JP5527549B2 - Ｃ型肝炎治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、新規なＣ型肝炎治療剤に関する。
C型肝炎ウイルス（HCV）は慢性肝疾患の主要な原因であり、肝硬変や肝細胞癌へ進行する。HCV感染は世界的な健康問題であり、その感染者数は1億7000万人を超えると考えられている。HCV遺伝子型1は日本、米国を中心に他の国々でも主要な遺伝子型である。不幸なことにこの遺伝子型のHCVに感染した患者では、現在の標準的な最強治療であるペグインターフェロン・リバビリン併用療法でも50%未満しか治癒しない。これらC型肝炎患者に対するより有効な治療法を開発するため、本願発明者らはHCV全長遺伝子が複製するアッセイ系を開発した（特許文献１）。このアッセイ系により、Ｃ型肝炎に対する治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。このアッセイ系を用いて本願発明者らは高脂血症治療剤のスタチンがHCV遺伝子複製を抑制することを発見した（特許文献１）。さらにこの発見をもとにBaderらは臨床試験を実施し、フラバスタチンがC型肝炎患者で抗HCV活性を示すことを最近報告した（非特許文献１）。
T. Bader , J. Fazili , M. Madhoun , C . Aston , D. Hughes , S. Rizvi , K. Seres , M .Hasan, Fluvastatin inhibits hepatitis C replication in humans, Am. J. Gastroenterol. 103 (2008) 1383-1389.）
上記の通り、Ｃ型肝炎に対する治療効果を有する物質のスクリーニング系は特許文献１に記載されている通り公知であり、このスクリーニングにより、スタチン類がＣ型肝炎治療効果を有することが見出された。しかしながら、スタチン類のＣ型肝炎治療効果は必ずしも満足できるものではない。また、上記スクリーニング系を用いたとしても、この世に無数に存在する物質の中から高いＣ型肝炎治療効果を有する物質を見つけ出すことは容易ではない。
本発明の目的は、高いＣ型肝炎治療効果を有する新規なＣ型肝炎治療剤を提供することである。
本願発明者らは、特許文献１に記載された上記スクリーニング系を用いて鋭意研究した結果、慢性骨髄性白血病治療剤等として用いられているハイドロシキウレアが高いＣ型肝炎治療効果を有することを見出し本発明を完成した。さらに、ハイドロシキウレアが、Ｃ型肝炎治療効果に関しインターフェロンαと相乗効果を発揮することも見出した。
すなわち、本発明は、ハイドロキシウレアを有効成分として含有するＣ型肝炎治療剤を提供する。また、本発明は、該本発明のＣ型肝炎治療剤にインターフェロンαをさらに含むＣ型肝炎治療剤を提供する。さらに、本発明は、ハイドロキシウレアのＣ型肝炎治療剤製造のための使用を提供する。
本発明により、高いＣ型肝炎治療効果を有する新規なＣ型肝炎治療剤が提供された。
上記の通り、本発明のＣ型肝炎治療剤は、ハイドロシキウレア（以下、「HU」と呼ぶことがある）を有効成分として含有する。HU自体は、下記の化学構造を有する周知の化合物であり、その製造方法も周知であり、慢性骨髄性白血病治療薬等として古くから市販されている。本発明においては、市販のHUを好都合に用いることができる。
本発明のＣ型肝炎治療剤は、HUに加え、さらに他の活性成分を含んでいてもよい。例えば、後述の実施例に具体的に記載されるように、HUは、従来からＣ型肝炎治療薬として用いられているインターフェロンαの治療効果を高める効果、すなわち、Ｃ型肝炎治療についてインターフェロンαとの相乗効果を有することが明らかになった。従って、本発明のＣ型肝炎治療剤は、インターフェロンαをさらに含むことが好ましい。なお、医薬として用いられているインターフェロンαとしては、インターフェロンαにポリエチレングリコール鎖を付加して生体内での安定性を高めたペグインターフェロンαが多用されている。本明細書及び本願特許請求の範囲において、「インターフェロンα」という語は、インターフェロンαの活性を有し、生体内での安定性を高めた、ペグインターフェロンαのようなインターフェロンαの安定化誘導体も包含する意味で用いている（ただし、実施例中を除く）。本発明のＣ型肝炎治療剤が含んでいてもよい他の活性成分は、インターフェロンαに限定されるものではなく、例えば、Ｃ型肝炎治療に用いられているリバビリンをさらに添加してもよく、インターフェロンαとリバビリンの両者をさらに含んでいてもよい。
投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の場合には、静脈内投与、筋肉内投与、肝臓又はその周辺への局所投与、経皮投与等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、経口投与が好ましい。剤形は、周知のいずれの剤形であってもよく、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー剤、散剤、スプレー剤、クリーム剤、塗剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁液、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
