200克 白蛋白；
(d3)40U-4000U/L抗菌素，所述抗菌素选自青霉素、青霉素、庆大霉素、卡那霉素、先锋霉素；
(d4)25mmol/LKH2PO4；
(d5)5mmol/LMgSO4；
(d6)30mmol/L棉糖；
(d7)3mmol/L谷胱甘肽；
(d8)1mmol/L别嘌呤醇；
(d9)50g/L羟乙基淀粉。
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