本発明のＣ型肝炎治療剤は、HU及び場合によっては上記した他の活性成分の他に、製剤のための賦形剤、担体、希釈剤等含んでいてもよく、通常、このような製剤のための成分を含む。これらの成分は製薬分野において周知であり、例えば、乳糖、デンプン、セルロース、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、水等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。さらに、製剤分野において常用されている他の添加剤、例えば、緩衝作用、浸透圧調整のための塩、溶解補助剤、分散剤、安定化剤、酸化防止剤、保存剤、崩壊剤、結合剤、矯味剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤等等の成分を配合しても良い。
投与量は、患者の状態や病歴、重症度、体重、併用する他の活性成分等に応じて適宜設定されるが、通常、成人１日当たりHU量として1mg〜10000mg程度、好ましくは、500mg〜2000mg程度である。また、ペグインターフェロンαと併用する場合、ペグインターフェロンαの投与量も同様に適宜設定されるが、通常、成人１日当たりペグインターフェロンα量として1μg〜1000μg程度、好ましくは、10μg〜200μg程度である。投与期間は、患者の状態を観察しながら適宜設定されるが、通常、1日間〜1500日間程度、特に14日間〜730日間程度である。
本発明のＣ型肝炎治療剤は、Ｃ型急性肝炎、Ｃ型慢性肝炎のいずれに対しても有効である。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明のＣ型肝炎治療剤は、Ｃ型慢性肝炎、とりわけ、難治性Ｃ型慢性肝炎の治療に有効であることが確認されたので、Ｃ型慢性肝炎、とりわけ、難治性Ｃ型慢性肝炎の治療に用いる場合に特に威力を発揮する。なお、「Ｃ型慢性肝炎」とは、Ｃ型肝炎ウイルスが原因で６か月以上持続している肝炎、「難治性Ｃ型肝炎」とは、genotype 1のＣ型肝炎ウイルスが感染しており、HCV RNA量が常法であるTaqMan（商品名）PCR法で5LogIU/ml以上の場合を意味する。
また、下記実施例において具体的に記載するように、特許文献１に記載された細胞を用いるスクリーニング系における、HUによるＣ型肝炎ウイルス(HCV)の50%複製抑制濃度は60μmol/Lであり、市販のＣ型肝炎治療薬であるリバビリンの同濃度（76-126μmol/L）よりも低く、従って、高いＣ型肝炎治療効果を有すると考えられる。さらにヒトのHU許容用量は4時間毎の800mg/mm2の経口投与とされ、その場合、HU血中濃度は2480μmol/Lにも達する。従って、HUは単独で臨床使用できうると考えられる。さらに、下記実施例において具体的に記載するように、インターフェロンαとの併用により、Ｃ型肝炎治療について相乗効果が発揮される。このため、インターフェロンα療法が有効な遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスに感染している場合には、インターフェロンαを併用することにより治療効果がさらに高くなると考えられる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
製剤例１
経口投与用のカプセルの組成の１例として次のものを例示することができる。
HU 500mg
ハイドレアカプセル（ブリストルマイヤーズ） 500mg
経口投与用のカプセルの組成の１例として次のものを例示することができる。
HU 500mg
ハイドレアカプセル（ブリストルマイヤーズ） 500mg
実施例１ HUの抗HCV活性
本願発明者らが開発した、特許文献１記載の細胞を用いたスクリーニング系により、Ｃ型肝炎治療効果を有する化合物をスクリーニングした。
本願発明者らが開発した、特許文献１記載の細胞を用いたスクリーニング系により、Ｃ型肝炎治療効果を有する化合物をスクリーニングした。
スクリーニングに用いた特許文献１記載の細胞は、簡単に述べると次のようなものである。すなわち、ヒト肝癌細胞株HuH-7由来のOc細胞(FERM P-20517)に、HCVゲノム全長、レポーター遺伝子としてのルシフェラーゼ遺伝子、選択マーカー遺伝子としてのネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含むプラスミドを導入したものである。より具体的には、5'末端から、HCVの内部リボソーム侵入部位(IRES)配列、ルシフェラーゼ遺伝子、 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、脳心筋炎ウイルス(encephalomyocarditis virus (EMCV))由来のIRES配列、HCVオープンリーディングフレーム配列、HCV3'非翻訳配列の順に連結されているRNAを含むプラスミドがヒト肝癌細胞株HuH-7由来のOc細胞(FERM P-20517)に導入された細胞(OR6細胞）である。HCVに対する抗ウイルス活性（すなわち、Ｃ型肝炎に対する治療効果）を調べようとする被検化合物を含む培養液中でこのOR6細胞を培養後、細胞のルシフェラーゼ活性を測定する。HCV遺伝子の複製が少ないほど、被検化合物の抗HCV活性が高く、ルシフェラーゼ活性は低くなる。従って、測定されるルシフェラーゼ活性が低いほど、抗HCV活性は高い。特許文献１では、測定されるルシフェラーゼ活性と、HCV RNA量との相関関係が極めて高いことが実験的に確認されており、このスクリーニング系が信頼性の高いものであることが確認されている。
１．材料と方法
(1) 細胞培養と抗ウイルスアッセイ
OR6細胞は、２４ウェル中で培養した（培養液：5%牛胎児血清及びG418付加DMEM培地、温度37℃）。HUとインターフェロンα（以下、「IFNα」)の抗ウイルス効果をモニターするため、まず24ウェルプレートを用いて1ウェルあたり15000細胞を24時間培養した。引き続いて種々の濃度のHUやIFNαあるいは両剤を加えさらに72時間培養した。各ウェル中の細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、市販のルシフェラーゼ活性測定キット(Renilla Luciferase Assay System (Promega社))を用い、添付の実験説明書に従って細胞を回収し、ルシフェラーゼの定量を行うことにより測定した。蛍光活性の測定にはMonolight 3010(BD Biosciences社）を用いた。
(1) 細胞培養と抗ウイルスアッセイ
OR6細胞は、２４ウェル中で培養した（培養液：5%牛胎児血清及びG418付加DMEM培地、温度37℃）。HUとインターフェロンα（以下、「IFNα」)の抗ウイルス効果をモニターするため、まず24ウェルプレートを用いて1ウェルあたり15000細胞を24時間培養した。引き続いて種々の濃度のHUやIFNαあるいは両剤を加えさらに72時間培養した。各ウェル中の細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、市販のルシフェラーゼ活性測定キット(Renilla Luciferase Assay System (Promega社))を用い、添付の実験説明書に従って細胞を回収し、ルシフェラーゼの定量を行うことにより測定した。蛍光活性の測定にはMonolight 3010(BD Biosciences社）を用いた。
(2) 被検化合物
純度98%以上のHU及びIFNαはシグマアルドリッチ社より購入した。
純度98%以上のHU及びIFNαはシグマアルドリッチ社より購入した。
(3) 細胞生存能
OR6細胞に対するHUの細胞毒性を検証するため、95mm培養皿にOR6細胞を400000個まき、0、50、100、150μmol/Lの濃度でHUを加え72時間培養した。トリパンブルー染色の後で生存している細胞数をヘマトサイトメーターにて測定した。
OR6細胞に対するHUの細胞毒性を検証するため、95mm培養皿にOR6細胞を400000個まき、0、50、100、150μmol/Lの濃度でHUを加え72時間培養した。トリパンブルー染色の後で生存している細胞数をヘマトサイトメーターにて測定した。
(4) トランスフェクション実験
特許文献１に従い脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来内部リボソーム侵入部位（IRES）によりレニラ蛍光をコードするプラスミドをIFNにより治癒したOR6細胞であるOR6c細胞にFuGENE6試薬(Roche Diagnostics社製）を用いてトランスフェクションし、24時間後に種々の濃度のHUを加え72時間培養した。
特許文献１に従い脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来内部リボソーム侵入部位（IRES）によりレニラ蛍光をコードするプラスミドをIFNにより治癒したOR6細胞であるOR6c細胞にFuGENE6試薬(Roche Diagnostics社製）を用いてトランスフェクションし、24時間後に種々の濃度のHUを加え72時間培養した。
２．結果
(1) HUは単独でHCV遺伝子複製抑制効果を示した
OR6細胞はHCV遺伝子複製をモニターする信頼できる実験系と考えられているため、HUが単独でHCV全長遺伝子の複製を抑制できるか検討した（図1A）。150μmol/LまでのHUを72時間投与して得られた用量依存曲線により、50%複製抑制濃度（無添加の場合の複製を50%抑制する濃度）は60μmol/Lとなった（図1B）。インターフェロンαの50%抑制濃度は1.2 IU/mlとなった。コントロールプラスミドpEMCV-RLをトランスフェクションした治癒OR6c細胞を用いて、HUはレニラ蛍光自身を発光抑制しないことを確認した（図2）。これらの結果より、HUは独立してHCV遺伝子複製を抑制できることが明らかになった。
(1) HUは単独でHCV遺伝子複製抑制効果を示した
OR6細胞はHCV遺伝子複製をモニターする信頼できる実験系と考えられているため、HUが単独でHCV全長遺伝子の複製を抑制できるか検討した（図1A）。150μmol/LまでのHUを72時間投与して得られた用量依存曲線により、50%複製抑制濃度（無添加の場合の複製を50%抑制する濃度）は60μmol/Lとなった（図1B）。インターフェロンαの50%抑制濃度は1.2 IU/mlとなった。コントロールプラスミドpEMCV-RLをトランスフェクションした治癒OR6c細胞を用いて、HUはレニラ蛍光自身を発光抑制しないことを確認した（図2）。これらの結果より、HUは独立してHCV遺伝子複製を抑制できることが明らかになった。
(2) HUの抗HCV活性は細胞毒性のせいではない
HCVレプリコンの複製は宿主細胞の増殖に依存するという報告があるため、HUのHCV遺伝子複製抑制効果が細胞毒性効果のため生じている可能性がある。この可能性を除外するため、OR6細胞に対するHUの細胞毒性効果を検証した。その結果、100μmol/LまでのHUで処理した細胞では未処理の細胞と比較して生存細胞数に明らかな差は認められなかった（図3）。
HCVレプリコンの複製は宿主細胞の増殖に依存するという報告があるため、HUのHCV遺伝子複製抑制効果が細胞毒性効果のため生じている可能性がある。この可能性を除外するため、OR6細胞に対するHUの細胞毒性効果を検証した。その結果、100μmol/LまでのHUで処理した細胞では未処理の細胞と比較して生存細胞数に明らかな差は認められなかった（図3）。
(3) HUとインターフェロンαの併用は効果的にHCV遺伝子複製を抑制した
続いてHCV全長遺伝子複製におけるインターフェロンαとHUの併用による抑制効果を検討した。HUを0、24、48マイクロモルに固定した時のインターフェロンαの用量依存曲線が得られた。曲線はHUを加えることにより左にシフトしており(図4A)、HU併用はインターフェロン単独より効果的であることが示された。アイソボログラム解析により両剤併用による相乗的な抗HCV効果が証明された（図4B。図4B中の破線が相乗効果がない場合（相加効果）のラインであり、実測値がそれよりも左下側にあることは、IFNα単独投与よりもHUとの併用の方が抗HCV効果が高まること、すなわち、相乗効果があることを示す）。これらの結果よりHUはインターフェロンαと併用して使用できる抗HCV剤となり得ることが明らかになった。
続いてHCV全長遺伝子複製におけるインターフェロンαとHUの併用による抑制効果を検討した。HUを0、24、48マイクロモルに固定した時のインターフェロンαの用量依存曲線が得られた。曲線はHUを加えることにより左にシフトしており(図4A)、HU併用はインターフェロン単独より効果的であることが示された。アイソボログラム解析により両剤併用による相乗的な抗HCV効果が証明された（図4B。図4B中の破線が相乗効果がない場合（相加効果）のラインであり、実測値がそれよりも左下側にあることは、IFNα単独投与よりもHUとの併用の方が抗HCV効果が高まること、すなわち、相乗効果があることを示す）。これらの結果よりHUはインターフェロンαと併用して使用できる抗HCV剤となり得ることが明らかになった。
実施例２ 臨床試験
インフォームドコンセントを施した12名の難治性Ｃ型肝炎患者（serogroup 1 高ウイルス量）に対してハイドロキシウレア（商品名ハイドレアカプセル）1500mg/日の経口投与を4週間行った。投与開始前から治療終了時まで１週間毎に血清中HCV RNA量(log IU/ml)を常法である、TaqMan（商品名）プローブを用いたリアルタイム検出ＰＣＲ法により測定した。
インフォームドコンセントを施した12名の難治性Ｃ型肝炎患者（serogroup 1 高ウイルス量）に対してハイドロキシウレア（商品名ハイドレアカプセル）1500mg/日の経口投与を4週間行った。投与開始前から治療終了時まで１週間毎に血清中HCV RNA量(log IU/ml)を常法である、TaqMan（商品名）プローブを用いたリアルタイム検出ＰＣＲ法により測定した。
その結果、投与中12名中9名（75%）でウイルス量(HCV RNA)の減少を認めた。ウイルス減少は最大で0.37Log、平均で0.22Log認められた。
本発明により、Ｃ型肝炎の治療に有効な新規なＣ型肝炎治療剤が提供された。本発明の治療剤は、難治性慢性のＣ型肝炎の治療にも有用であり、Ｃ型肝炎の治療に貢献するものである。
Claims (3)
- ハイドロキシウレアを有効成分として含有するＣ型肝炎治療剤。
- インターフェロンαをさらに含む請求項１記載の治療剤。
- ハイドロキシウレアのＣ型肝炎治療剤製造のための使用。
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